謝　濤　戎　浩　蔣金金　孔月琴　冉麗萍　吳　健　王幼平

揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225009

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人工合成甘藍(lán)型油菜及其親本的甲基化變異模式分析

謝濤戎浩蔣金金*孔月琴冉麗萍吳健王幼平

揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225009

摘要:甘藍(lán)型油菜作為多倍體起源和發(fā)生的歷史較短,遺傳背景較為狹窄,人工合成甘藍(lán)型油菜可作為植物多倍化研究的優(yōu)選模型,本文以人工合成的甘藍(lán)型油菜為材料,通過(guò)HPLC分析發(fā)現(xiàn)白菜型油菜和甘藍(lán)的甲基化率分別為8.33％和15.88％,2個(gè)雜種株系的全基因組甲基化水平介于雙親之間,分別為10.29％和12.83％。MSAP分析發(fā)現(xiàn)雜種F1代及其親本的甲基化水平存在明顯差異(白菜型油菜<雜種F1<甘藍(lán)),雜種F1代的甲基化變異(23.71％)中來(lái)自A、C基因組的變異分別占6.60％和10.16％。MSAP差異性條帶的序列分析發(fā)現(xiàn)多倍化過(guò)程中與甲基化變化相關(guān)的基因參與了多種生物學(xué)過(guò)程,且差異甲基化基因在人工合成甘藍(lán)型油菜及其親本間的表達(dá)差異與甲基化修飾模式是一致的。本研究為了解甘藍(lán)型油菜多倍化過(guò)程中發(fā)生的表觀變異奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:甘藍(lán)型油菜;人工合成種;多倍化;甲基化

本項(xiàng)目由國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究計(jì)劃(973計(jì)劃)項(xiàng)目(2015CB150201),中國(guó)和江蘇省博士后基金(2014M561719,2015T80591,1401078B)資助。

This study was supported by the National Key Basic Research Program of China (2015CB150201),China and Jiangsu Postdoctoral Program (2014M561719,2015T80591,1401078B).

第一作者聯(lián)系方式:E-mail:18505143324@163.com,Tel:18505413324

多倍體化是植物進(jìn)化的重要原動(dòng)力,被子植物中約70％的植物在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷了至少一次多倍化事件[1]。近年來(lái)通過(guò)基因組研究和比較基因組序列分析發(fā)現(xiàn),很多先前認(rèn)為的典型二倍體植物(如擬南芥、水稻、大豆、玉米)究其來(lái)源也是古多倍體經(jīng)過(guò)一系列演化而形成的[2]。通過(guò)研究植物多倍體有助于開(kāi)發(fā)利用更多具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的多倍體植物資源。蕓薹屬(Brassica)是十字花科(Brassicaceae)中最為重要的一個(gè)屬,其中包括很多重要的經(jīng)濟(jì)作物。Nagahararu[3]證實(shí)該屬包括白菜型油菜(B.rapa,AA,2n = 20)、黑芥(B.nigra,BB,2n = 16)和甘藍(lán)(B.oleracea,CC,2n = 18) 3個(gè)二倍體基本種,以及由3個(gè)基本種通過(guò)雜交和自然加倍形成的甘藍(lán)型油菜(B.napus,AACC,2n = 38)、埃塞俄比亞芥(B.carinata,BBCC,2n = 34)和芥菜型油菜(B.juncea,AABB,2n = 36) 3個(gè)異源四倍體種。其中甘藍(lán)型油菜的起源和馴化歷史較短,但現(xiàn)已成為世界上僅次于大豆的第二大油料作物[4]。然而,狹窄的遺傳基礎(chǔ)也限制了甘藍(lán)型油菜的發(fā)展[5]。白菜型油菜和甘藍(lán)的品種較多,且農(nóng)藝性狀變異較大,利用白菜型油菜、甘藍(lán)對(duì)甘藍(lán)型油菜進(jìn)行改良是一個(gè)重要的育種途徑[6-7]。通過(guò)人工合成甘藍(lán)型油菜可以對(duì)其多倍化形成機(jī)制進(jìn)行研究,這也是拓寬甘藍(lán)型油菜遺傳基礎(chǔ)的重要途徑之一[8-10]。目前已有很多關(guān)于人工合成甘藍(lán)型油菜的報(bào)道,且這些人工合成甘藍(lán)型油菜在早期世代具有很多優(yōu)異的農(nóng)藝性狀[8,11]。

