導(dǎo)入外源玉米C4型NADP-ME基因?qū)π←湽夂闲艿挠绊?/h1>
2016-04-27 07:11:41王永霞杜新華許為鋼齊學(xué)禮王會偉琳南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室江蘇南京0095河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所河南省小麥生物學(xué)重點實驗室河南鄭州45000
作物學(xué)報 2016年4期 關(guān)鍵詞：凈光合速率
王永霞 杜新華 許為鋼,* 齊學(xué)禮 李 艷 王會偉 胡 琳南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室,江蘇南京 0095;河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所/河南省小麥生物學(xué)重點實驗室,河南鄭州 45000
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導(dǎo)入外源玉米C4型NADP-ME基因?qū)π←湽夂闲艿挠绊?/p>
王永霞1,2杜新華1,2許為鋼1,2,*齊學(xué)禮2李艷2王會偉2胡琳21南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室,江蘇南京 210095;2河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所/河南省小麥生物學(xué)重點實驗室,河南鄭州 450002
摘要:為研究玉米C4型NADP-ME基因?qū)π←湽夂咸匦缘挠绊?以T3代轉(zhuǎn)NADP-ME基因小麥株系10T(9)-1-1和10T(9)-225-4及其對照周麥23為試材,進行了分子特征鑒定、光合生理特性分析和單株產(chǎn)量性狀調(diào)查,并對其作用機制進行了初步解析。結(jié)果表明,外源基因已整合到轉(zhuǎn)基因小麥的基因組中,并能正確轉(zhuǎn)錄和翻譯;與對照周麥23相比,兩個轉(zhuǎn)基因株系在4個測定時期旗葉NADP-ME酶活性均明顯提高,而旗葉凈光合速率(Pn)則明顯下降;尤其在花后第7 天,兩個轉(zhuǎn)基因株系的酶活性較對照分別提高1.33倍和1.13倍,Pn分別較對照下降17.26％和10.35％;千粒重和籽粒產(chǎn)量較對照均顯著下降。與對照周麥23相比,轉(zhuǎn)基因株系10T(9)-225-4利用強光和同化CO2能力下降,光合效率下降;旗葉氣孔張開率和氣孔導(dǎo)度均顯著下降;蘋果酸含量降低了5.6％,丙酮酸含量則提高了17.1％;外施蘋果酸可恢復(fù)其光合速率。以上研究結(jié)果表明,玉米C4型NADP-ME基因的導(dǎo)入降低了小麥的光合特性,蘋果酸含量降低引起的氣孔導(dǎo)度下降可能是導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因小麥光合效能降低的原因。
關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)基因小麥;NADP蘋果酸酶;凈光合速率;氣孔導(dǎo)度
本研究由國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(2011ZX08002-003)和國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-3-1-9)資助。
This study was supported by the National GMO Program of China (2011ZX08002-003) and the China Agriculture Research System (CARS-3-1-9).
第一作者聯(lián)系方式:E-mail:wangyongxia005@163.com,Tel:0371-65721637
長期以來,許多科學(xué)家都在努力將C4作物的高光效關(guān)鍵基因引入水稻、小麥等C3作物中,試圖利用C4型高光效基因來改良C3作物光合作用的內(nèi)在遺傳基礎(chǔ),使之具備高光效特性,從而大幅度提高光合效率,實現(xiàn)生物學(xué)產(chǎn)量和籽粒產(chǎn)量的同步提高[1-2]。隨著分子生物學(xué)和植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的快速發(fā)展,通過基因工程手段將C4途徑光合關(guān)鍵酶基因?qū)隒3植物中,在國內(nèi)外已取得了顯著進展[3-4]。特別是在水稻、小麥、煙草等植物中轉(zhuǎn)入C4途徑高光效關(guān)鍵基因PEPC和PPDK,并獲得高效表達的轉(zhuǎn)基因植株的成功報道[5-16],為進一步提升C3植物產(chǎn)量潛力開辟了一條新的道路。NADP-ME也是C4途徑的關(guān)鍵酶之一,具有催化蘋果酸脫羧,釋放的CO2富集在Rubisco周圍,從而促進Rubisco的羧化反應(yīng),降低其加氧反應(yīng),提高光合作用效率作用。Ku等[17]認為NADP-ME基因的活性與光呼吸的速率呈負相關(guān),將NADP-ME基因轉(zhuǎn)入C3植物,可能是降低C3植物的光呼吸,提高其光合效率的一種有效途徑。目前,已成功的將C4型NADP-ME基因?qū)氲綌M南芥、煙草和水稻等上C3植物上,但大多數(shù)結(jié)果是對光合產(chǎn)量的提高無實質(zhì)性的效果[18-23]。