夏志輝　劉鵬程　高利芬　劉棟峰　姜麗　江光懷　郭樂群　翟文學(xué),*

(1中國科學(xué)院 遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，北京 100101；2海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點實驗室/海南大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，?？?70228； #共同第一作者；*通訊聯(lián)系人，E-mail: wxzhai@genetics.ac.cn)

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水稻無選擇標記Xa21轉(zhuǎn)基因系CX8621的獲得與遺傳分析

夏志輝1,2,#劉鵬程1,#高利芬1劉棟峰1姜麗1江光懷1郭樂群1翟文學(xué)1,*

(1中國科學(xué)院 遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，北京 100101；2海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點實驗室/海南大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，?？?70228；#共同第一作者；*通訊聯(lián)系人，E-mail: wxzhai@genetics.ac.cn)

夏志輝, 劉鵬程, 高利芬, 等. 水稻無選擇標記Xa21轉(zhuǎn)基因系CX8621的獲得與遺傳分析. 中國水稻科學(xué)， 2016， 30(1)： 10-16.

摘要:無選擇標記和轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定遺傳是轉(zhuǎn)基因作物安全應(yīng)用的基本要求。按照我國轉(zhuǎn)基因作物安全評價指南，利用雙右邊界T-DNA載體系統(tǒng)將廣譜抗白葉枯病基因Xa21轉(zhuǎn)入水稻恢復(fù)系明恢86。通過抗性鑒定、PCR分析和Southern雜交，跟蹤了外源Xa21基因在轉(zhuǎn)基因后代植株的遺傳，并在T3代獲得了無選擇標記和載體骨架序列的單拷貝抗病純合系CX8621。多年的觀察和鑒定表明轉(zhuǎn)基因恢復(fù)系CX8621具有穩(wěn)定的白葉枯病抗性。目前CX8621已經(jīng)穩(wěn)定遺傳至T(16)，并已通過小規(guī)模的田間試驗(環(huán)境釋放)和大規(guī)模的田間試驗(生產(chǎn)性試驗)的安全評價。

關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)基因水稻； 白葉枯??； Xa21； 無選擇標記； 穩(wěn)定遺傳

水稻是世界上最重要的糧食作物，為全球一半以上的人口提供食物[1]；它作為我國第一大糧食作物，更是占我國糧食總產(chǎn)量的40%[2]。伴隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的快速發(fā)展，兼之水稻的重要戰(zhàn)略地位，我國在轉(zhuǎn)基因水稻的研發(fā)和培育方面取得了巨大進展[3]。目前已經(jīng)培育出抗蟲[4-5]、抗病[6]、抗除草劑[7]以及具有優(yōu)良品質(zhì)[8-9]的轉(zhuǎn)基因水稻，其中轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻“華恢1號”和“Bt汕優(yōu)63”于2009年獲得生產(chǎn)應(yīng)用安全證書[10]。此外，還有多項轉(zhuǎn)基因水稻獲準進行生產(chǎn)性試驗[11]。我國轉(zhuǎn)基因作物的安全評價依據(jù)是《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價管理辦法》；評價過程包括試驗研究、中間試驗、環(huán)境釋放、生產(chǎn)性試驗及最后的生產(chǎn)應(yīng)用安全證書[12]。外源基因在轉(zhuǎn)基因作物的整合情況鑒定及遺傳穩(wěn)定性分析結(jié)果是轉(zhuǎn)基因安全評價的必備技術(shù)資料[13]。迄今為止，嚴格按照轉(zhuǎn)基因安全評價的要求，對外源基因遺傳穩(wěn)定性多代分析的研究資料報道甚少。本研究重點闡述轉(zhuǎn)Xa21基因抗白葉枯病恢復(fù)CX8621的獲得流程、穩(wěn)定整合與遺傳、抗病能力及其分子鑒定，以期為其他開展轉(zhuǎn)基因作物工作的同仁提供參考。

圖1 簡化的pBXa21線性結(jié)構(gòu)與酶切圖譜

Fig. 1. Simplified linear structure and enzyme pattern of pBXa21.