植物多倍體基因組中來(lái)自不同親本的大量重復(fù)基因在多倍化過(guò)程中會(huì)發(fā)生基因沉默或產(chǎn)生新的功能基因等[8,12-13]。研究表明,異源多倍體油菜、小麥、黃瓜等的基因組在多倍化過(guò)程中均發(fā)生了大量變化,以維持新形成多倍體基因組的穩(wěn)定性,包括基因的選擇性丟失或沉默[14-15]、染色體重排[16]等。此外,異源多倍體基因組的穩(wěn)定性還有賴于表觀遺傳修飾,目前多倍體表觀遺傳現(xiàn)象中研究最透徹的是甲基化[17]。研究發(fā)現(xiàn),很多異源多倍體的重復(fù)及低拷貝序列的甲基化狀態(tài)和基因表達(dá)與親本基因組存在很大差異[18]。DNA甲基化除了與人工合成異源多倍體中的快速變化密切相關(guān),也參與新合成異源多倍體的穩(wěn)定及進(jìn)化[19-21]。Lukens等[18]對(duì)新合成甘藍(lán)型油菜S0代表觀遺傳變異分析發(fā)現(xiàn),48％的CpG甲基化位點(diǎn)在親本之間存在差異,人工合成多倍體中存在甲基化位點(diǎn)的基因組偏好性;Xu等[22]通過(guò)甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(MSAP)分析發(fā)現(xiàn),甘藍(lán)型油菜異源多倍體化過(guò)程中,雜種后代與親本相比有6.84％基因發(fā)生甲基化變異,其中1.94％的變異與多倍化過(guò)程相關(guān);Gaeta等[8]發(fā)現(xiàn)人工合成甘藍(lán)型油菜S0代中A、C基因組的甲基化變異是一致的,但隨后的5個(gè)世代中A基因組特異的甲基化變異遠(yuǎn)高于C基因組,這表明異源多倍體的甲基化修飾存在基因組偏好性。此外,研究發(fā)現(xiàn)人工合成甘藍(lán)型油菜中發(fā)生表觀修飾的變異是非常廣泛的,包括反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子、編碼基因、非編碼DNA。Xu等[22]認(rèn)為異源多倍化過(guò)程中的甲基化變異可以在全基因組范圍內(nèi)發(fā)生,且19％的甲基化修飾發(fā)生在轉(zhuǎn)座子區(qū)域,這表明異源多倍體過(guò)程伴隨著對(duì)反轉(zhuǎn)座子頻繁的表觀遺傳修飾作用。此外,Gaeta等[8]發(fā)現(xiàn)大多數(shù)S0代的甲基化變異在隨后的S5代中得以保持,但也有一部分甲基化修飾未能穩(wěn)定遺傳。

本實(shí)驗(yàn)室前期以白菜型油菜為母本、甘藍(lán)為父本,通過(guò)胚胎挽救的方法獲得了人工合成甘藍(lán)型油菜,可作為研究甘藍(lán)型油菜多倍化的實(shí)驗(yàn)材料。該多倍體具有分枝部位降低、分枝數(shù)多等優(yōu)良性狀。本研究擬通過(guò)高效液相色譜(HPLC)和MSAP技術(shù),比較分析人工合成甘藍(lán)型油菜F1代、二倍體親本的甲基化水平,為了解甘藍(lán)型油菜多倍化過(guò)程中發(fā)生的表觀變異奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

白菜型油菜(Brassica rapa,AA,2n = 20)品種揚(yáng)州青、甘藍(lán)(B.oleracea,CC,2n = 18)品種永綠7號(hào)由江蘇省里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供,由上述二倍體雜交而來(lái)的人工合成甘藍(lán)型油菜F1代(B.napus,AACC,2n = 38)由本實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)制并保存。

