汪鵬　蔡躍　陳韋韋　馬婧　陳新剛　唐小潔　尤小滿　孔飛　張杰　燕海剛　汪國(guó)湘

江玲　張文偉*　萬(wàn)建民

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/長(zhǎng)江流域雜交水稻協(xié)同創(chuàng)新中心/農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)江中下游粳稻生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南京210095； *通訊聯(lián)系人，E-mail:zhangww@njau.edu.cn)

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水稻小粒矮稈突變體sgd1(t)的表型分析及基因克隆

汪鵬蔡躍陳韋韋馬婧陳新剛唐小潔尤小滿孔飛張杰燕海剛汪國(guó)湘

江玲張文偉*萬(wàn)建民

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/長(zhǎng)江流域雜交水稻協(xié)同創(chuàng)新中心/農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)江中下游粳稻生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南京210095；*通訊聯(lián)系人，E-mail:zhangww@njau.edu.cn)

汪鵬， 蔡躍， 陳韋韋，等. 水稻小粒矮稈突變體sgd1(t) 的表型分析及基因克隆. 中國(guó)水稻科學(xué)， 2016， 30(1)： 1-9.

摘要:在日本晴T-DNA突變體庫(kù)中篩選得到小粒矮稈突變體sgd1(t) ，經(jīng)多代自交穩(wěn)定遺傳。sgd1(t) 出現(xiàn)植株矮化、粒型圓小、葉色深綠和穎殼厚實(shí)等表型。莖稈及穎殼細(xì)胞掃描電鏡結(jié)果表明，sgd1(t) 莖稈細(xì)胞不能形成正常細(xì)胞列、維管束發(fā)育異常；穎殼表皮細(xì)胞排列緊密但不規(guī)則；GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑響應(yīng)正常。遺傳分析表明突變體sgd1(t) 的矮稈性狀受一對(duì)隱性核基因控制。采用圖位克隆方法，將sgd1(t) 定位于第9染色體短臂Indel標(biāo)記DF13和DF26之間，物理距離約為230 kb。該區(qū)間存在已克隆的矮稈基因BC12/GDD1。測(cè)序結(jié)果顯示，sgd1(t) 在該基因第4個(gè)外顯子發(fā)生由G到T的單堿基突變，導(dǎo)致第186位保守氨基酸由甘氨酸突變?yōu)槔i氨酸。

關(guān)鍵詞:水稻; 小粒矮稈; 基因克隆; BC12/GDD1 ; 單堿基突變

株高是水稻株型建成重要的農(nóng)藝性狀之一，直接影響水稻品種的生產(chǎn)潛力和抗倒伏性。20世紀(jì)60年代，綠色革命基因的成功應(yīng)用，使水稻單產(chǎn)提高了20%～30%[1]，之后雜種優(yōu)勢(shì)的利用和超級(jí)稻育種的興起，都建立在矮化育種的成果之上。由此可見，株型改良一直以來(lái)都是水稻育種工作的主線之一。

目前，已定位的株高基因達(dá)到132個(gè)，涉及水稻的全部染色體，其中，已克隆的株高基因達(dá)到21個(gè)(http://www.shigen.nig.ac.jp/rice/oryzabase; http://www.ricedata.cn)。大多數(shù)株高基因與植物激素相關(guān)，包括赤霉素(Gibberellins, GA)相關(guān)基因，如sd1、d35、slr1、gid2[2-5]，油菜素內(nèi)酯(Brassinosteroids, BR)相關(guān)基因，如d2、d61[6-8]，以及獨(dú)腳金內(nèi)酯(Strigolactones, SL)相關(guān)基因，如d10、d14等[9-11]。其中，GA合成途徑相關(guān)基因SD1編碼GA20氧化酶，催化GA53形成GA20。在sd1突變體中，GA合成前體物質(zhì)GA53含量顯著升高導(dǎo)致有活性的GA20和GA1減少，植株變矮。D35編碼GA合成初始階段的內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶(OsKO2)，OsKO2是催化貝殼杉烯向貝殼杉酸轉(zhuǎn)化過(guò)程的關(guān)鍵酶之一，該基因突變使得GA合成受阻，導(dǎo)致半矮化表型。此外，高稈基因slr1和矮稈基因gid2均為GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因。SLR1編碼一個(gè)包含DELLA結(jié)構(gòu)域的蛋白，是GA信號(hào)的抑制子；GID2編碼GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的一個(gè)正向調(diào)控因子，GID2是SCFGID2復(fù)合體的一部分，該復(fù)合體能與磷酸化的SLR1結(jié)合，引起泛素化介導(dǎo)的SLR1蛋白的降解，使GA信號(hào)向下游傳遞[12-13]。因此，深入研究GA相關(guān)的株高突變體是一項(xiàng)非常重要的工作。