1材料與方法

1.1實驗材料

受體材料明恢86為雜交水稻育種中廣泛應(yīng)用的秈稻恢復(fù)系?？剐澡b定所用到的供試菌株為來源于菲律賓的白葉枯病鑒別小種，包括PXO61(P1)、PXO86(P2)、PXO79(P3)、PXO71(P4)、PXO99(P6)、PXO145(P7)、PXO280(P8)、PXO339(P9)、PXO124(P10)，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供，本實驗室保存。

1.2轉(zhuǎn)基因載體與轉(zhuǎn)化

在前期工作中，我們已將廣譜顯性抗白葉枯病基因Xa21構(gòu)建到能去除標記基因的雙右邊界雙元載體pBXa21上，并利用該載體成功獲得了無標記的轉(zhuǎn)Xa21基因水稻(圖1)[6,14-15]。pBXa21的細菌選擇標記為壯觀霉素抗性基因(spectinomycinresistantgene，specR)，轉(zhuǎn)化選擇標記為潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hygromycinBphosphotransferasegene，hpt)。秈稻明恢86轉(zhuǎn)化方法參照文獻[6]和[16]。

1.3轉(zhuǎn)基因植株的種植管理

轉(zhuǎn)基因植株的種植管理，嚴格按照《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價管理辦法》、《轉(zhuǎn)基因植物安全評價指南》與《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》的要求進行，在溫室轉(zhuǎn)基因作物種植區(qū)和設(shè)有隔離帶的田間種植。2004年獲得轉(zhuǎn)基因T0植株，以后每年在北京或海南種植轉(zhuǎn)基因后代植株，先后進行了中間試驗、環(huán)境釋放和生產(chǎn)性試驗各階段的安全評估。目前已繁殖至 T16代。

1.4轉(zhuǎn)基因植株的抗性鑒定

轉(zhuǎn)基因水稻對白葉枯病的抗性鑒定參照國家標準《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品環(huán)境安全檢測——抗病水稻》第一部分對靶標病害的抗性(農(nóng)業(yè)部953號公告-9.1-2007)進行。

1.5目的基因在植物基因組中的整合及遺傳分析

根據(jù)農(nóng)業(yè)部《轉(zhuǎn)基因植物安全評價指南》對申請轉(zhuǎn)化體安全證書的要求，對不同世代的轉(zhuǎn)基因株系進行了PCR鑒定和Southern雜交分析，以明確外源基因的整合情況和遺傳穩(wěn)定性。

在進行PCR鑒定時，目的基因Xa21的檢測使用的是UI/I1引物對，由王國梁等根據(jù)Xa21基因激酶區(qū)序列設(shè)計[17]，在轉(zhuǎn)基因植株中能擴增出1377 bp和1248 bp兩條帶，而在非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩兄荒軘U出1248 bp一條條帶。鑒定標記基因hpt使用的引物為hpt-F/R，在轉(zhuǎn)基因植株中擴增產(chǎn)物為1035 bp，對照和非轉(zhuǎn)基因植株中無擴增。左邊界引物為LB-F/R，在轉(zhuǎn)基因植株中產(chǎn)物為339 bp，對照和非轉(zhuǎn)基因植株中無擴增。具體序列參考夏志輝等無選擇標記和載體骨干序列的Xa21轉(zhuǎn)基因水稻的獲得[6]。

在Southern 雜交分析時，用限制性內(nèi)切酶(T0代和T1代分析用的PvuⅡ、T11代分析用KpnⅠ、PvuⅡ、HindⅢ)37℃酶切過夜；0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到尼龍膜上用于分子雜交。分子雜交使用的是北京美萊博生物技術(shù)有限公司的Hyb高效雜交液，Xa21雜交探針使用的是引物Xa21-PF/PR擴增的片段，標記基因hpt以及左邊界LB分析所用的探針與PCR鑒定時擴增的產(chǎn)物相同。探針具體位置與酶切圖譜見圖1。

A-hpt基因的PCR分析； B-Xa21基因的PCR分析。pMNDRBBin6-不含Xa21的空載體； pBXa21-以pMNDRBBin6為骨架構(gòu)建的含Xa21的載體； MH86-非轉(zhuǎn)基因?qū)φ彰骰?6。

A, PCR analysis ofhpt； B，PCR analysis ofXa21. pMNDRBBin6，Vector withoutXa21；pBXa21，Vector withXa21；MH86，Non-transgenic control Minghui 86.

圖2T0陽性植株P(guān)CR分析結(jié)果

Fig. 2. PCR analysis of transgenic positive T0plants.

A-Xa21基因的Southern 雜交； B-hpt基因的Southern雜交。

A, Southern blot analysis ofXa21； B， Southern blot analysis ofhpt.

圖3T0代部分轉(zhuǎn)基因株系的Southern雜交分析

Fig. 3. Southern blot hybridization analysis of T0plants.