1.2用HPLC法分析材料全基因組DNA甲基化水平

取母本揚(yáng)州青、父本永綠7號(hào)、人工合成甘藍(lán)型油菜F1代的苗期葉片,每個(gè)品種取3個(gè)單株作為重復(fù),通過(guò)CTAB法[23]提取全基因組DNA。參照Demeulemeester等[24]的方法,向裝有50 μg DNA的玻璃管中加入300 μL高氯酸,沸水浴1 h裂解,然后用1 mol L-1KOH溶液將pH值調(diào)整至3～5,在形成KClO4沉淀后取上清液,13 523×g離心5 min后,吸取上清液待測(cè)。室溫下將DNA裂解液通過(guò)自動(dòng)加樣器進(jìn)樣至Agilent 1200型高效液相色譜儀(USA) 的Alltima C18色譜柱(5 μm,250.0 mm × 4.6 mm)中,柱溫箱溫度為40℃,以10％甲醇、0.1 mol L-1戊烷磺酸鈉和0.2％三乙胺的混合液(pH 4.0)為流動(dòng)相,洗脫速度為0.8 mL min-1,紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為273 nm。以胞嘧啶(C)和5-MeC標(biāo)樣為對(duì)照,通過(guò)計(jì)算5-MeC摩爾數(shù)/(5-MeC摩爾數(shù)+C摩爾數(shù))的百分比檢測(cè)基因組DNA中5-MeC的含量(DNA甲基化水平),每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.3人工合成甘藍(lán)型油菜及其親本的MSAP分析

同上所述,通過(guò)CTAB法提取母本揚(yáng)州青、父本永綠7號(hào)、人工合成甘藍(lán)型油菜F1代的全基因組DNA,每個(gè)試驗(yàn)材料取3株重復(fù)的DNA進(jìn)行混池。參考Xu等[22]的MSAP分析方法稍作修改。用EcoR I (15 U)/Msp I (10 U)和EcoR I (15 U)/Hpa II (10 U)兩組限制性內(nèi)切酶對(duì)每個(gè)樣品分別雙酶切。MSAP分析所用接頭、預(yù)擴(kuò)增、選擇擴(kuò)增引物見(jiàn)表1。酶切產(chǎn)物與10 pmol EcoR I接頭和10 pmol Hpa II/Msp I接頭連接。利用表1中的預(yù)擴(kuò)增引物對(duì)上述連接產(chǎn)物預(yù)擴(kuò)后,以預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物為模板、表1中的選擇性擴(kuò)增引物PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8％聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測(cè),統(tǒng)計(jì)分析條帶。MSAP條帶用“+”和“-”分別代表“有帶”和“無(wú)帶”,據(jù)此可以將條帶分為(+,+)、(+,-)、(-,+)和(-,-) 4種類型。

1.4甲基化差異條帶的克隆與測(cè)序

將MSAP檢測(cè)的差異片段切下、裝至EP管內(nèi),加入200 μL TE,浸泡30 min,棄上層液體,重復(fù)同樣的操作2次;再加入30 μL ddH2O,煮沸10 min,然后用槍頭搗碎膠塊,煮沸10 min后,1286×g離心15 min,上清液即為回收產(chǎn)物。膠回收產(chǎn)物經(jīng)pMD19-T Vector (TaKaRa,Code:D102A)進(jìn)行TA克隆后,利用相應(yīng)的選擴(kuò)引物對(duì)單克隆進(jìn)行PCR檢測(cè),選取陽(yáng)性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。對(duì)所得序列在甘藍(lán)型油菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)中進(jìn)行同源性檢索。

1.5甲基化差異條帶的qRT-PCR分析

采用RNAiso plus試劑盒(TaKaRa)提取母本揚(yáng)州青、父本永綠7號(hào)、人工合成甘藍(lán)型油菜F1代苗期葉片的總RNA。20～50 μg總RNA中加入6 μL 10×DNase I緩沖劑(TaKaRa)、4 μL DNase I (RNase-free,5 U μL-1) (TaKaRa)、0.8 μL RNase抑制劑(40 U μL-1)進(jìn)行基因組DNA消化。通過(guò)Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche)合成cDNA。qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μL,包括1 μL cDNA、正反引物(表2)各0.3 μmol L-1、10 μL FastStart Universal SYBR Green Master (ROX,Roche)。反應(yīng)程序?yàn)?0℃ 2 min,95℃ 10 min;40個(gè)循環(huán)反應(yīng)95℃15 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s。使用96孔板(Bio-Rad Laboratories)于ABI 7500 System (Applied Biosystems)上進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。內(nèi)參為甘藍(lán)型油菜β-actin (NCBI AF111812),以2-ΔΔCt法分析各基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1　MSAP分析所用接頭和引物序列Table 1　The sequences of adapters and primers in MSAP analysis