目前育種上利用的矮化基因主要是sd1及其等位基因，這種單一的遺傳背景已經(jīng)成為水稻新品種選育的瓶頸[14]。因此，挖掘和鑒定新的矮化基因，開展株高相關(guān)基因的定位、克隆和功能研究，闡明其遺傳、分子及生理生化機(jī)制，對(duì)水稻育種和生產(chǎn)具有十分重要的指導(dǎo)意義。在本研究中，我們從日本晴(Nipponbare)T-DNA突變體庫(kù)中篩選得到一個(gè)小粒矮稈突變體sgd1(t)[15],并對(duì)sgd1(t) 進(jìn)行表型分析及基因定位，結(jié)合細(xì)胞學(xué)觀察和激素響應(yīng)，擬初步揭示引起sgd1(t) 矮化表型的遺傳和分子機(jī)理。

1材料與方法

1.1材料

小粒矮稈突變體sgd1(t) 是在日本晴(Nipponbare)T-DNA突變體庫(kù)中篩選得到的，經(jīng)潮霉素檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)并不具備潮霉素抗性基因的表型，因此sgd1(t) 應(yīng)是在組培過(guò)程中發(fā)生的變異，同時(shí)sgd1(t) 經(jīng)江蘇南京和海南三亞多代自交繁殖，其突變特征及各方面農(nóng)藝性狀均已穩(wěn)定。

1.2遺傳分析及定位群體的構(gòu)建

2011年8月，在南京實(shí)驗(yàn)基地將sgd1(t) 與Pusher、NJ-11、Dular配制3個(gè)雜交組合用于定位，同時(shí)配制sgd1(t) /日本晴和日本晴/sgd1(t) 正反交組合用于遺傳分析，按單株收獲F1種子，經(jīng)海南南繁獲得F2種子。2012年7月，在南京土橋?qū)嶒?yàn)基地單株種植各親本和F2群體；在成熟期，對(duì)F2群體中株高正常的植株和矮稈植株，進(jìn)行株數(shù)調(diào)查統(tǒng)計(jì)用于遺傳分析。選用后代高矮分離相對(duì)明顯的sgd1(t) /Dular的F2群體用于定位，鑒定并選取其中具有小粒矮化表型的約2500個(gè)極端單株用于初定位及精細(xì)定位，同時(shí)篩選群體中分子標(biāo)記為雜合型的單株，最終按單株收取極端單株及雜合型單株的種子。

1.3農(nóng)藝性狀調(diào)查

抽穗期以播種至抽穗的天數(shù)來(lái)表示。在水稻抽穗期考查小粒矮稈突變體sgd1(t)和野生型日本晴的多項(xiàng)重要形態(tài)指標(biāo)，包括株高、單株分蘗數(shù)、穗長(zhǎng)、每穗粒數(shù)、粒長(zhǎng)、粒寬、粒厚、千粒重、節(jié)間長(zhǎng)度等。

1.4莖稈、穎殼的細(xì)胞學(xué)掃描電鏡觀察

分別取成熟期sgd1(t) 和日本晴的最上節(jié)間和種子；FAA固定液固定樣品2 h以上，70%、80%、90%、100%乙醇梯度脫水，每級(jí)5 min，脫水劑體積高于材料的3倍；置于烘箱，臨界點(diǎn)干燥；將樣品用導(dǎo)電膠固定于銅臺(tái)上，并將樣品調(diào)整至適合觀察的位置；樣品噴金，掃描電鏡觀察。

1.5GA處理實(shí)驗(yàn)

采用何祖華等[16]的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，略作改動(dòng)。

1)將sgd1(t) 和日本晴種子用1%的次氯酸鈉溶液浸種1 h，用無(wú)菌水清洗3次，然后將種子浸入水中24 h，黑暗條件下置于30℃培養(yǎng)箱生長(zhǎng)1 d；

2)當(dāng)種子露白時(shí)，挑選發(fā)芽一致的種子轉(zhuǎn)移至含有梯度濃度的GA3溶液的1%瓊脂培養(yǎng)基上，置于14 h光照/10 h黑暗、25℃的培養(yǎng)箱生長(zhǎng)，并開始計(jì)時(shí)；

