楊奕　孫一丁　馬繼瓊　王炎炎　許明輝

(云南省農(nóng)業(yè)科學院 生物技術與種質(zhì)資源研究所/ 云南省農(nóng)業(yè)生物技術重點實驗室/ 農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室， 昆明 650223; *通訊聯(lián)系人，E-mail：xuminhui@sohu.com)

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云南地方稻種抗稻瘟病基因Pi-d3序列變異分析

楊奕孫一丁馬繼瓊王炎炎許明輝*

(云南省農(nóng)業(yè)科學院 生物技術與種質(zhì)資源研究所/ 云南省農(nóng)業(yè)生物技術重點實驗室/ 農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室， 昆明 650223;*通訊聯(lián)系人，E-mail：xuminhui@sohu.com)

楊奕，孫一丁，馬繼瓊，等. 云南地方稻種抗稻瘟病基因Pi-d3序列變異分析. 中國水稻科學， 2016， 30(1)： 17-26.

摘要:對來自云南的80份地方稻種抗稻瘟病基因Pi-d3編碼區(qū)序列進行了PCR擴增并測序分析。結果表明，與地谷相比，80份云南地方稻種的Pi-d3編碼區(qū)序列(全長2775 bp)存在39個變異位點，平均變異率為1.41%。所有材料可以歸為37種單倍型，頻率較高的單倍型是H8(28.8%)、H4(11.3%)、H23(5.0%)，其他單倍型頻率較低，顯示了云南地方稻種Pi-d3基因變異豐富，單倍型類型多，但頻率較低。37種單倍型中存在28個氨基酸差異位點，共編碼33種蛋白，其中18種單倍型共計32份材料(包括12份秈稻品種)出現(xiàn)了假基因，假基因化的頻率較高，可能是粳稻Pi-d3假基因化向秈稻滲透。除已發(fā)現(xiàn)的737位氨基酸假基因位點外，新發(fā)現(xiàn)32和467兩個假基因位點。Pi-d3基因在秈稻、粳稻亞種，水稻、陸稻，黏稻、糯稻的單倍型類型及頻率兩方面均存在差異，表明亞種間或生態(tài)型間發(fā)生了一定的遺傳分化。37種單倍型在云南的地理分布呈大分散、小聚居的特點，普洱、版納、臨滄的單倍型種類最豐富，并以之為中心向外擴展，單倍型種類隨之減少。

關鍵詞:云南地方稻種； 稻瘟??； Pi-d3基因； 單核苷酸多態(tài)性

水稻是世界上重要的糧食作物，稻瘟病是由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae；無性態(tài)：Pyriculariaoryzae)引起的水稻真菌病害[1]，在世界各水稻種植區(qū)均有發(fā)生，可引起水稻大幅減產(chǎn)，甚至絕收，嚴重阻礙了水稻生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。稻瘟病抗性可分為垂直抗性和水平抗性兩種類型，垂直抗性由單個主效抗性基因控制，水平抗性則由微效多基因控制[2-4]。到目前為止，通過廣泛的遺傳分析，水稻中至少已鑒定和定位了86個抗稻瘟病基因(國家水稻數(shù)據(jù)中心)，這些基因大部分成簇地分布于水稻除第3染色體以外的其他11條染色體上[5]，其中，已有24個稻瘟病主效抗性基因被成功克隆[6-9]。

水稻抗稻瘟病基因Pi-d3由Shang等[10]在比較秈粳稻全基因組NBS-LRR基因等位間假基因化差異時，利用假基因化標記在分離的感病小群體內(nèi)克隆得到。Pi-d3基因位于水稻第6染色體上，屬于組成型表達基因，含有2775 bp的編碼區(qū)，編碼924個氨基酸，含有NBS-LRR結構域和MHD基序。由于Pi-d3抗性基因LRR序列中有一個堿基突變形成終止子，所以存在等位的假基因。

