許在恩，俞　瑜，李兵娟，陳虹君，郭小勤（浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江臨安311300）

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倭竹族14-3-3非ε類基因編碼區(qū)單核苷酸多態(tài)性

許在恩，俞瑜，李兵娟，陳虹君，郭小勤
（浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江臨安311300）

摘要：為研究倭竹族Shibataeeae中14-3-3非ε類基因的結(jié)構(gòu)及其編碼區(qū)單核苷酸多態(tài)性，分別從倭竹族5個(gè)不同屬的代表種中獲得14-3-3b，14-3-3c，14-3-3e，14-3-3f的基因全長。這些基因均包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，編碼序列（CDS）大小為771~789 bp。14-3-3b，14-3-3c，14-3-3e和14-3-3f編碼區(qū)序列中分別有21，19，26和17個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)，SNP頻率分別為1SNP/38 bp，1SNP/41 bp，1SNP/30 bp，1SNP/46 bp，基因核苷酸多樣性（π）值分別為0.012 17，0.011 83，0.015 21，0.010 38。同一基因在不同竹種間氨基酸序列一致性均達(dá)99%以上，毛竹Phyllostachys edulis Pe14-3-3b，Pe14-3-3c，Pe14-3-3e，Pe14-3-3f蛋白的理化性質(zhì)非常相似，均為親水性蛋白，含量較多的是丙氨酸（ala），谷氨酸（glu），亮氨酸（leu），等電點(diǎn)為4.75~4.90，這4個(gè)蛋白的二級結(jié)構(gòu)也非常相似，α-螺旋結(jié)構(gòu)含量最高，無規(guī)則卷曲其次，β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈很少。上述研究為進(jìn)一步探索竹類植物14-3-3生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。圖3表3參27

關(guān)鍵詞：分子遺傳學(xué)；倭竹族；竹類植物；14-3-3基因家族；單核苷酸多態(tài)性

1976年，MOORE從牛腦組織中分離出一種可溶性蛋白，并依據(jù)其經(jīng)二乙氨乙基纖維素柱（DEAEcellulose）層析后分離組分的片段數(shù)目和在淀粉凝膠電泳中遷移的位置而命名為14-3-3蛋白［1］。14-3-3蛋白是一類多基因家族蛋白，存在7個(gè)14-3-3亞型，用希臘字母命分別名為β，ε，γ，η，δ，τ，ζ，根據(jù)蛋白核心區(qū)域構(gòu)建進(jìn)化樹，將它們分為ε類和非ε類［2］。在擬南芥Arabidopsis thaliana和水稻Oryza sativa中，14-3-3基因家族分別有13個(gè)和8個(gè)成員，序列中間區(qū)域同源性較高（51%），N端同源性較低（14%），C端極不保守［3-4］。隨后在不同物種中對該基因家族研究發(fā)現(xiàn)，序列核心結(jié)構(gòu)的高度保守賦予14-3-3蛋白一些普遍的功能［5-6］：參與調(diào)控植物生長發(fā)育［7-8］、細(xì)胞信號傳導(dǎo)［9］、響應(yīng)逆境脅迫等生命代謝過程［10-11］，但不同成員之間表達(dá)模式存在差異，基因功能出現(xiàn)分化［12］，如14-3-3在細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程中對Inhibitor of NF-κB（IκB）的作用［13］，水稻14-3-3c蛋白是Heading date 3a（Hd3a）的細(xì)胞內(nèi)受體［14］，負(fù)調(diào)控水稻開花；人的14-3-3ε和14-3-3ζ能對DNA損傷做出反應(yīng)［15］。倭竹族Shibataeeae包括倭竹屬Hibanobambusa，剛竹屬Phyllostachys，唐竹屬Sinobambusa，大節(jié)竹屬Indosasa，陰陽竹屬Shibataea，在地下莖類型、花序類型和葉解剖特征方面都表明這是一個(gè)自然的類群［16］。因此研究倭竹族中14-3-3基因家族對于進(jìn)一步認(rèn)識倭竹族有很大的幫助。本研究從倭竹族5個(gè)不同屬的代表種中分別獲得14-3-3b，14-3-3c，14-3-3e和14-3-3f的基因全長，分析單核苷酸多態(tài)性（single nucleotidepolymorphism，SNP）位點(diǎn)，并對毛竹Phyllostachys edulis非ε類14-3-3蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1　材料與方法