3)10 d后，測(cè)其第2葉鞘伸長(zhǎng)長(zhǎng)度。同時(shí)設(shè)置清水對(duì)照，每個(gè)梯度實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.6色素含量的測(cè)定

sgd1(t) 和日本晴植株在抽穗后至成熟前，植株葉片顏色差異顯著。隨機(jī)取5片葉片，剪成長(zhǎng)寬1 cm(0.02 g左右)片段后，稱其實(shí)際重量，將其浸泡于5 mL的95%的乙醇溶液中，在室溫黑暗條件下浸泡48 h。用分光光度計(jì)測(cè)量665 nm、649 nm和470 nm三個(gè)波長(zhǎng)下溶液的光密度。根據(jù)Lichtenthaler等[17]對(duì)Arnon法進(jìn)行修正后提出的計(jì)算公式：

Ca=13.95D665-6.88D649；

Cb=24.96D649-7.32D665；

Cx=(1000D470-2.05Ca-114Cb)/245。

求得各色素的濃度后，再依據(jù)：細(xì)胞色素含量(mg·g-1)=(葉綠素的濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù))/樣品鮮重，計(jì)算組織中各細(xì)胞色素的含量。sgd1(t) 和日本晴分別取3個(gè)植株進(jìn)行測(cè)定。

1.7基因定位

利用已發(fā)表的分布于水稻12條染色體上的SSR序列，采用極端個(gè)體分組和隱性基因組分析法，取sgd1(t) /Pusher F2群體中10株極端個(gè)體構(gòu)建兩個(gè)隱性池，利用全基因組中在sgd1(t) 和Pusher間存在多態(tài)的標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析，找到與sgd1(t) 基因連鎖的分子標(biāo)記。根據(jù)基因初步的定位結(jié)果，在目標(biāo)基因附近區(qū)域的BAC序列上繼續(xù)設(shè)計(jì)分子標(biāo)記，同時(shí)擴(kuò)大定位群體對(duì)基因進(jìn)行精細(xì)定位；并利用已公布的日本晴數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列信息，找到各標(biāo)記所對(duì)應(yīng)的BAC克隆，構(gòu)建覆蓋目的基因的物理圖譜。

SSR標(biāo)記的開發(fā)：利用日本水稻基因組研究計(jì)劃(http：//rgp.dna.affrc.go.jp/IRGSP/index.html)下載粳稻日本晴的第9染色體的BAC/PAC序列；將400～500 bp長(zhǎng)的序列在NCBI上(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Genome/plantBlast.shtml)與相應(yīng)的93-11序列進(jìn)行比對(duì)，如果兩者的SSR重復(fù)次數(shù)有差異，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)合成SSR引物。

Indel標(biāo)記的開發(fā)：利用NCBI的BLAST程序?qū)⑾鄳?yīng)區(qū)段粳稻日本晴基因組的克隆序列與秈稻93-11基因組的克隆序列進(jìn)行比對(duì)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，據(jù)此發(fā)現(xiàn)插入/缺失(insertion/deletion，InDel)序列差異(選擇標(biāo)準(zhǔn)：100～200 bp之間大小的片段有3 bp以上的差異)。然后利用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件在其兩側(cè)設(shè)計(jì)引物。研究設(shè)計(jì)并用于精細(xì)定位的多態(tài)性SSR及InDel引物見表2。

2結(jié)果與分析

2.1突變體sgd1(t) 表型分析

由圖1-A和表1可以看出，突變體sgd1(t) 表現(xiàn)出明顯的矮化，其中野生型日本晴的株高為106.79±9.90 cm，而sgd1(t) 的株高為36.64±3.01 cm，只有野生型的31.82%。sgd1(t) 植株5個(gè)節(jié)間和日本晴相比，都明顯縮短，但縮短比例各不相同，倒1、2、3、4、5節(jié)間分別為野生型的32.1%、43.0%、44.4%、69.9%和50.0%(圖1-C，D)。除了植株矮化外，sgd1(t) 還表現(xiàn)出多分蘗的特征(圖1-A,表1)，抽穗期延遲了10 d左右。此外，sgd1(t) 穎殼表皮粗糙、厚實(shí)，粒長(zhǎng)、粒寬、粒厚、千粒重及每穗粒數(shù)均顯著下降(表1)。

sgd1(t) 的葉片深綠，葉綠素含量測(cè)定表明，Chl a/b比值與野生型相比沒有明顯差異，但sgd1(t) 的色素含量明顯高于野生型(圖2)。

2.2sgd1(t) 莖稈及穎殼切面細(xì)胞學(xué)形態(tài)觀察

將莖稈進(jìn)行縱切后觀察，日本晴節(jié)間分生區(qū)細(xì)胞呈規(guī)則的長(zhǎng)方形，排列整齊，形成縱向細(xì)胞列(圖3-A)；sgd1(t)植株中，未伸長(zhǎng)莖節(jié)的細(xì)胞呈方形甚至圓形，排列散亂，不能形成正常細(xì)胞列，在縱向上不能正常伸長(zhǎng)(圖3-B)。表明sgd1(t)節(jié)間細(xì)胞不伸長(zhǎng)是其節(jié)間未伸長(zhǎng)的主要原因。