云南高原地形氣候復雜，位于中國與南亞兩個稻種起源中心之間，云南境內(nèi)海拔76～2700 m區(qū)域均有亞洲栽培稻地方品種分布，是世界上最大的稻種遺傳多樣性中心之一，基因多樣性大于中國其他地理群[11]。本研究對云南不同生態(tài)區(qū)的80份地方稻種Pi-d3基因編碼區(qū)進行擴增并測序，通過分析Pi-d3基因在核苷酸水平上的多態(tài)性，明確云南稻種Pi-d3基因序列變異類型和地理分布特點，旨在為研究稻種傳播過程中生態(tài)環(huán)境變化與基因變異的關系提供依據(jù)，為篩選抗稻瘟病地方品種提供材料。

1材料與方法

1.1供試材料

從保存于云南省農(nóng)業(yè)科學院生物技術與種質(zhì)資源研究所內(nèi)的云南地方稻種資源核心種質(zhì)庫中隨機抽取80份來源于云南省不同州市(縣)的地方品種作為本研究的材料。按秈粳亞種分類，粳稻46份，秈稻34份；按水陸稻分類，水稻48份，陸稻32份；按黏糯稻分類，黏稻62份，糯稻18份。本研究以日本晴Pi-d3基因序列為測序?qū)φ铡?/p>

1.2水稻基因組DNA的提取

在水稻3～4葉期，取新鮮葉片，采用改進的CTAB法提取基因組DNA[12]。

1.3Pi-d3基因同源序列的獲取及分析

根據(jù)已知的Pi-d3基因的保守序列設計引物對(Pi-d3-1F：5′-GCGAGAAGGAAGTAACACCCA-3′；Pi-d3-1R：5′-CGGAGGATATCGTGCATTTGG-3′；Pi-d3-2F：5′-GTACGACTCTGGGTTGCTGAA-3′；Pi-d3-2R：5′-AGAATGAATGTCCTGACTGAAACC-3′)，由華大基因公司合成后，對云南地方稻種抗稻瘟病基因Pi-d3進行擴增。

PCR反應體系總體積為40 μL，包括10×緩沖液 4 μL，dNTPs 2 μL，4 mol/L正向和反向引物2 μL，ExTaq酶 0.5 μL，20 ng/μL DNA模板 1 μL，ddH2O 28.5 μL。PCR反應程序如下：95℃下預變性5 min；94℃下變性40 s，57℃下退火30 s，72℃下延伸2 min，35個循環(huán)；72℃下再延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物用0.5%的瓊脂糖凝膠電泳。電泳后于紫外投射儀下檢測條帶合格后，送華大基因公司進行測序，每個材料重復測序兩次。

2結果與分析

2.1云南地方稻種Pi-d3等位基因編碼區(qū)序列的變異

在水稻中，Pi-d3基因編碼區(qū)的長度為2775 bp，實驗獲得的日本晴序列長度及堿基順序與從GenBank獲得的序列No. FJ773286.1一致，表明測序數(shù)據(jù)可靠。與地谷序列(GenBank Accession No.FJ773285.1)相比，80份云南地方稻種的Pi-d3編碼序列中，共發(fā)現(xiàn)39個核苷酸變異位點，分別位于94，95，130，144，197，326，356，414，458，459，477，525，537，610，756，775，785，1014，1128，1197，1329，1399，1484，1544，1713，1729，1766，1842，1874，2005，2009，2209，2396，2444，2566，2671，2680，2687，2699位點(表1)，平均變異率1.41%。39個不同位點的變異頻率為1.25%～100.00%，值得注意的是，位點2566、2687處的變異率均達到100.00%，表明所檢測的云南稻種在2566和2687位點與地谷完全不同。39個變異位點中17個發(fā)生顛換，占總突變位點的43.59%，其中G/T顛換7個(占17.95%)，A/T顛換5個(占12.82%)，C/G表1云南地方稻種Pi-d3基因編碼區(qū)序列的變異

Table 1. Sequence variations of Pi-d3 open reading frame in Yunnan rice landraces.