表2　qRT-PCR分析所用引物Table 2　Primers for qRT-PCR analysis

2　結(jié)果與分析

2.1人工合成甘藍(lán)型油菜F1代及其親本的全基因組甲基化水平分析

以胞嘧啶/5-甲基胞嘧啶為標(biāo)準(zhǔn)品,通過(guò)HPLC技術(shù)對(duì)人工合成甘藍(lán)型油菜F1代、二倍體親本的全基因組甲基化水平分析(圖1),發(fā)現(xiàn)揚(yáng)州青的全基因組甲基化率為8.33％,永綠7號(hào)的甲基化率為15.88％;而新合成的異源四倍體甘藍(lán)型油菜F1代2個(gè)株系(F1-1、F1-2)的甲基化率分別為10.29％和12.83％ (圖2),都與親本存在顯著差異。雜種后代的甲基化水平相對(duì)于揚(yáng)州青呈上升趨勢(shì),但未達(dá)到永綠7號(hào)的甲基化水平。

不同生物基因組中DNA甲基化胞嘧啶所占比率存在較大的差異,某些動(dòng)物如線蟲(chóng)中不含甲基化胞嘧啶,昆蟲(chóng)中占0～3％,哺乳類和鳥(niǎo)類占5％,兩棲類和魚(yú)類占10％,但在有些植物中能達(dá)到30％。對(duì)于同種生物的不同組織和器官,或者同一組織的不同發(fā)育階段,甲基化胞嘧啶所占的比率也可能存在差異[25]。DNA甲基化胞嘧啶的分布存在種屬特異性以及組織特異性,并可隨生物發(fā)育階段的不同而發(fā)生改變[26-27]。本研究中,白菜型油菜揚(yáng)州青以及甘藍(lán)永綠7號(hào)是蕓薹屬的2個(gè)二倍體物種,而由這2個(gè)親本雜交所獲得的甘藍(lán)型油菜是屬于蕓薹屬異源四倍體物種。利用HPLC對(duì)二倍體白菜型油菜、甘藍(lán)及其雜種F1代的同一發(fā)育階段、同一組織進(jìn)行DNA甲基化分析,結(jié)果顯示三者的DNA甲基化率存在明顯的差異,且A基因組的全基因組甲基化率明顯小于C基因組的甲基化率,而人工合成甘藍(lán)型油菜的甲基化率高于母本白菜型油菜、低于父本甘藍(lán),這可能是由于雜種植株的基因組同時(shí)包含了A、C兩套基因組,同源染色體組在形成多倍體的過(guò)程中發(fā)生了復(fù)雜的表觀遺傳修飾,以維持多倍體基因組的穩(wěn)定性。

2.2人工合成甘藍(lán)型油菜F1代及其親本的MSAP分析

選用68對(duì)引物對(duì)揚(yáng)州青、合成種F1代(2.1中甲基化比率較高的株系)、永綠7號(hào)進(jìn)行MSAP分析,共統(tǒng)計(jì)1181個(gè)條帶,根據(jù)條帶的不同類型可分為7大類(圖3),a類,片段類型同A基因組(136條),包括9個(gè)亞類;b類,片段類型同C基因組(107條),也包括9個(gè)亞類;c類,包括所有的其他疊加類型(658 條),共3個(gè)亞類;d類,包括3個(gè)亞類,只有A基因組條帶發(fā)生變化(78條);e類,包括3個(gè)亞類,只有C基因組發(fā)生變化(120條);f類,包括3個(gè)亞類,A和C基因組條帶都發(fā)生了變化(25條),其中一個(gè)類型條帶較弱未顯示;g類,包括3個(gè)亞類,甲基化變化不屬于A和C基因組,即出現(xiàn)了新增條帶(57條)。根據(jù)甲基化變異類型可將上述7大類歸結(jié)為2種類型:①甲基化疊加型,包括a、b、c三個(gè)大類;②甲基化變化型:包括d、e、f、g四種。綜上,雜種F1的甲基化變化率為23.71％,其余76.29％只是親本條帶的簡(jiǎn)單疊加,A基因組的甲基化變異為6.60％,C基因組的變化(10.16％)明顯高于A基因組。此外,M位點(diǎn)(全甲基化)變化率占總變化的28.21％,而H位點(diǎn)(半甲基化)占40％,2個(gè)位點(diǎn)都發(fā)生變化的比率為31.79％ (表3)。雜種F1代的DNA甲基化類型發(fā)生變化的比率占23.71％。