從外向內(nèi)，日本晴的橫切面由厚壁細(xì)胞、維管束及薄壁細(xì)胞組成；維管束整齊均勻地分布在薄壁細(xì)胞之間(圖3-C，E)。而在sgd1(t) 植株中，莖稈的橫切面結(jié)構(gòu)顯示，莖稈的薄壁細(xì)胞較野生型小，且發(fā)育不成熟，但細(xì)胞層數(shù)有所增加。sgd1(t) 莖稈的維管束發(fā)育不正常，未能形成正常的中空結(jié)構(gòu)，且散亂地分布在薄壁細(xì)胞之間。這說(shuō)明sgd1(t) 莖稈維管束的發(fā)育受到了影響(圖3-D，F(xiàn))。

表1日本晴和sgd1(t) 的主要農(nóng)藝性狀比較

Table 1. Comparison of agronomic traits between Nipponbare and sgd1(t) .

農(nóng)藝性狀A(yù)gronomictraits日本晴Nipponbaresgd1(t)株高Plantheight/cm106.79±9.9036.64±3.01**單株分蘗數(shù)Tillernumberperplant19.6±3.4422.0±4.96**粒長(zhǎng)Grainlength/mm 7.81±0.385.42±0.30**粒寬Grainwidth/mm 3.21±0.152.37±0.45**粒厚Grainthickness/mm 2.17±0.111.13±0.25**千粒重1000-grainweight/g25.58±1.3418.21±1.51**每穗粒數(shù)No.ofgrainsperpanicle114.50±20.1730.62±6.10**

數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (n=10)；**表示經(jīng)t-測(cè)驗(yàn)在 0.01 水平上差異顯著。

Data are the mean±SD(n=10)；**, Significant atP<0.01 byt-test.

A-日本晴和sgd1(t) 在成熟期植株形態(tài)比較,標(biāo)尺30 cm； B-日本晴和sgd1(t) 稻谷及糙米表型(n=5)，標(biāo)尺5 mm； C,D-穗及各節(jié)間長(zhǎng)度模型。 P,Ⅰ,Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ分別代表稻穗，倒1、2、3、4、5節(jié)間(n=10)。

A, Gross morphology of Nipponbare andsgd1(t) at the mature stage, bar=30 cm; B, Morphology of seed and brown rice of Nipponbare andsgd1(t) (n=5),bar=5 mm; C and D, Diagram of the length of the panicles and internodes (n=10). P,Ⅰ,Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ indicate the panicle and the five upper internodes, respectively.

圖1日本晴和sgd1(t) 性狀比較

Fig. 1. Morphological characterization of Nipponbare and sgd1(t).

通過(guò)電鏡掃描可以觀察到，日本晴穎殼表皮細(xì)胞呈圓形、排列整齊、細(xì)胞間隙均勻有規(guī)律，而突變體sgd1(t) 表皮細(xì)胞排列緊密、呈不規(guī)則狀、細(xì)胞形狀發(fā)生改變，導(dǎo)致整體細(xì)胞呈現(xiàn)小突起狀(圖4-A，B)；同時(shí)對(duì)穎殼中部進(jìn)行橫切面掃描，結(jié)果顯示日本晴橫切面細(xì)胞能夠均衡地分布在表皮細(xì)胞之下，而突變體sgd1(t)橫切面細(xì)胞不規(guī)則，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，有大有小，從而導(dǎo)致細(xì)胞間填充物散亂(圖4-C，D)。

2.3sgd1(t) 對(duì)GA的敏感性

根據(jù)對(duì)外源GA的反應(yīng)，與GA相關(guān)的矮化突變可分為GA缺陷型突變和GA鈍感型突變[18]，GA缺陷型突變指GA代謝途徑受阻導(dǎo)致內(nèi)源GA含量降低甚至缺乏[19]，外施GA能恢復(fù)野生型表型；GA鈍感型突變指由于GA信號(hào)傳導(dǎo)受阻導(dǎo)致對(duì)GA響應(yīng)的改變[20]，外施GA不能恢復(fù)到野生型表型。由圖5可以看出，不同濃度GA3處理野生型和sgd1(t)發(fā)現(xiàn)，兩者第2葉鞘都明顯伸長(zhǎng)，說(shuō)明sgd1(t) 對(duì)GA敏感，低濃度能使其恢復(fù)部分表型；GA3濃度為10-4mol/L，sgd1(t) 基本上能和野生型達(dá)到同一高度，證實(shí)了sgd1(t) 的GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑正常，外施GA能夠得到響應(yīng)(圖 5)。