變異位點Variationsite地谷堿基BaseinPi-d3Digu替代堿基Substitutedbase替換類型Substitutiontype測序材料數(shù)Sequencedaccessionnumber替代材料數(shù)No.ofsubstitutedaccessions頻率Frequence/%94GT顛換Transversion8033.895AT顛換Transversion8011.3130GC顛換Transversion807796.3144TG顛換Transversion807796.3197CT轉換Transition8078.8326AT顛換Transversion8045.0356GC顛換Transversion8033.8414GT顛換Transversion8033.8458CT轉換Transition802227.5459AG轉換Transition807796.3477AG轉換Transition804657.5525TC轉換Transition805568.8537GA轉換Transition804860.0610GA轉換Transition802430.0756TC轉換Transition8078.8775GA轉換Transition807796.3785AG轉換Transition807593.81014CT轉換Transition802227.51128CA顛換Transversion80810.01197TC轉換Transition807998.81329TG顛換Transversion8056.31399AT顛換Transversion80810.01484GA轉換Transition8056.31544GA轉換Transition802430.01713TG顛換Transversion807188.81729GA轉換Transition807290.01766CT轉換Transition80810.01842CG顛換Transversion80911.31874AT顛換Transversion806986.32005GT顛換Transversion802328.82009GA轉換Transition802328.82209CT轉換Transition802328.82396AG轉換Transition80810.02444TA顛換Transversion807188.82566CG顛換Transversion8080100.02671GT顛換Transversion801012.52680GA轉換Transition807290.02687GA轉換Transition8080100.02699GA轉換Transition8078.8

顛換4個(占10.26%)，A/G顛換1個(占2.56%)；22個位點發(fā)生轉換，占總突變位點的56.41%，其中G/A轉換14個(占35.90%)，C/T轉換8個(占20.51%)。經(jīng)過DNA序列的比對，可將80份云南地方稻種歸為37種單倍型(表2)，日本晴歸于H4。每種單倍型的變異堿基數(shù)均在10個以上，平均變異堿基數(shù)17個，其中單倍型H11的變異堿基數(shù)最多(22個)，單倍型H31的變異堿基數(shù)最少(11個)。從表2中還可以看出，37種單倍型中H8(28.8%)，H4(11.3%)，H23(5.0%)所占比例較高，是云南的主要類型，而其他單倍型的頻率較低，每個單倍型僅有1～2個品種?？梢?，云南地方稻種在Pi-d3位點上具有變異豐富、單倍型類型多、頻率較低的特點。

2.2抗稻瘟病基因Pi-d3蛋白的氨基酸分析

對比分析云南地方稻種Pi-d3基因的37種單倍型與地谷編碼蛋白質(zhì)情況，發(fā)現(xiàn)存在28個氨基酸的變異。37種單倍型共編碼33種蛋白質(zhì)，單倍型H2與H35、H4與H17、H8與H19、H14與H15編碼的蛋白質(zhì)不存在差異(表3)。這33種不同的蛋白質(zhì)中，有16種提前出現(xiàn)終止子為非完整蛋白，其余的17種為完整蛋白。

結合表2、表3可以看出H1、H4、H17、H7、H9、H11、H14、H15、H18、H21、H24、H30、H36共13種單倍型由于在核苷酸2209位處發(fā)生C/T顛換，使氨基酸737位出現(xiàn)終止子，導致Pi-d3基因成為假基因，這是Shang等發(fā)現(xiàn)的假基因位點，由此可以推測這些單倍型的植株易感病[10]。此外，本研究中新發(fā)現(xiàn)單倍型H33、H34由于在核苷酸94位出現(xiàn)G/T顛換，致使氨基酸32位出現(xiàn)終止子；單倍型H13、H16、H28、H34、H36在核苷酸1399位發(fā)生A/T顛換，導致氨基酸467位出現(xiàn)終止子，這些是新發(fā)現(xiàn)的易感病假基因單倍型。