圖1　高效液相圖譜鑒定全基因組甲基化水平Fig.1　Methylation level of whole genome by HPLC analysisA:甲基化標(biāo)準(zhǔn)品;B:待測(cè)樣品;白色箭頭:胞嘧啶峰;黑色箭頭:5-甲基胞嘧啶峰。A:methylation standards;B:sample for analysis;White arrow:cytosine peak;Black arrow:5-methylcytosine peak.

圖2　雜種F1代及親本的甲基化水平Fig.2　DNA methylation rate in synthesized B.napus (F1) and parents標(biāo)以不同字母的柱值在0.05水平上差異顯著,n = 3。Bars superscripted by different letters are significantly different at the 0.05 probability level,n = 3.

根據(jù)甲基化水平差異對(duì)所有MSAP條帶統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),揚(yáng)州青、永綠7號(hào)及雜種植株F1所擴(kuò)增總條帶數(shù)差異很小,揚(yáng)州青的總甲基化率最低(20.34％),永綠7號(hào)的總甲基化率最高(22.44％),雜種植株F1的總甲基化率介于兩者之間(21.40％)。其中全甲基化率與該趨勢(shì)一致,半甲基化率則是雜種植株中最高,揚(yáng)州青次之,永綠7號(hào)最低(表4)。揚(yáng)州青和雜種F1代植株的半甲基化率高于全甲基化率,而永綠7號(hào)的全甲基化率高于半甲基化率,由此推測(cè)前者基因組CCGG位點(diǎn)發(fā)生甲基化的方式主要是以單鏈外側(cè)胞嘧啶甲基化(mCCGG)為主,后者基因組主要以雙鏈內(nèi)部胞嘧啶甲基化(CmCGG)為主。

2.3MSAP差異條帶的克隆與定量分析

對(duì)MSAP分析的多態(tài)性片段進(jìn)行TA克隆、測(cè)序,共獲得19個(gè)MSAP差異條帶的序列信息,將測(cè)序結(jié)果在甘藍(lán)型油菜數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.brassica.info/)中進(jìn)行基因的同源性比對(duì),比對(duì)結(jié)果在擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.arabidopsis.org/)中進(jìn)行基因的功能比對(duì),推測(cè)差異條帶的具體功能信息(表5)。由比對(duì)信息可知,甘藍(lán)型油菜人工合成過(guò)程中所涉及的基因包括半胱氨酸/組氨酸C1域家族蛋白、RING/U盒蛋白超家族、CCT修飾家族蛋白、類GDSL脂肪酶/乙酰水解酶蛋白超家族、F-盒/類RNI/類FBD結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)、液泡蛋白排序55 (VPS55)家族蛋白、絲氨酸蛋白酶抑制劑家族蛋白、蛋白激酶家族蛋白、類FRIGIDA家族蛋白、類絲氨酸羧肽酶50、類TRAF蛋白超家族,以及IAA氨基酸、蛋白激酶APK2b、KCS8、類SABP2 (水楊酸甲酯酯酶)蛋白的編碼基因。

圖3　人工合成甘藍(lán)型油菜F1代植株及其親本的甲基化條帶類型Fig.3　DNA methylation patterns in resynthesized B.napus (F1) and diploid parentsa1～a9:來(lái)自A基因組(白菜)的片段;b1～b9:來(lái)自C基因組(甘藍(lán))的片段;c1～c3:所有其他MSAP條帶疊加類型;d1～d3:只有A基因組發(fā)生改變的條帶;e1～e3:只有C基因組發(fā)生改變的條帶;f1～f2:來(lái)自A和C基因組的條帶;g1～g3:雜種后代特異的甲基化條帶。a1-a9:fragments inherited from A genome (B.rapa);b1-b9:fragments inherited from C genome (B.oleracea);c1-c3:the other additive patterns of MSAP profiles;d1-d3:A genome-specific methylation changes;e1-e3:C genome-specific methylation changes;f1-f2:methylation changes derived from both A and C genomes;g1-g3:hybrid specific methylation changes.