A-葉片顏色；B-色素含量水平(n=3)。 Chl a-葉綠素a； Chl b-葉綠素b； β-carotenoids-類胡蘿卜素； Chl a/b-葉綠素a與葉綠素b的比值； Chl a+b-葉綠素a與葉綠素b之和。

A， Leave color; B， Pigment contents (n=3). Chl a， Chlorophyl a; Chl b， Chlorophyl b; Chl a/b， Ratio of chlorophyl a to chlorophyl b; Chl a+b， Sum of chlorophyl a and chlorophyl b.

圖2日本晴和sgd1(t) 的葉片

Fig. 2. Leaves of Nipponbare and sgd1(t).

A、B莖稈縱切面，標(biāo)尺100 μm； C、D 莖稈橫切面，標(biāo)尺1mm； E、F為C、D方框區(qū)域放大圖，標(biāo)尺100 μm; SC， 厚壁細(xì)胞； VB，維管束； PC， 薄壁細(xì)胞。

A and B， Longitudinal sections, bar=100 μm; C and D， Transverse sections, bar=1 mm; E and F， Magnifications of indicated regions in C and D, bar=100 μm. SC, Sclerenchyma cells; VB, Vascular bundle; PC, Parenchyma cells.

圖3日本晴和sgd1(t)的莖稈切面電鏡掃描

Fig. 3. Electronic microscopy analysis of culm cells of Nipponbare and sgd1(t).

A，B分別為野生型和突變體的穎殼表皮細(xì)胞,標(biāo)尺200 μm； C，D分別為野生型和突變體中部穎殼橫切面細(xì)胞，標(biāo)尺50 μm。

A and B， Epidermis cells, bar=200 μm; C and D，Transverse sections, bar=50 μm.

圖4日本晴和sgd1(t) 的穎殼電鏡掃描

Fig. 4. Electronic microscopy analysis of the glume cells of Nipponbare and sgd1(t).

2.4 sgd1(t) 的遺傳分析

2.5 sgd1(t) 基因的定位

利用sgd1(t) /Dular F2群體56個(gè)極端單株進(jìn)行連鎖分析，將其中的10個(gè)等量提取DNA構(gòu)成混池，發(fā)現(xiàn)在第9染色體上SSR標(biāo)記RM444和RM524與矮稈基因連鎖，在此位置附近用其他引物對(duì)F2群體極端個(gè)體進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)Indel標(biāo)記D28和BC3也與矮稈基因連鎖，初步將基因定位在Indel標(biāo)記C3和SSR標(biāo)記RM219之間，遺傳距離為20.7 cM。

在初定位的基礎(chǔ)上開發(fā)標(biāo)記，最終將矮稈基因定位在第9染色體短臂末端Indel標(biāo)記DF26和DF13之間，物理距離為230 kb(圖7-A,表2)。使用Rice Genome Annotation Project網(wǎng)站(http：//rice.plantbiology.msu.edu/)預(yù)測(cè)該定位區(qū)間內(nèi)的基因，在該區(qū)段內(nèi)有一個(gè)已報(bào)道的矮稈基因GDD1(LOC_Os09g02650)[21]。GDD1是一種具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的驅(qū)動(dòng)蛋白，可以通過(guò)調(diào)控水稻中GA的合成來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的伸長(zhǎng)，與之前報(bào)道的脆稈基因BC12[22]等位。鑒于此，將BC12/GDD1確定為候選基因。使用DNAStar軟件將測(cè)序結(jié)果與從NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)查到的BC12/GDD1的基因序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)突變體的BC12/GDD1基因在第4個(gè)外顯子發(fā)生單堿基突變，由G變?yōu)門(圖7-B)，導(dǎo)致第186位甘氨酸突變?yōu)槔i氨酸。

圖 5GA3處理野生型和sgd1(t) 的幼苗表型(A)及第2葉鞘長(zhǎng)度(B)(n=3)

Fig. 5. Seeding phenotype(A) and length of second leaf sheath(B) with GA3treatment between wild type and sgd1(t) (n=3).

圖 6sgd1(t) 與Dular雜交F2群體株高分離頻率

Fig. 6. Distribution of plant height in F2population derived from sgd1(t) /Dular.