80份云南地方材料中有32份出現(xiàn)假基因化現(xiàn)象，假基因出現(xiàn)頻率高達40%。這些假基因化材料包含粳稻20份，秈稻12份，雖然秈稻中出現(xiàn)假基因的頻率(35.3%)明顯低于粳稻(43.5%)，但檢測出了秈稻中存在假基因化現(xiàn)象。而Shang等在發(fā)現(xiàn)Pi-d3基因時認為，Pi-d3假基因化只存在于粳稻和雜草稻中，而在檢測過的野生稻和秈稻中都沒有假基因化[10]。云南地方稻種Pi-d3假基因化在水稻和陸稻中出現(xiàn)的數(shù)量同為16份，但在水稻中出現(xiàn)頻率(33.3%)低于陸稻(50.0%)。按黏糯稻分類，供試材料中有23份黏稻和9份糯稻材料出現(xiàn)Pi-d3假基因化，糯稻的出現(xiàn)頻率(50.0%)高于黏稻(37.1%)。Pi-d3假基因化在云南的10個州市均有分布，以普洱(8份)、版納(7份)、臨滄(6份)為主，德宏出現(xiàn)3份，文山、昭通各出現(xiàn)2份，玉溪、紅河、麗江、保山均出現(xiàn)1份。版納出現(xiàn)Pi-d3假基因化的頻率最高，達87.5%。在普洱、版納、臨滄這些地區(qū)，秈稻和粳稻同時進行種植，天然雜交幾率較高，云南秈稻品種中發(fā)現(xiàn)了假基因化現(xiàn)象，推測云南地方稻種中Pi-d3假基因化從粳稻向秈稻的滲透。

表3不同單倍型中Pi-d3基因氨基酸序列變化

Table 3. Amino acid variation of Pi-d3 in 37 haplotypes.

單倍型Haplotype氨基酸位點Aminoacidlous324466109119138153204259262443467495515571577589625669670737799815856891894896900地谷DiguEGAKRRTGVDNRGRHVSNVGQNFHVVRRH1-R-M--MSI-K--HQM-IFD*-YD-IQ-H2、H35-R------------QM-I----YD-IQ-H3-R------I-----QM-I----YDLIQ-H4、H17-R----MSI----HQM-IFD*-YD-IQ-H5-R-MPS--I---E---L----S-DL-QQH6-R------I---E-QM-I----YDLIQ-H7-R---SMSI----HQM-IFD*-Y-LIQ-H8、H19-R------I-----QM-I----YD-IQ-H9------MSI----HQM-IFD*-YD-IQ-H10-R------IG----QM-I----YDLIQ-H11-R-MPSMSI----HQM-IFD*-YD-IQ-H12-R------I-----QM------YD-IQ-H13-R------I--*--QM-I----YDLIQ-H14、H15-R----MSI-K--HQM-IFD*-YD-IQ-H16-RV-----I--*----L----S-D--QQH18-R----MSI----HQM-IFD*-YDLIQ-H20-RV-----I-------L----S-D--QQH21-R-MP-MSI----HQM-IFD*-YD-IQ-H22-R------I---E-QM-I----YD-IQ-H23-R------IG----QM-I----YD-IQ-H24-R----MSI----H-M----*-YD-IQ-H25-RV-----I-------L----S-D--Q-H26-R----------E-QM-I----YD-IQ-H27-RV-----I-------L----S-DL-QQH28-R------I--*--QM-I----YD-IQ-H29VR------I-----QM-I----YD-IQ-H30-------SI----HQM-IFD*-YD-IQ-H31--------I-----QM-I----YD-IQ-H32-R-----SI-K--HQM-IFD--YD-IQ-H33*R------I-----QM-I----YD-IQ-H34*R------I--*E-QM-I----YD-IQ-H36-R----MSI--*-HQM-IFD*-YD-IQ-H37-R------I-----QM-I-----D-IQ-

“-”代表在此位點上與地谷相同; “*”代表終止子。

“-”represents the same base as Digu; “*”represents terminator.

2.3抗稻瘟病基因Pi-d3不同單倍型在云南各地區(qū)的分布

分析Pi-d3基因在云南省各州市的地理分布發(fā)現(xiàn)(表4)，主要單倍型中H4集中分布在普洱、臨滄等地，在普洱的分布頻率最高，達44.4%，為普洱的優(yōu)勢單倍型。單倍型H8在云南省的分布范圍較為廣泛，主要分布在德宏、普洱、臨滄、保山、玉溪、文山、昭通等地，其中在普洱和臨滄的分布頻率較高(17.4%)，是普洱和臨滄兩地的優(yōu)勢單倍型。單倍型H23在普洱的分布頻率同樣較高(50.0%)。云南各地區(qū)的單倍型多樣性指數(shù)表現(xiàn)為：普洱市(0.885)>版納州(0.875)>臨滄市(0.871)>玉溪市(0.861)>文山州(0.735)>德宏州(0.722)>保山市(0.720)>麗江市(0.667)>昭通市(0.560)。顯而易見，普洱、版納、臨滄擁有較多類型的單倍型。這些結果進一步表明Pi-d3基因在云南各地不同的生態(tài)類型之間存在顯著的遺傳分化。