對(duì)上述測(cè)序成功的MSAP差異片段在人工合成甘藍(lán)型油菜(F1代)及其二倍體親本中的表達(dá)量分析(圖4)發(fā)現(xiàn),Bn1、Bn4、Bn7、Bn8、Bn10等在雜種F1代植株中發(fā)生去甲基化修飾的基因,在雜種F1中的表達(dá)量高于雙親或介于兩親本之間;Bn14、Bn15、Bn16、Bn18等在雜種植株中發(fā)生高甲基化的基因,在雜種植株中的表達(dá)量均介于兩親本之間。Bn1的同源基因編碼半胱氨酸/組氨酸C1域家族蛋白,是一種鋅指結(jié)構(gòu)域。該蛋白可通過(guò)與RNA和DNA結(jié)合,參與調(diào)控植物細(xì)胞的凋亡和應(yīng)激反應(yīng)(如抗病反應(yīng))[28]。該基因在雜種F1代與親本相比表現(xiàn)為低甲基化修飾,但該基因在雜種F1代的表達(dá)水平介于雙親之間,且親本AA中Bn1的表達(dá)量最高,推測(cè)親本AA對(duì)外源病菌(如野油菜黃單胞菌)的抗性可能高于父本CC,且雜種F1代的抗性介于雙親之間。Bn4的同源基因同樣編碼半胱氨酸/組氨酸C1域家族蛋白,但該基因在雜種F1代的表達(dá)量顯著高于父本CC,且其中株系F1-1中Bn4的表達(dá)量高于母本AA。通過(guò)對(duì)雜種后代中Bn1/Bn4的表達(dá)變化分析表明,異源四倍體中相關(guān)抗性基因的表達(dá)水平發(fā)生了變化,這對(duì)于甘藍(lán)型油菜的品質(zhì)改良有重要的意義。但雜種后代的這種基因表達(dá)變異是否優(yōu)于現(xiàn)有甘藍(lán)型油菜品種還有待后續(xù)研究。Bn7在雜種F1代和親本之間的甲基化修飾模式、基因表達(dá)變化與Bn1是一致的。Bn8的同源基因編碼類GDSL脂肪酶/乙酰水解酶蛋白超家族,該基因在甘藍(lán)型油菜的非生物脅迫應(yīng)答、生物脅迫應(yīng)答、以及種子發(fā)育和脂質(zhì)代謝中發(fā)揮著不可忽視的重要作用[29]。Bn8在雜種F1代與親本相比表現(xiàn)為低甲基化修飾,且該基因在母本AA中的表達(dá)量最高,雜種F1代中的表達(dá)量略高于父本CC。Bn10的同源基因編碼F-box結(jié)構(gòu)域蛋白,對(duì)植物調(diào)節(jié)蛋白的降解起著重要的調(diào)控作用,在一些重要的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)和信號(hào)通路中發(fā)揮重要的功能[30]。Bn10在雜種F1代與親本相比表現(xiàn)為去甲基化修飾,且其在F1代的表達(dá)水平介于雙親之間,親本AA中的表達(dá)量最高。最近有研究報(bào)道,很多與晝夜調(diào)節(jié)相關(guān)的基因在白菜型油菜的全基因三倍化過(guò)程中得到了選擇性的保留,但編碼F-box蛋白的基因家族(ZEITLUPE)卻是例外[31]。Bn14編碼絲氨酸蛋白酶抑制劑家族蛋白,前人研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)絲氨酸蛋白酶抑制基因(如MTI-2)可以提高甘藍(lán)型油菜對(duì)小菜蛾的抵御能力[32]。本研究發(fā)現(xiàn)雜種F1代中Bn14與親本相比發(fā)生超甲基化修飾,其在雜種F1代的表達(dá)量顯著低于父本CC,與母本AA無(wú)顯著差異,由此推測(cè),父本CC對(duì)某些生物脅迫的抵御能力可能優(yōu)于母本AA和雜種后代。Bn15編碼類FRIGIDA家族蛋白,最新研究發(fā)現(xiàn),該基因可以在長(zhǎng)日照條件下通過(guò)調(diào)節(jié)開(kāi)花基因的表達(dá)延遲擬南芥的開(kāi)花時(shí)間[33]。本研究發(fā)現(xiàn)雜種F1代中該基因的表達(dá)水平明顯高于父本CC,但低于母本AA。該基因在不同材料中的表達(dá)差異是否與它們的花期差異有關(guān)還有待進(jìn)一步研究。Bn16編碼蛋白激酶家族蛋白,參與的生物學(xué)功能比較廣泛,其在F1代表現(xiàn)為超甲基化修飾,且在F1中的表達(dá)量介于雙親之間。Bn18編碼類絲氨酸羧肽酶50,該蛋白的脂肪酰轉(zhuǎn)移酶可以催化油菜籽中芥子酸酯類化合物的形成[34]。本研究發(fā)現(xiàn)該基因在雜種F1中發(fā)生超甲基化修飾,其在父本CC中的表達(dá)量最高,雜種株系F1-1中Bn18的表達(dá)量介于雙親之間。