3討論

根據(jù)水稻前4到5個(gè)節(jié)間的伸長(zhǎng)模式將矮化突變體分為五種，即“dn”穗及以下節(jié)間均縮短、“dm”倒1節(jié)縮短、“d6”穗頸節(jié)以下節(jié)間縮短、“nl”上部節(jié)間比下部節(jié)間顯著縮短和“sh”穗頸節(jié)縮短[23]。相對(duì)于野生型，sgd1(t) 穗及各節(jié)間均有不同程度的縮短，因此屬于“dn”型。

通過(guò)圖位克隆方法將突變基因sgd1(t) 定位到水稻第9染色體Indel標(biāo)記DF26和DF13之間約230 kb區(qū)域。Zhang等[21]和Li等[22]在該區(qū)域克隆了矮稈基因BC12/GDD1，該基因編碼一個(gè)kinesin-4亞家族的驅(qū)動(dòng)蛋白，參與調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程、纖維素微絲的排布及細(xì)胞壁的組成，通過(guò)調(diào)控GA生物合成途徑來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞伸長(zhǎng)。表型比較發(fā)現(xiàn)，BC12/GDD1突變體bc12、gdd1與sgd1(t) 在植株表型上相似度很高，都表現(xiàn)為株高降低，穗及各節(jié)間長(zhǎng)度顯著縮短。測(cè)序結(jié)果顯示，sgd1(t) 在該基因第4個(gè)外顯子處發(fā)生單堿基突變，導(dǎo)致保守氨基酸的改變。由此，我們推定sgd1(t) 編碼基因與BC12/GDD1等位。

對(duì)比基因突變位點(diǎn)可以發(fā)現(xiàn)，bc12在基因第4個(gè)外顯子處發(fā)生26 bp的缺失，引起移碼突變；gdd1在基因第19和20個(gè)外顯子之間發(fā)生27 bp缺失，阻斷mRNA的剪切，而sgd1(t) 在該基因第4個(gè)外顯子處發(fā)生單堿基由G到T的突變，使甘氨酸突變?yōu)槔i氨酸。因此，sgd1(t) 與bc12及gdd1在突變位點(diǎn)及方式上存在差異。kinesin-4亞家族蛋白含有三個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域：N端驅(qū)動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)域、螺旋卷曲結(jié)構(gòu)域和C端球形結(jié)構(gòu)域[24]。在BC12/GDD1中也存在一個(gè)基于微管且依賴ATP酶的驅(qū)動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)域，包含第1到405個(gè)氨基酸，其中第186位甘氨酸在動(dòng)植物中高度保守(圖7-C)。但在sgd1(t) 中，第186位甘氨酸突變?yōu)槔i氨酸，可能影響了這個(gè)驅(qū)動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象，從而不利于該蛋白對(duì)微管的結(jié)合及移動(dòng)，進(jìn)而導(dǎo)致微管排布異常，纖維素微絲異常沉積，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變。這與AtKRP125c突變引起皮層微管組織混亂和細(xì)胞形狀異常的情況類似[25]。但sgd1(t) 僅僅是單堿基替換，突變基因仍具有部分功能，因此可能未產(chǎn)生類似bc12/gdd1的脆稈表型。

表 2用于精細(xì)定位的多態(tài)性Indel引物

Table 2. Indel markers designed for fine-mapping.

標(biāo)記Marker正向引物序列(5'-3')Sequenceofforwardprimer(5'-3')反向引物序列(5'-3')Sequenceofreverseprimer(5'-3')D28CATATCAACTAGCCCTACCGGTCCATTATTGGCGTCCCDF16CAGATGGAGGTTACTCTGCTTCGTAGTCAATGTGCCACCAGTAGGGDF26ATGGAATTAACCGTGGCTGCTTTGGCCTCCATCAGDF13TATTGCACCTGCCTATTCGTTGATGCCACCATCCTCTTDF12TCTCATAAGCCCAAATCGTTAGTAGTCGTCGGCGTCATDF15ATCAGGGCATTCACCTCCGTAGCACCCCACAGCTCAAABC3TGATAGTGCAACGGCAAGGGTGGAGTTGTCAGCAGTGG

A-sgd1(t) 的物理圖譜； B-sgd1(t) 的突變位點(diǎn)； C-BC12/GDD1蛋白同源序列比對(duì)。

A, Physical mapping ofsgd1(t); B, Mutation site ofsgd1(t); C, Comparison of amino acid sequences of BC12/GDD1.

圖 7sgd1(t) 的圖位克隆

Fig. 7. Map-based cloning of sgd1(t).