2.4抗稻瘟病基因Pi-d3不同單倍型在水稻各類型中的分布

Pi-d3基因在云南地方品種的粳稻、秈稻亞種間的分布存在差異，H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9、H10、H11、H13、H14、H17、H18、H19、H20、H21、H22、H24、H25、H26、H27等單倍型只在粳稻中出現(xiàn)；H28、H29、H30、H31、H32、H33、H34、H35、H36、H37等單倍型只在秈稻中出現(xiàn)。在Pi-d3位點上，粳稻和秈稻的共享基因型有H4、H8、H12、H15、H16、H23，根據(jù)共享基因型頻率可以看出H4為粳稻的優(yōu)勢單倍型，H8為秈稻的優(yōu)勢單倍型。單倍型H4的序列與粳稻日本晴(GenBank Accession No. FJ773286.1)完全相同，單倍型H8的序列與秈稻 93-11(GenBank Accession No.FJ773285.1)的序列完全相同?？梢?，秈稻和粳稻均有優(yōu)勢單倍型，表明兩個亞種在此位點上已發(fā)生明顯的遺傳分化，粳稻單倍型類型更為豐富。

Pi-d3基因在水稻和陸稻間的分布同樣存在差異，H1、H2、H3、H5、H6、H7、H11、H12、H13、H14、H17、H21、H26、H27、H32等單倍型只在陸稻中出現(xiàn)；H9、H10、H19,H22、H24、H25、H28、H29、H30、H31、H33、H34、H35、H36、H37等單倍型只在水稻中出現(xiàn)；H4、H8、H15、H16、H18、H20、H23等單倍型在水陸稻種均有出現(xiàn)，其中H4為陸稻的優(yōu)勢單倍型、H8、H20、H23為水稻的優(yōu)勢單倍型。

Pi-d3基因在黏性稻和糯性稻間的分布存在差異，H1、H2、H5、H6、H7、H9、H13、H14、H15、H16、H17、H20、H22、H23、H26、H27、H29、H31、H32、H33、H34、H35、H36、H37只在黏稻中分布；H10、H11、H19、H21、H24、H25、H30只在糯稻中分布；H3、H4、H8、H12、H18、H28等單倍型在黏稻和糯稻中均有分布，其中H4、H8為黏稻的優(yōu)勢單倍型，H28為糯稻的優(yōu)勢單倍型。

2.5進化樹的構建

所有材料可分為兩大枝(圖1)，對應氨基酸577、589、799、894位點的變異，其中Ⅰ枝包括H20、H16、H27、H5、H25和地谷，其余的32種單倍型歸為第Ⅱ枝。在第Ⅰ枝中，地谷單獨為一個小枝，H25、H5、H27、H16、H20為一個群，它們與地谷的親緣關系較近，特征是氨基酸577、894位點無變異，589位點變異為L(亮氨酸)，799位點變異為S(絲氨酸)。在第Ⅱ枝中，H37單獨為一個小枝，另外的31個單倍型聚為一個亞枝，這個亞枝中H2、H35、H26、H6、H22、H34、H3、H13、H10、H23、H8、H19、H28、H29、H33、H31聚為一個群，它們在氨基酸669和670位點均無變異。H24、H32、H9、H30、H7、H18、H17、H36、H4、H14、H15、H1、H11、H21聚為一個群，它們的特征是在氨基酸204位點變異為S(絲氨酸)，515位點變異為H(組氨酸)，H12單獨為一小枝。從進化關系看H37、H12、H8、H19、H28、H29、H33更為原始。