1.1植物材料

選取倭竹族的5個(gè)不同屬的代表種進(jìn)行試驗(yàn)：毛竹（剛竹屬，浙江農(nóng)林大學(xué)翠竹園），雞毛竹Hibanobambusa tranguillans（倭竹屬，浙江農(nóng)林大學(xué)翠竹園），白紋陰陽竹Shibataea chinensis（陰陽竹屬，浙江農(nóng)林大學(xué)翠竹園），擺竹Indosasa shibataeoides（大節(jié)竹屬，浙江省臨安市太湖源），唐竹Sinobambusa tootsik（唐竹屬，浙江省臨安市太湖源）。所采集的試驗(yàn)材料均通過形態(tài)學(xué)鑒定，采集后用液氮速凍，保存于－80℃冰箱，以備基因組DNA的提取。

1.2菌株、載體和試劑

大腸埃希菌Escherichia coli DH-5α（TaKaRa,中國大連）菌株由浙江農(nóng)林大學(xué)智能實(shí)驗(yàn)樓竹子課題組保存。載體pM19-T（Simple）Vector（TaKaRa,中國大連）購自寶生物工程（大連）有限公司。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑、膠回收試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3基因組DNA提取

用改進(jìn)的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取5種竹子的基因組DNA［17］。用質(zhì)量濃度為1.0%的普通瓊脂糖凝膠電泳與紫外分光光度法檢測提取DNA的完整性和純度。

1.4引物設(shè)計(jì)和目的基因的克隆

根據(jù)公布毛竹基因組數(shù)據(jù)庫的14-3-3基因的核酸序列設(shè)計(jì)引物（表1），由上海生工生物工程有限公司合成。

表1　擴(kuò)增各基因的引物序列Table 1 Primer sequences used for cloning the target genes

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）反應(yīng)體系總體積為20 .0 μL，其中含100 ng模板DNA；上游引物、下游引物各1.0 μmol·L－1；400 μmol·L－1dNTP；2×16.67 nkat Taq DNA聚合酶；2.0 μL10×PCR反應(yīng)緩沖液（內(nèi)含MgCl2）。程序分別為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。各竹種至少重復(fù)2次，以確保擴(kuò)增結(jié)果的可靠性。擴(kuò)增產(chǎn)物在質(zhì)量濃度為10.0 g·kg-1瓊脂糖凝膠上電泳，穩(wěn)壓150 V，30 min。對電泳分離后的目的片段純化回收。

1.5序列測定、SNP分析及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析

將回收的目的基因連接到pMD19-T（simple）載體上，轉(zhuǎn)化，挑取單克隆進(jìn)行PCR檢測，分別選取20個(gè)陽性克隆進(jìn)行測序，所得準(zhǔn)確序列用DNAman，Dnasp5和MEGA 5.0等軟件進(jìn)行分析。

1.6毛竹14-3-3非ε類基因生物信息學(xué)分析

用Protparam軟件分別對一級結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基組成、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量和親/疏水性及等電點(diǎn)等特性的在線分析。用NetPhos 2.0預(yù)測14-3-3蛋白中的磷酸化位點(diǎn)。用SOPMA軟件在線預(yù)測分析蛋白中的α-螺旋（α-helix，H），β-轉(zhuǎn)角（β-turn，T），無規(guī)則卷曲（random coil，C）以及延伸鏈（extended strand，E）。