2結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)基因植株T0代中外源插入片段的整合分析

用構(gòu)建的pBXa21載體轉(zhuǎn)化明恢86，T0代共獲得轉(zhuǎn)基因株系94個。對既能夠擴增出潮霉素基因特異的1035 bp，也能夠擴增出Xa21基因特異的1377 bp條帶的T0代轉(zhuǎn)基因植株(圖2)進行田間接種P6鑒定，得到陽性株系49個。根據(jù)pBXa21載體的結(jié)構(gòu)和T-DNA整合原理[6,15]，陽性植株中可篩選到不同的整合類型(圖3)。在Southern分析中顯示出的不同帶型，不僅能區(qū)分插入片段是單拷貝還是多拷貝，還可分辨出Xa21與hpt的串聯(lián)整合與分離整合。在Southern雜交中，Xa21基因有比hpt基因多出的條帶，則表明Xa21基因與hpt基因是分離整合；在此類型的分離后代中即可篩選出無選擇標記的Xa21轉(zhuǎn)基因植株，如T0代植株CX86 34-3。

A-Xa21的PCR檢測； B-左邊界側(cè)翼序列的PCR檢測； C-hpt基因的PCR檢測。

A, PCR analysis ofXa21； B, PCR analysis of left border； C, PCR analysis ofhpt.

圖4CX86 34-3株系T1代PCR分子鑒定

Fig. 4. PCR analysis of transgenic T1plants of CX86 34-3.

2.2轉(zhuǎn)基因植株T1代中外源插入片段的遺傳分析

T1代植株分蘗盛期對各株系單株接種P6菌株進行抗病性鑒定，大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植株在T1代表現(xiàn)出抗感分離。對接種鑒定后的抗病植株，分別進行Xa21基因、潮霉素hpt基因以及載體左邊界側(cè)翼骨架序列的PCR 鑒定(由于潮霉素基因位于右邊界，所以不再對更右側(cè)的載體骨架序列進行單獨檢測)，從中篩選不含選擇標記和載體左邊界側(cè)翼骨架序列而只含有Xa21基因的抗病轉(zhuǎn)基因植株。在此，我們以CX86 34-3 T1代轉(zhuǎn)基因單株為例，展示其整合及遺傳規(guī)律。PCR鑒定結(jié)果顯示(圖4)，在其抗病轉(zhuǎn)基因分離后代中能篩選出標記基因(hpt)和載體左邊界側(cè)翼骨架序列檢測均為陰性，而Xa21基因為陽性的單株。

接著對CX86 34-3 的T1代轉(zhuǎn)基因單株進行Southern雜交分析，圖5顯示了部分單株的分析結(jié)果。結(jié)果表明Xa21與hpt以及不同拷貝之間發(fā)生分離。不同的轉(zhuǎn)基因單株中Xa21有單拷貝、雙拷貝和三拷貝，有hpt和無hpt。如CX86 34-3-3植株為單拷貝無選擇標記而只含有Xa21基因單株。同時利用左邊界LB序列作探針的分子雜交可以顯示轉(zhuǎn)基因植株有無左邊界載體骨架序列(數(shù)據(jù)未列出)。多拷貝的轉(zhuǎn)基因植株后代可以繼續(xù)分離，在分離后代中獲得單拷貝的轉(zhuǎn)基因植株。對各植株套袋自交繁殖T2代和T3代，進一步篩選和驗證，在T3代獲得了無選擇標記和載體骨架序列的單拷貝Xa21轉(zhuǎn)基因純合系。純合系植株生長整齊一致，所有植株都表現(xiàn)對P6 的高度抗性，沒有抗感分離。將無選擇標記的單拷貝Xa21轉(zhuǎn)基因純合系命名為CX8621，進行后續(xù)的研究。

A-Xa21基因Southern雜交分析；B-hpt基因Southern雜交分析。無選擇標記Xa21陽性植株用星號(*)標出。

A, Southern blot analysis ofXa21； B，Southern blot analysis ofhpt. Selectable marker-free transgenic plants are makered as *.

圖5T1株系 CX86 34-3 Southern雜交分析

Fig. 5. Southern blot hybridization analysis of T1plants CX86 34-3.