目前，克隆的水稻矮稈基因大多數(shù)來(lái)自粳稻，但這些矮稈材料農(nóng)藝性狀較差，難以在育種中直接利用，而一些矮稈的弱等位基因突變體不良性狀相對(duì)緩和，在株型塑造上存在應(yīng)用價(jià)值。本研究鑒定的小粒矮稈突變體sgd1(t) 是已報(bào)道的矮稈基因BC12/GDD1的復(fù)等位基因，株高降低，但莖稈機(jī)械強(qiáng)度沒有下降。因此，這對(duì)于培育高產(chǎn)、抗倒伏的水稻品種具有積極的意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]Peng J，Richards D E，Hartley N M，et al. ‘Green revolution’genes encode mutant gibberellin response modulators.Nature. 1999，400(6741)：256-261.

[2]Itoh H，Ueguchi-Tanaka M，Sentoku N，et al. Cloning and functional analysis of two gibberellin 3 beta -hydroxylase genes that are differently expressed during the growth of rice.ProcNatlAcadSciUSA, 2001，98(15)：8909-8914.

[3]Ueguchi-Tanaka M，Ashikari M，Nakajima M，et al.GIBBERELLININSENSITIVEDWARF1 encodes a soluble receptor for gibberellin.Nature, 2005，437(7059)：693-698.

[4]Sasaki A，Ashikari M，Ueguchi-Tanaka M，et al. Green revolution：A mutant gibberellin-synthesis gene in rice.Nature, 2002，416(6882)：701-702.

[5]Gomi K，Sasaki A，Itoh H，et al. GID2，an F-box subunit of the SCF E3 complex，specifically interacts with phosphorylated SLR1 protein and regulates the gibberellin-dependent degradation of SLR1 in rice.PlantJ, 2004， 37(4)：626-634.

[6]Yamamuro C，Ihara Y，Wu X，et al. Loss of function of a rice brassinosteroid insensitive1 homolog prevents internode elongation and bending of the lamina joint.PlantCell, 2000，12(9)：1591-1606.

[7]Hong Z，Ueguchi-Tanaka M，Umemura K，et al. A rice brassinosteroid-deficient mutant，ebisudwarf(d2)， is caused by a loss of function of a new member of cytochrome P450.PlantCell, 2003，15(12)：2900-2910.

[8]Li H，Jiang L，Youn J H，et al. A comprehensive genetic study reveals a crucial role of CYP90D2/D2 in regulating plant architecture in rice (Oryzasativa).NewPhytol, 2013，200(4)：1076-1088.

[9]Arite T，Iwata H，Ohshima K，et al. DWARF10，an RMS1/MAX4/DAD1 ortholog，controls lateral bud outgrowth in rice.PlantJ, 2007，51(6)：1019-1029.

[10]Arite T，Umehara M，Ishikawa S，et al.d14， a strigolactone-insensitive mutant of rice，shows an accelerated outgrowth of tillers.PlantCellPhysiol, 2009，50(8)：1416-1424.

[11]Zhou F，Lin Q，Zhu L，et al. D14-SCFD3-dependent degradation of D53 regulates strigolactone signalling.Nature, 2013，504(7480)：406-410.

[12]Sasaki A，Itoh H，Gomi K，et al. Accumulation of phosphorylated repressor for gibberellin signaling in an F-box mutant.Science, 2003，299(5614)：1896-1898.

[13]Hirano K，Asano K，Tsuji H，et al. Characterization of the molecular mechanism underlying gibberellin perception complex formation in rice.PlantCell, 2010，22(8)：2680-2696.

[14]黃耀祥. 半矮稈、早長(zhǎng)根深、超高產(chǎn)、特優(yōu)質(zhì)中國(guó)超級(jí)稻生態(tài)育種工程. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2001，3(3)： 2-6.

Huang Y X. Ecological breeding engineering for maximum yield，super high quality of China super-rice with semi-dwarf and early growth and deep root.GuangdongAgricSci, 2001, 3(3)：2-6. (in Chinese with English abstract)

[15]陳韋韋. 水稻小粒矮稈突變體sgd1(t)的表型分析及基因精細(xì)定位. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

Chen W W. Phenotype analysis and gene fine mapping ofsgd1(t)，a small-grain dwarfness mutant in rice (OryzaSativaL.). Nanjing: Nanjing Agricultural University，2011. (in Chinese with English abstract)

[16]何祖華，Etohkossi，石春海，等. 水稻株高基因?qū)A3敏感性及與酶的關(guān)系. 中國(guó)水稻科學(xué). 1993，7(3)： 143-147.

He Z H，Etohkossi，Shi C H，et al. Sensitivity of plant height genes to GA3and their relationship with enzymes in rice.ChinJRiceSci，1993，7(3)：189-196. (in Chinese with English abstract)

[17]Lichtenthaler H K. Chlorophylls and carotenoids：Pigments of photosynthetic biomembranes.MethodsEnzymol，Academic Press，1987，350-382.