2　結(jié)果與分析

2.1 5個(gè)竹種14-3-3非ε類基因組全長的獲得和序列分析

利用4對引物對5個(gè)竹種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆20個(gè)基因，分別命名為Pe14-3-3b，Pe14-3-3c，Pe14-3-3e，Pe14-3-3f，Ht14-3-3b，Ht14-3-3c，Ht14-3-3e，Ht14-3-3f，Sc14-3-3b，Sc14-3-3c，Sc14-3-3e，Sc14-3-3f，St14-3-3b，St14-3-3c，St14-3-3e，St14-3-3f，Is14-3-3b，St14-3-3c，St14-3-3e，St14-3-3f，所有基因序列大小見表2。各基因在不同竹種中的變異程度不同，以測序竹種毛竹中各基因?yàn)閰⒄招蛄校?4-3-3b基因在白紋陰陽竹和擺竹中均有插入序列，而在雞毛竹和唐竹中均有缺失，且在雞毛竹中缺失最多。14-3-3c基因在擺竹、雞毛竹和唐竹中均有缺失。14-3-3e在唐竹中有插入序列，而在其他3個(gè)竹種中均缺失1~6 bp。14-3-3f基因在雞毛竹中有插入序列，而在其他竹種中均存在序列缺失，且序列缺失均約100 bp，且這些插入缺失序列均在非翻譯區(qū)。由此可見：擴(kuò)增的4個(gè)基因在本族中的變異程度不同，14-3-3f基因在本族中的變異幅度最大，其次為14-3-3b，再次為14-3-3e，最后為14-3-3c，說明14-3-3c基因在本族中進(jìn)化趨勢更一致些。

表2　不同竹種中14-3-3基因家族的基因組長度Table 2 Length of 14-3-3 genes in different bamboo species

將基因組序列與cDNA序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，5個(gè)竹種中所有14-3-3b，14-3-3c，14-3-3e及14-3-3f均有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子（表3），外顯子序列所占比例均低于50%。從內(nèi)含子剪接位點(diǎn)的保守性看，這些內(nèi)含子均遵循GT-AG法則。對4個(gè)基因編碼序列（coding sequence，CDS）進(jìn)行比對，顯示14-3-3b，14-3-3c，14-3-3e，14-3-3f基因在不同竹種中的一致性均達(dá)到95%以上，表明各竹種間的14-3-3基因高度同源。因此只放14-3-3b比對結(jié)果來代表14-3-3b，14-3-3c，14-3-3e，14-3-3f的比對結(jié)果（圖1）。

圖1　14-3-3b的編碼序列比對Figure 1 Alignment of 14-3-3b CDS sequences

2.2 14-3-3非ε類基因序列的SNP多樣性分析

由于在非翻譯區(qū)序列存在比較多的片段缺失和插入，因此，只對14-3-3b（789 bp），14-3-3c（771 bp），14-3-3e（789 bp），14-3-3f（786 bp）CDS序列進(jìn)行SNP分析（表3）。14-3-3b，14-3-3c，14-3-3e，14-3-3f分別檢測到21，19，26及17個(gè)SNPs，其出現(xiàn)頻率分別為1SNP/38 bp，1SNP/41 bp，1SNP/30 bp，1SNP/46 bp。經(jīng)Dnsap5推算，14-3-3家族基因的編碼區(qū)都是14-3-3保守結(jié)構(gòu)區(qū)，這表明14-3-3基因在編碼區(qū)域受到較強(qiáng)的選擇壓力。