3討論

云南省地形氣候復雜，位于中國與南亞兩個稻種起源中心之間，是世界上最大的稻種遺傳多樣性中心之一，基因多樣性大于中國其他地理群[11]。本研究通過核苷酸序列分析將80份云南地方稻種的Pi-d3基因歸為37種單倍型；單倍型分析表明云南地方稻種Pi-d3基因單倍型種類豐富，低頻率的單倍型較多，秈稻和粳稻均有優(yōu)勢單倍型，兩個亞種間已發(fā)生明顯的遺傳分化，出現(xiàn)這種現(xiàn)象也可能是秈稻和粳稻由不同的野生稻進化而來。

表5Pi-d3不同單倍型在水稻各類型中的分布

Table 5. Distribution of Pi-d3 haplotype in different rice types.

單倍型Haplotype材料數(shù)No.ofaccessions粳稻japonica數(shù)量No.頻率Frequence/%秈稻indica數(shù)量No.頻率Frequence/%陸稻Uplandrice數(shù)量No.頻率Frequence/%水稻Lowlandrice數(shù)量No.頻率Frequence/%黏稻No-waxyrice數(shù)量No.頻率Frequence/%糯稻W(wǎng)axyrice數(shù)量No.頻率Frequence/%H111100.0001100.0001100.000H211100.0001100.0001100.000H322100.000150.0150.0150.0150.0H49777.8222.2666.7333.3777.8222.2H511100.0001100.0001100.000H611100.0001100.0001100.000H711100.0001100.0001100.000H823939.11460.9521.71878.31982.6417.4H911100.000001100.01100.000H1011100.000001100.0001100.0H1111100.0001100.000001100.0H122150.0150.02100.000150.0150.0H1311100.0001100.0001100.000H1411100.0001100.0001100.000H152150.0150.0150.0150.02100.000H162150.0150.0150.0150.02100.000H1711100.0001100.0001100.000H1822100.000150.0150.0150.0150.0H1911100.000001100.0001100.0H2033100.000133.3266.73100.000H2111100.0001100.000001100.0H2211100.000001100.01100.000H234250.0250.0125.0375.04100.000H2411100.000001100.0001100.0H2511100.000001100.0001100.0H2611100.0001100.0001100.000H2711100.0001100.0001100.000H283003100.0003100.0133.3266.7H291001100.0001100.01100.000H301001100.0001100.0001100.0H311001100.0001100.01100.000H321001100.01100.0001100.000H332002100.0002100.02100.000H341001100.0001100.01100.000H351001100.0001100.01100.000H361001100.0001100.01100.000H371001100.0001100.01100.000總數(shù)Total804657.53442.53240.04860.06277.51822.5

Pi-d3基因在云南的分布范圍廣泛，云南省13個州市的不同生態(tài)類型中都有分布，呈現(xiàn)出大分散、小聚居的特點。水稻與稻瘟病菌之間存在特異互作現(xiàn)象，且符合“基因?qū)颉钡年P系。云南稻瘟病菌群體遺傳多樣性水平較高[15-16]，不同海拔地區(qū)稻瘟病菌生理小種和遺傳多樣性存在差異[17]。在“稻-稻瘟病菌”的長期協(xié)同進化中，復雜多樣的稻瘟病菌群體參與了品種的自然選擇，為云南稻種資源稻瘟病抗性提供了進化的動力[18]。因此，云南地方稻種Pi-d3基因的多樣性及廣泛分布與相關稻瘟病菌生理小種的遺傳多樣性密切相關。

Shang等在檢測中發(fā)現(xiàn)，Pi-d3假基因化只存在于粳稻和雜草稻中，在大部分被測的粳稻品種中Pi-d3基因轉錄起始位點開始的第2208位核苷酸處的CAG突變成為終止子TAG，使之成為了假基因，而在檢測過的非洲栽培稻、AA組型野生稻和秈稻中都未發(fā)現(xiàn)假基因，由此推測這種突變是秈粳稻分化后發(fā)生的[10]。本研究在檢測的80份云南地方稻種中發(fā)現(xiàn)20份粳稻和12份秈稻出現(xiàn)假基因化現(xiàn)象，假基因化頻率較高，新發(fā)現(xiàn)核苷酸94、1399位兩個假基因位點。Pi-d3假基因出現(xiàn)頻率較高的地區(qū)一般同時種植秈粳稻，天然雜交的幾率高，秈稻中出現(xiàn)假基因化可能是粳稻與秈稻雜交，粳稻假基因向秈稻滲透的結果。

圖1Neighbor-joining 法構建水稻抗稻瘟病基因Pi-d3系統(tǒng)進化樹

Fig. 1. Neighbor-joining phylogenetic tree for 37 Pi-d3 haplotypes.