表3　人工合成甘藍(lán)型油菜F1代植株及其二倍體親本的甲基化模式Table 3　Patterns of methylation in resynthesized B.napus (F1) and its diploid parents

表4　人工合成甘藍(lán)型油菜F1代植株及其親本的DNA甲基化水平Table 4　DNA methylation level in resynthesized B.napus (F1) and diploid parents

圖4　人工合成甘藍(lán)型油菜F1代及其親本的甲基化差異片段的qRT-PCR分析Fig.4　qRT-PCR analysis of genes with different methylation patterns in resynthesized B.napus (F1) and diploid parents標(biāo)以不同字母的柱值在0.05水平上差異顯著,n = 3。Bars superscribed by different letters are significantly different at the 0.05 probability level,n = 3.

3　討論

異源四倍體甘藍(lán)型油菜是研究植物多倍化的良好模型,但天然多倍體的遺傳背景不清晰,通過(guò)人工合成甘藍(lán)型油菜可以對(duì)其多倍化形成機(jī)制進(jìn)行研究[10]。目前,已有很多關(guān)于人工合成甘藍(lán)型油菜的報(bào)道,且這些人工合成甘藍(lán)型油菜在早期世代具有很多優(yōu)異的農(nóng)藝性狀[8]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)HPLC技術(shù)分析,發(fā)現(xiàn)雜種后代(10.29％和12.83％)的甲基化水平介于母本揚(yáng)州青(8.33％)和父本永綠7號(hào)(15.88％)之間;MSAP分析發(fā)現(xiàn),揚(yáng)州青(20.34％)、永綠7號(hào)(22.44％)及雜種植株F1(21.40％)的總甲基化率差異很小。在植物基因組中,胞嘧啶甲基化通常發(fā)生在CAG、CTG和CCG位點(diǎn),HPLC分析所檢測(cè)的是全基因組水平的胞嘧啶甲基化;而MSAP分析只能揭示CG或部分CCG位點(diǎn)的甲基化修飾,無(wú)法揭示CAG和CTG三核苷酸殘基中胞嘧啶的甲基化程度以及其他堿基的胸嘧啶甲基化水平。此外,MSAP中每一個(gè)酶切和擴(kuò)增位點(diǎn)可能包括同一序列的多個(gè)重復(fù)。因此,MSAP分析得到的DNA甲基化水平往往低于實(shí)際情況[35]。此外,雜種F1代的DNA甲基化類型發(fā)生變化的比率占23.71％,這有別于前人的研究。Lukens等[18]發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜中48.0％ CpG甲基化位點(diǎn)發(fā)生改變;而Xu等[25]研究發(fā)現(xiàn)玫瑰離體分化的甲基化變化率是6.8％。異源四倍體擬南芥中甲基化模式變化比率占8.3％[36];異源四倍體小麥中該比率是6.9％[21];水稻栽培種雜交后代中4.1％甲基化位點(diǎn)發(fā)生變化[37];而高狐草×小麥屬間雜種的不同株系的甲基化變化率在1.6％～9.2％之間[38];米草雜種中則有高達(dá)30％的變化比率[39]。Shaked等[21]研究發(fā)現(xiàn),小麥和甘藍(lán)型油菜多倍體中的甲基化變異存在基因組偏好性。甘藍(lán)型油菜中甲基化變異的基因組偏好性表現(xiàn)為:若雜種細(xì)胞質(zhì)來(lái)自A基因組,則甲基化優(yōu)先出現(xiàn)于C基因組,反之亦然[8,25]。本研究的統(tǒng)計(jì)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)雜種F1代種源自母本白菜型油菜的甲基化變化(6.6％)低于C基因組甲基化(10.16％),這與前人的研究結(jié)果是一致的。