2.3轉(zhuǎn)基因系CX8621的穩(wěn)定遺傳與精細雜交指紋圖譜

由于轉(zhuǎn)基因作物在申請安全證書時，不僅要明確外源片段(如轉(zhuǎn)化載體骨架、目的基因和標記基因等)整合拷貝數(shù)，還需要具有轉(zhuǎn)化事件特異性的分子雜交圖譜。因此，我們對轉(zhuǎn)基因系CX8621的T11代植株提取基因組DNA，參考pBXa21線性圖譜(圖1)，用3種限制性內(nèi)切酶PvuⅡ 、HindⅢ和KpnⅠ酶切后，用1139 bpXa21基因特異的探針進行了Southern雜交分析，獲得了該轉(zhuǎn)基因系特異的雜交指紋圖譜(圖6)。KpnⅠ酶切得到了9.9kb片段，即全長Xa21基因插入片段，說明Xa21基因完整插入到水稻染色體內(nèi)，在后續(xù)繼代過程中沒有片段丟失。HindⅢ酶切得到長為4.4 kb的片段，與預(yù)期的片段大小一致，說明在繼代繁殖過程中轉(zhuǎn)基因Xa21基因內(nèi)部也沒有發(fā)生缺失。PvuⅡ酶切得到長約5.0 kb左右的特異性片段，根據(jù)Xa21基因內(nèi)切酶圖譜判斷，該片段的一個酶切位點位于整合位點的側(cè)翼序列, 因此5.0 kb片段可以作為CX8621轉(zhuǎn)基因系特異的鑒定標記。

T-CX8621； N-明恢86。

T-CX8621； N-Minghui 86.

圖6轉(zhuǎn)基因株系CX8621第T11代Southern雜交

Fig. 6. Southern blot hybridization analysis of T11plants from CX8621.

2.4轉(zhuǎn)基因系CX8621的抗譜鑒定以及病情指數(shù)分析

在分蘗盛期，對明恢 86、CX8621接種9個來自菲律賓的生理小種進行抗譜鑒定，并按照表1的病情分級標準，計算了病情指數(shù)：病情指數(shù)(%)=∑(各病級病葉數(shù)×各級代表數(shù)值)/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×發(fā)病最重級的代表數(shù)值)× 100%。發(fā)病最重的病情指數(shù)是100%，完全無病是0%，數(shù)值的高低表示發(fā)病的輕重。根據(jù)接種鑒定的結(jié)果，CX8621對8個菲律賓生理小種的抗性達到了高抗(表2)。相比對照明恢86以及IRBB21，抗性有顯著增強，抗譜也有擴寬(圖7)。

表1水稻白葉枯病病情分級標準

Table 1. Classification standard for rice bacterial blight disease.

病級Level抗性反應(yīng)Description抗性評價Identification0病斑長度小于接種葉片剩余長度5.0%;或病斑面積小于5.0%。高抗HR1病斑長度占接種葉片剩余長度5.1%～12.0%;或病斑面積占葉面積5.1%～12.0%?？筊3病斑長度占接種葉片剩余長度12.1%～25.0%;或病斑面積占葉面積12.1%～25.0%。中抗MR5病斑長度占接種葉片剩余長度25.1%～50.0%;或病斑面積占葉面積25.1%～50.0%。中感MS7病斑長度占接種葉片剩余長度50.1%～75.0%;或病斑面積占葉面積50.1%～75.0%。感S9病斑長度大于接種葉片剩余長度75.1%;或病斑面積大于葉面積75.1%。高感HS

HR,Highly resistant; R,Resistant; MR,Moderately resistent; MS,Moderately sensitive; S,Sensitive; HS,Highly sensitive. The same as below.

表2明恢86和CX8621對白葉枯病菌的抗性鑒定結(jié)果

Table 2. Resistance analysis of Minghui 86 and CX8621.

材料MaterialP1P2P3P4P6P7P8P9P10明恢86Minghui86MSHSSSSMSMSMRSCX8621HRHRRHRHRHRHRHRHR

1-10表示白葉枯菌小種P1～P10；圖下數(shù)字表示平均病情指數(shù)，單位為%。

1-10，Xanthomonasoryzaepv.oryzaeP1 to P10， respectively; Number below the figure stands for the average disease index(%).

圖7明恢86、CX8621和IRBB21的抗譜鑒定以及病情指數(shù)

Fig.7. Spectrum identification and resistance index of Minghui 86，CX8621 and IRBB21.