運(yùn)用Dnasp5軟件對核苷酸多樣性指數(shù)π分析顯示，π14-3-3f=0.009 16明顯低于其他基因，其次π14-3-3c=0.010 98，π14-3-3b=0.012 17，且在14-3-3e中表現(xiàn)出最高的多態(tài)性指數(shù)π14-3-3e=0.015 21（表3）。14-3-3基因編碼區(qū)內(nèi)，非同義突變SNPs是同義突變的SNPs的3~6倍。對14-3-3基因83個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行突變類型分析顯示，61個(gè)位點(diǎn)發(fā)生轉(zhuǎn)換，22個(gè)位點(diǎn)發(fā)生顛換，大部分是AG和CT之間的變換，其中14-3-3b的SNP，13個(gè)位點(diǎn)發(fā)生轉(zhuǎn)換，8個(gè)位點(diǎn)發(fā)生顛換；14-3-3c的SNP，16個(gè)位點(diǎn)發(fā)生轉(zhuǎn)換，3個(gè)位點(diǎn)發(fā)生顛換；14-3-3e的SNP，19個(gè)位點(diǎn)發(fā)生轉(zhuǎn)換，7個(gè)位點(diǎn)發(fā)生顛換；14-3-3f的SNP，13個(gè)位點(diǎn)發(fā)生轉(zhuǎn)換，4個(gè)位點(diǎn)發(fā)生顛換。

表3　不同竹種中14-3-3基因的SNP多態(tài)性Table 3 Nucleotide polymorphisms in 14-3-3 genes

2.3 14-3-3非ε類基因系統(tǒng)發(fā)生樹分析

利用MEGA 5.0軟件，對各竹種中所獲基因蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）。結(jié)果顯示：雙子葉植物擬南芥所有的14-3-3基因聚類在一起，而單子葉植物竹子和水稻的基因聚成另一大類，進(jìn)一步分類，所有竹子的14-3-3b和水稻的GF14-b（OsGF14b）聚成一個(gè)小分支，14-3-3e，14-3-3c和14-3-3f也是同樣的結(jié)果，且14-3-3b和14-3-3e的同源性最高，其次與14-3-3c，最后與14-3-3f。以上結(jié)果也暗示14-3-3基因家族各基因在單雙子葉植物中發(fā)生不同程度的進(jìn)化，在單子葉植物中，14-3-3基因家族各基因進(jìn)化程度存在差異，基因間的進(jìn)化程度快于物種的進(jìn)化程度。

圖2　14-3-3蛋白的進(jìn)化樹分析Figure 2 Phylogenetic tree based on the complete amino acid sequences of 14-3-3 protein in arabidopsis,rice and bamboo

2.4毛竹Pe14-3-3非ε類基因的生物信息學(xué)分析

由上述結(jié)果可以看出：倭竹族各竹種間14-3-3b，14-3-3c，14-3-3e，14-3-3f基因同源性95%以上，因此，以毛竹14-3-3b，14-3-3c，14-3-3e，14-3-3f基因?yàn)榇磉M(jìn)行的生物信息學(xué)分析。2.4.1毛竹Pe14-3-3非ε類基因家族蛋白的理化性質(zhì)分析用ExPASy在線分析14-3-3基因家族各蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示：蛋白間理化性質(zhì)比較相似，分子量為26~30 kDa，均為酸性等電點(diǎn)，谷氨酸、丙氨酸和亮氨酸含量高，等電點(diǎn)均小于5，不穩(wěn)定指數(shù)均高于40，屬于不穩(wěn)定蛋白，平均疏水性值均為負(fù)值，為親水性蛋白。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果顯示：總的可能被磷酸化的位點(diǎn)數(shù)19~24個(gè)，多肽鏈中絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，以及酪氨酸磷酸化位點(diǎn)的數(shù)目各不相同，其中，Pe14-3-3b和Pe14-3-3f可能被磷酸化的位點(diǎn)多達(dá)22和24個(gè)，說明被磷酸化的可能性比較高。