我們通過(guò)對(duì)MSAP分析所獲甲基化修飾基因進(jìn)行表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因在F1代中的表達(dá)量介于雙親之間,這可能與多倍化過(guò)程中的遺傳修飾和表觀遺傳修飾相關(guān)。Gaete等[40]認(rèn)為甲基化修飾并不是引起人工合成甘藍(lán)型油菜(S0代)基因組水平基因表達(dá)變異的主要機(jī)制,而多倍化過(guò)程中的基因重組是引起基因表達(dá)變異的主要原因。本文所發(fā)現(xiàn)F1代基因表達(dá)水平介于雙親之間,這除了與甲基化修飾相關(guān)外,可能與多倍化過(guò)程中的染色體重組、基因片段的丟失、轉(zhuǎn)座等相關(guān)。此外,雜種F1代中基因表達(dá)水平高于親本AA或CC,據(jù)此推測(cè)雜種后代的某些性狀優(yōu)于親本AA或CC,這種雜種植株與任一親本相比具有優(yōu)勢(shì)、或雜種后代某些性狀優(yōu)于雙親均值的現(xiàn)象也屬于雜種優(yōu)勢(shì)[41],具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

4　結(jié)論

發(fā)現(xiàn)大量在多倍化過(guò)程中發(fā)生甲基化修飾變異的條帶,這些基因在雜種后代及雙親之間均存在表達(dá)差異,為了解甘藍(lán)型油菜多倍化過(guò)程中發(fā)生的表觀變異奠定了基礎(chǔ)。

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Analysis of DNA Methylation Patterns in Resynthesized Brassica napus and Diploid Parents

XIE Tao,RONG Hao,JIANG Jin-Jin*,KONG Yue-Qin,RAN Li-Ping,WU Jian,and WANG You-Ping
College of Bioscience and Biotechnology,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China

Abstract:The genetic background of Brassica napus,one of the most important oil crops in China,is relatively narrow due to the short history of its polyploid origin.Resynthesized B.napus provides an optimal model for researches on plant polyploidization.In the present study,we compared the DNA methylation levels in synthesized B.napus (F1generation) and diploid parents using high-performance liquid chromatography (HPLC) and DNA methylation-sensitive amplification polymorphism (MSAP) analysis.HPLC analysis indicated methylation rates of 8.33％ and 15.88％ in B.rapa and B.oleracea,respectively.While the methylation rate of two hybrids was 10.29％ and 12.83％,which were in-between of the parents’ values.MSAP analysis proved the different methylation levels in F1generation and diploids,with the lowest and highest methylation levels identified in B.rapa and B.oleracea,respectively.Variance of the DNA methylation in F1was 23.71％,among which 6.60％ and 10.16％ were inherited from A and C genome,respectively.Sequence analysis of MSAP polymorphic fragments indicated genes involved in multiple molecular functions were changed during polyploidization.Expression analysis of these genes agreed to the corresponding methylation changes.This study provides preliminary basis for understanding epigenetic variations during B.napus polyploidization.

Keywords:Bassica napus;Resynthesized species;Polyploidization;DNA methylation

收稿日期Received():2015-08-27;Accepted(接受日期):2016-01-11;Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期):2016-01-25.

*通訊作者(

Corresponding author):蔣金金,E-mail:jjjiang@yzu.edu.cn,Tel:0514-87997303

DOI:10.3724/SP.J.1006.2016.00513