3討論

無論轉(zhuǎn)基因糧食作物還是轉(zhuǎn)基因非糧食作物，外源基因在受體中的整合與遺傳分析是開展安全評價的基本條件，標準都是一致的[18]。而對轉(zhuǎn)基因作物的環(huán)境與食用安全評價的標準，則依據(jù)受體種類和外源基因的來源，需要個案對待[19]。為提高轉(zhuǎn)化效率，富集轉(zhuǎn)基因陽性植株，在遺傳轉(zhuǎn)化時常引入標記基因進行共轉(zhuǎn)化；使用較多的是抗生素和抗除草劑標記[20]。然而在獲得目標轉(zhuǎn)基因株系后，這些標記就變成了冗余基因，它們的存在可能帶來潛在的安全威脅[21]。此外，對攜帶選擇標記基因的轉(zhuǎn)基因生物體，在安全評價過程中還需要對標記的環(huán)境安全和食用安全進行評價，將大大增加轉(zhuǎn)基因安全評價的項目內(nèi)容與成本[22]。無選擇標記將是轉(zhuǎn)基因作物申請安全證書的基本要求。

對于得到的轉(zhuǎn)基因株系，由于作物本身的多態(tài)性，對轉(zhuǎn)基因工程體的檢測是一項十分巨大的工作，尤其是在區(qū)分雜合狀態(tài)下的轉(zhuǎn)基因材料與分子標記輔助育種材料[23]。為了便于監(jiān)管，我們用3種限制性內(nèi)切酶繪制了轉(zhuǎn)基因株系CX8621的雜交指紋圖譜，其中PvuⅡ的一個酶切位點位于整合位點的側(cè)翼序列，因此所獲得的5.0 kb的片段可以作為此基因工程體特異的檢測標記，便于日后對轉(zhuǎn)基因材料的監(jiān)管。

外源基因引入到植物體后要經(jīng)歷復(fù)雜的有性繁殖，尤其是減數(shù)分裂過程中的同源重組和交叉互換，這對轉(zhuǎn)基因的遺傳穩(wěn)定性提出了挑戰(zhàn)[24]。我們對CX8621進行了長達16代的跟蹤研究，不僅在抗病性上沒有發(fā)現(xiàn)分離；整合片段也沒有發(fā)生丟失和改變，說明了Xa21在CX8621中能穩(wěn)定遺傳，對CX8621的利用可以有效改良水稻對白葉枯病的抗性。

謝辭：感謝中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所周永力研究員提供白葉枯病鑒定菌株；感謝轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項抗病轉(zhuǎn)基因水稻新品種培育課題主持單位中國水稻研究所對本研究的支持。

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Generation and Genetic Analysis ofXa21 Transgenic Rice Line CX8621 Without Selectable Markers

XIA Zhi-hui1,2,#, LIU Peng-cheng1,#, GAO Li-fen1, LIU Dong-feng1, JIANG Li1, JIANG Guang-huai1,GUO Le-qun1， ZHAI Wen-xue1,*

(1Institute of Genetics and Developmental Biology， Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101， China;2Hainan Key Laboratory for Sustainable Utilization of Tropical Bioresources/College of Agriculture, Hainan University, Haikou 570228, China;#These authors contributed equally to this work;*Corresponding author, E-mail: wxzhai@genetics.ac.cn)

XIA Zhihui, LIU Pengcheng, GAO Lifen, et al. Generation and genetic analysis ofXa21 transgenic rice line CX8621 without selectable markers. Chin J Rice Sci, 2016, 30(1): 10-16.

Abstract:Selectable marker-free and stable inheritance are the basic requirements for safe application of transgenic crops. Following the regulations approved by the National Committee for Transgenic Biosafety, the wide spectrum bacterial blight resistance gene Xa21 was transferred into a widely used restorer line Minghui 86 by using a double right-borders T-DNA vector through Agrobacterium tumefaciens-mediated system. The transgene Xa21 was confirmed by resistance identification, PCR analysis and Southern blot in the progenies. The single-copy homozygous transgenic line CX8621 without selectable marker and vector backbone sequences was obtained from T3 generation. The transgenic restorer line CX8621 has stable bacterial blight resistance with years of observation and identification. Up to now, CX8621 has self-fertilized to 16th generation with stable inheritance of transgene Xa21 and passed the bio-safety evaluation of small and large scale of field tests (environmental release and productive test).

Key words:transgenic rice; bacterial blight; Xa21; selectable maker-free; stable inheritance

文章編號:1001-7216(2016)01-0010-07

中圖分類號:Q755; S11.032

文獻標識碼:A

基金項目:國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(2008/2014ZX08001-002)；中國科學(xué)院知識創(chuàng)新方向項目(KSCX2-EWN-01)。

收稿日期:2015-09-07； 修改稿收到日期: 2015-10-16。