2.4.2毛竹Pe14-3-3非ε類基因二級結(jié)構(gòu)分析用SOPMA軟件分析Pe14-3-3蛋白的二級結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示（圖3），各蛋白中α-螺旋含量最高，大于60%，無規(guī)則卷曲含量約占15%~23%，β-轉(zhuǎn)角含量最低，僅在2.34%~4.76%，延伸鏈約為10%。4個(gè)蛋白中α-螺旋和無規(guī)則卷曲散布于整個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)，β-轉(zhuǎn)角零星分布其中，多在蛋白質(zhì)分子的表面，以改變多肽鏈的方向。其中Pe14-3-3c蛋白N端α-螺旋的含量明顯比其他3個(gè)少，Pe14-3-3e中β-轉(zhuǎn)角的含量最高（4.76%），推測其多肽鏈轉(zhuǎn)變方向更多，結(jié)構(gòu)可能更為復(fù)雜。

圖3　Pe14-3-3家族基因二級結(jié)構(gòu)的分布Figure 3 Predicted secondary structure among Pe14-3-3 family

3　討論

14-3-3基因家族是一類酸性的，可溶性蛋白，蛋白序列約250個(gè)氨基酸，通常以同源二聚體或異源二聚體存在［18］。研究發(fā)現(xiàn)：大豆Glycine max中有18個(gè)14-3-3基因，16個(gè)基因表達(dá)［19］，水稻中有8個(gè)14-3-3基因，且每個(gè)基因都表達(dá)［5］，擬南芥中有13個(gè)14-3-3基因，12個(gè)基因表達(dá)［12］。14-3-3蛋白廣泛存在于所有真核生物中，參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)各種生命代謝過程，如14-3-3蛋白對代謝過程的調(diào)節(jié)，14-3-3蛋白與植物的脅迫響應(yīng)等。基于公布的毛竹基因組數(shù)據(jù)庫［20］，本研究采用本地Blast在毛竹基因組數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)了8個(gè)14-3-3基因，同時(shí)在cDNA庫中也找到了8個(gè)cDNA序列，表明8個(gè)14-3-3基因均表達(dá)，但基因組序列上的8個(gè)基因與cDNA 8條序列不能完全匹配。本課題組在雷竹中也檢測到了14-3-3b，14-3-3c，14-3-3e，14-3-3f的表達(dá)（另文發(fā)表）。根據(jù)毛竹8個(gè)基因的序列設(shè)計(jì)引物，從倭竹族5個(gè)不同屬的代表種白紋陰陽竹、擺竹、毛竹、雞毛竹和唐竹中分別克隆了其中4個(gè)基因，14-3-3b，14-3-3c，14-3-3e，14-3-3f，這4個(gè)基因均屬于非ε類，同一基因在各竹種間序列同源性非常高，系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，14-3-3基因的直系同源基因同源性大于旁系同源基因，表明進(jìn)化過程中竹種間基因的變化比較小。

從表3的數(shù)據(jù)看，同一基因在不同竹種間的變異程度不同，14-3-3c基因的變異程度最小，各竹種間僅有2~4 bp的變異。而14-3-3f基因的變異程度最大，與毛竹中Pe14-3-3f相比，擺竹中Is14-3-3f缺失109 bp，表明14-3-3c基因受到的選擇壓力更大［21］。深入分析序列發(fā)現(xiàn)，插入或缺失的序列均存在非編碼區(qū)，表明該家族的基因在不同竹種中的功能還比較保守。然而通過對編碼區(qū)序列比對發(fā)現(xiàn)，各基因在不同竹種間存在比較多的SNP位點(diǎn)，其中82%的SNP位點(diǎn)會導(dǎo)致氨基酸變異，表明該家族基因既有一定的保守性，也會發(fā)生一定的變異。從核苷酸多樣性指數(shù)π數(shù)值看，14-3-3f最低，而14-3-3e最高，表明這幾個(gè)基因的多態(tài)性指數(shù)還存在一定差異。