Shang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，抗稻瘟病基因Pi-d3在水稻品種地谷、93-11、TP309以及日本晴中均被檢測到，但只有秈稻品種地谷和93-11中該基因?qū)Φ疚辆哂锌剐?，在粳稻品種TP309和日本晴中，由于基因內(nèi)部一個C/T的顛換，導致終止子提前，僅編碼一個帶有737個氨基酸的多肽，破壞了該蛋白的LRR區(qū)域，進而導致該基因功能的喪失。本研究新發(fā)現(xiàn)Pi-d3基因在秈稻中出現(xiàn)假基因化現(xiàn)象，這些假基因化的品種是否具有抗病性，需要進一步的抗病性研究。此外，除了出現(xiàn)Pi-d3假基因的單倍型，另外19種單倍型的Pi-d3氨基酸序列與地谷不同，它們的功能需要進一步研究。

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Sequence Variation ofPi-d3 for Rice Blast Resistance in Yunnan Rice Landrace

YANG Yi, SUN Yi-ding, MA Ji-qiong, WANG Yan-yan, XU Ming-hui*

(InstituteofBiotechnologyandGeneticResources/KeyLaboratoryofBiotechnologyResearchofYunnanProvince/KeyLaboratoryofSouthwesternCropGeneResourcesandGermplasmInnovationofMinistryofAgriculture,YunnanAcademyofAgriculturalSciences,Kunming650223,China；*Corresponding author, E-mail：xuminhui@sohu.com)

YANG Yi, SUN Yiding, MA Jiqiong, et al. Sequence variation ofPi-d3 for rice blast resistance in Yunnan rice landrace. Chin J Rice Sci, 2016, 30(1): 17-26.

Abstract:The sequence variations of Pi-d3 for rice blast resistance in 80 Yunnan rice landraces were analyzed by resequencing open reading frame (ORF). Compared with Pi-d3(Digu )ORF, a total of 39 nucleotide variations were found in 2775-bp ORFs of 80 rice accessions with the average mutation rate of 1.41%. The WTBXPi-d3ORF of 80 rice accessions was divided into 37 haplotypes based on the nucleotide variations. H8(28.8%), H4(11.3%) and H23(5.0%) are high-frequency types, while other types occurred at low frequency. The results showed that the WTBXPi-d3 in Yunnan rice landraces was rich in genetic variations and haplotypes,but low frequency. A total of 28 amino acids variations were found in 33 translation proteins of 37 haplotypes. 18 haplotypes with 32 rice landraces including 12 indica accessions possessde the Pi-d3 pseudogenes. The frequency of pseudogene was high. It was possible due to that the Pi-d3 pseudogene permeated to indica. Terminators were newly founded at position 32 and 467 of protein except the published terminator at position 737. Pi-d3 differed in both type and frequency of haplotypes between the subspecies of indica and japonica, the ecotypes of lowland and upland rice, no-waxy and waxy rice. It indicated that genetic differentiation occurred between subspecies or ecotypes. Geographical distribution showed that 37 haplotypes spread over a large area while concentrated in small areas. Puer, Banna and Lincang were the central area with abundant haplotypes, and based on this scale, the types of haplotypes decreased outward progressively.

Key words:Yunnan rice landraces; rice blast; Pi-d3; single nucleotide polymorphism

文章編號:1001-7216(2016)01-0017-10

中圖分類號:Q756； S435.111.4+1

文獻標識碼:A

基金項目:國家自然科學基金資助項目(31360331)；科技部基礎性工作專項(2012FY110200)； 云南省自然科學基金資助項目(2013FZ146)。

收稿日期:2015-06-13； 修改稿收到日期: 2015-07-30。