[18]Mitsunaga S， Tashiro T， Yamaguchi J. Identification and characterization of gibberellin-insensitive mutants selected from among dwarf mutants of rice.TheorApplGenet, 1994，87(6)：705-712.

[19]Hedden P， Phillips A L. Gibberellin metabolism：New insights revealed by the genes.TrendsPlantSci, 2000，5(12)：523-530.

[20]Gomi K，Matsuoka M. Gibberellin signalling pathway.CurrOpinPlantBio, 2003，6(5)：489-493.

[21]Li J，Jiang J，Qian Q，et al. Mutation of rice BC12/GDD1，which encodes a kinesin-like protein that binds to a GA biosynthesis gene promoter，leads to dwarfism with impaired cell elongation.PlantCell, 2011，23(2)： 628-640.

[22]Zhang M，Zhang B，Qian Q，et al. Brittle Culm 12，a dual-targeting kinesin-4 protein，controls cell-cycle progression and wall properties in rice.PlantJ, 2010，63(2)：312-328.

[23]馬良勇，包勁松，李西明，等. 水稻矮生基因的克隆和功能研究進(jìn)展. 中國(guó)水稻科學(xué), 2009，23(1)： 1-11.

Ma L Y，Bao J S，Li X M，et al. Progress on cloning and functional analysis of dwarfism related genes in rice.ChinJRiceSci， 2009，23(1)：1-11. (in Chinese with English abstract)

[24]Mazumdar M，Misteli T. Chromokinesins：Multitalented players in mitosis.TrendsCellBiol, 2005，15(7)： 349-355.

[25]Bannigan A，Scheible W，Lukowitz W，et al. A conserved role for kinesin-5 in plant mitosis.JCellSci, 2007， 120：2819-2827.

Phenotyping and Gene Cloning of a Small-grain Dwarf Mutantsgd1(t) in Rice

WANG Peng, CAI Yue, CHEN Wei-wei, MA Jing, CHEN Xin-gang, TANG Xiao-jie, YOU Xiao-man, KONG Fei, ZHANG Jie, YAN Hai-gang, WANG Guo-xiang, JIANG Ling, ZHANG Wen-wei*, WAN Jian-min

(StateKeyLaboratoryofCropGeneticsandGermplasmEnhancement,NanjingAgriculturalUniversity/TheYangtzeRiverValleyHybridRiceCollaborationInnovationCenter/KeyLaboratoryofBiology,GeneticsandBreedingofjaponicaRiceinMid-lowerYangtzeRiver,MinistryofAgriculture,Nanjing210095,China;*Corresponding author, E-mail: zhangww@njau.edu.cn)

WANG Peng, CAI Yue, CHEN Weiwei, et al. Phenotyping and gene cloning of a small-grain dwarf mutantsgd1(t) in rice. Chin J Rice Sci, 2016, 30(1): 1-9.

Abstract:A small-grain dwarf mutant, designated as sgd1(t) , was identified from the T-DNA insertion mutant lines of Nipponbare.The mutant，genetically stable，was characterized by dwarf plant, small grain, dark green leaves and thick husk. Scanning electron microscope analysis on cell morphology of stem and hull revealed that stem cells in sgd1(t) failed to form normal cell column and vascular bundles, while epidermal cells with irregular shape in hulls were tightly packed, resulting in confusion in cell arrangement, and sgd1(t) was a GA-sensitive dwarf mutant. Genetic analysis showed that this trait of dwarfism was controlled by a pair of recessive nuclear gene. Through map-based cloning, the gene sgd1 (t) was mapped in an interval of 230 kb between the markers DF13 and DF26 on the short arm of chromosome 9. There was a dwarf gene BC12/GDD1 in this region. Sequence analysis showed that sgd1(t) had a single-base substitution (G to T) in the fourth exon of the gene, resulting in the replacement of glycine by valine in 186th conservative amino acid.

Key words:rice (Oryza sativa L.); small grain and dwarfism; gene cloning; BC12/GDD1; single-base substitution

文章編號(hào):1001-7216(2016)01-0001-09

中圖分類號(hào):Q343.5； Q785

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

基金項(xiàng)目:國(guó)家科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目(2011BAD35B02-02)； 生物種業(yè)能力提升計(jì)劃資助項(xiàng)目([2012]1961)； 江蘇省自主創(chuàng)新課題資助項(xiàng)目[CX(12)1003]。

收稿日期:2015-01-29； 修改稿收到日期: 2015-05-09。