竹類植物中存在豐富的SNP位點(diǎn)［22］，SNP位點(diǎn)的頻率因研究樣本及所研究基因而有差異，如tetra-tricopeptide-like helicaldomain-containing protein在剛竹屬不同竹種間可達(dá)1 SNP/6.3 bp［23］，PPO基因在紫竹Ph.nigra不同栽培類型間達(dá)1 SNP/10.5 bp［24］。本研究中14-3-3基因在不同屬間頻率平均為1 SNP/37.8 bp。不同物種間SNP位點(diǎn)的頻率差異也非常大，蘋果Malus pumila中每149 bp就有1個(gè)SNP位點(diǎn)［25］，核桃Juglans regia中CBF基因中每40 bp就有1個(gè)SNP位點(diǎn)［26］，茶樹Camellia sinenesis中每18.5 bp就有1 個(gè)SNP位點(diǎn)［27］。

從氨基酸序列的一級結(jié)構(gòu)看，14-3-3b，14-3-3c，14-3-3e和14-3-3f蛋白的理化性質(zhì)的差異并不大，等電點(diǎn)在4.75~4.90，平均疏水性型在－0.433~0.489，脂肪指數(shù)在85.33~88.31，主要由谷氨酸、丙氨酸和亮氨酸組成，總的可能被磷酸化的位點(diǎn)數(shù)達(dá)19~24個(gè)，表明該家族參與磷酸化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。二級結(jié)構(gòu)表明α-螺旋含量最高，β-轉(zhuǎn)角含量最低，而Pe14-3-3e中β-轉(zhuǎn)角的含量最高（4.76%），Pe14-3-3c的最低（2.34%），推測，Pe14-3-3e的多肽鏈轉(zhuǎn)變的方向更多，結(jié)構(gòu)可能更復(fù)雜。在Pe14-3-3c和Pe14-3-3f的蛋白結(jié)構(gòu)多肽鏈的C端，有一大段α-螺旋結(jié)構(gòu)，推測Pe14-3-3c和Pe14-3-3f的蛋白在此處存在下游基因結(jié)合位點(diǎn)。

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Single nucleotide polymorphism of non-ε 14-3-3 genes in Shibataeeae

XU Zaien,YU Yu,LI Bingjuan,CHEN Hongjun,GUO Xiaoqin
（The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture,Zhejiang A &F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China）

Abstract:To study the structure and single nucleotide polymorphism（SNP）of non-ε 14-3-3 in Shibataeeae,homologue genes from five bamboo species,Hibanobambusa tranquillans,Indosasa shibataeaoides,Phyllostachys edulis,Shibataea chinensis,and Sinobambusa tootsik were cloned with gDNA and cDNA sequences being compared.Results showed five exons and four introns with CDS sequence lengths（in bp）of 789,771,789,and 786,respectively.There were 21,19,26,and 17 SNP sites in 14-3-3b,14-3-3c,14-3-3e,and 14-3-3f coding regions,with SNP frequencies（in bp）of 1SNP/38,1SNP/41,1SNP/30,and 1SNP/46,respectively.Nucleotide diversity（π）for SNP’s was 0.015 21,0.012 17,0.010 98,and 0.009 16,in that order.The amino acid sequence identity for these same genes in different species was 99%.Four 14-3-3 putative proteins were hydrophilic,and their isoelectric point was distributed from 4.75 to 4.90 with the amino acids Ala,Ser,and Gly being abundant.Also,α-helixs and random coils in these proteins were the most plentiful;whereas,β-turns and extended strands were few.These results lay a foundation for deeper studies with biological functions of 14-3-3 in bamboo.［Ch,3 fig.3 tab.27 ref.］

Key words:molecular genetics;Shibataeeae;bamboo;14-3-3 gene family;single nucleotide polymorphism（SNP）

作者簡介：許在恩，從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail：413832642@qq.com。通信作者：郭小勤，副教授，博士，從事植物生物技術(shù)研究。E-mail：xqguo@zafu.edu.cn

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30901155）;浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（Y307499）

收稿日期：2015-03-04；修回日期：2015-04-02

doi:10.11833/j.issn.2095-0756.2016.01.011

中圖分類號：S795；Q75

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：2095-0756（2016）01-0080-08