Tsuchida等[21]發(fā)現(xiàn)在過量表達玉米葉綠體NADP-ME cDNA的水稻轉(zhuǎn)化體中,NADP-ME酶活性比對照增加30倍左右,轉(zhuǎn)化體葉色變白并且生長明顯受到抑制。遲偉等[22]研究結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)高粱C4型NADP-ME cDNA的轉(zhuǎn)基因水稻植株中,NADP-ME酶活性比對照提高了1～7倍,但光合速率沒有提高。Laporte等[23]發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)玉米NADP-ME基因的煙草的氣孔導(dǎo)度與NADP-ME的水平成反比,轉(zhuǎn)基因水稻的水分利用效率(鮮重/水耗)比野生型高15％～20％。截至目前,外源C4型NADP-ME基因?qū)π←湽夂闲艿挠绊懠捌錂C制研究尚未見報道。
本課題組從玉米高光效材料中分離了C4型NADP-ME基因的cDNA序列[24],并將其導(dǎo)入擬南芥[25]和小麥中。本研究以T3代轉(zhuǎn)玉米C4型NADP-ME基因小麥株系為材料,研究該基因在小麥基因組中的整合與表達情況,光合生理特性和產(chǎn)量性狀的表現(xiàn),并對其影響機制進行了初步解析,為合理利用C4型NADP-ME基因改良C3作物光合效能提供依據(jù)。
1 材料與方法
1.1轉(zhuǎn)基因小麥獲得
從玉米高光效自交系Z1194中分離了C4型NADP-ME基因的cDNA序列[24],將其構(gòu)建到含35S啟動子的雙元表達載體pCambia3301中,通過基因槍法導(dǎo)入普通小麥品種周麥23中,獲得的T3代轉(zhuǎn)NADP-ME基因小麥株系10T(9)-1-1和10T(9)-225-4為試驗材料。
2012年10月,將各轉(zhuǎn)基因小麥株系和對照周麥23種植于國家黃淮海轉(zhuǎn)基因小麥中試基地(河南原陽,35°00′ N,113°40′ E),每系行長2 m,行距25 cm,株距10 cm。田間常規(guī)管理。
1.2轉(zhuǎn)基因小麥的分子特征鑒定
1.2.1Southern雜交檢測2013年4月7日,取拔節(jié)期小麥葉片3 g,用改良的CTAB法提取基因組DNA[26]。取150 μg基因組DNA和50 ng質(zhì)粒DNA,使用限制性內(nèi)切酶Xbal I酶切消化,純化后電泳分離,轉(zhuǎn)移至尼龍膜(N+)上。以質(zhì)粒pCambia3301-NADP-ME為模板,使用引物擴增520 bp的 NADP-ME基因片段為探針標(biāo)記模板。取外源基因探針模板1 μL,用DIG標(biāo)記及檢測試劑盒(德國Roche公司)進行探針標(biāo)記和雜交,暗室中過夜、壓片并檢測信號。
1.2.2qRT-PCR分析2013年分別在抽穗期(4月25 日)、開花期(5月2日)、花后第7天(5月13日)和花后第15天(5月20日),選取100 mg旗葉,采用植物總RNA提取試劑盒(天根生物科技有限公司)提取總RNA。RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA (Promega公司試劑盒),使用SYBR Green Real-time PCR Master Mix QPK-201 (TOYOBO),在Bio-Rad iQ5上進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。擴增引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。NADP-ME基因引物(QF:5'-CGTG GAGTACGAAGGAAAGACT-3';QR:5'-GAGATCTTTC TGATGCTGGTGA-3')。擴增程序為:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性15 s,58℃復(fù)性10 s,72℃延伸15 s,38個循環(huán)。以小麥肌動蛋白β-actin為內(nèi)參照基因(引物序列AF:5'-GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC-3';AR:5'-GAA CCTCCACTGAGAACAACATTACC-3')。擴增程序為:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性15 s,55℃復(fù)性15 s,72℃延伸15 s,35個循環(huán)。所有試驗樣品均3次重復(fù)。
1.2.3Western雜交檢測為進一步驗證玉米C4型NADP-ME基因在小麥中能否正確翻譯出相應(yīng)的蛋白,在抽穗期對T3代轉(zhuǎn)基因小麥進行Western雜交分析。參照Ku 等[17]描述的方法從抽穗期(2013年4月25日)旗葉中提取粗蛋白。取20 μg粗蛋白樣品,經(jīng)SDS-PAGE、100 V濕轉(zhuǎn)2 h轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,新鮮脫脂奶粉封閉1 h后加入一抗(NADP-ME兔多抗)孵育2 h,TBST洗膜3次,每次5 min,再用HRP標(biāo)記的二抗(山羊抗兔)孵育1 h,TBST洗膜6次,每次5 min,最后用ECL發(fā)光檢測試劑盒暗室發(fā)光顯影,用Quantity One軟件進行雜交條帶的灰度分析。NADP-ME兔多克隆抗體由美國Abcam公司制備,HRP標(biāo)記的二抗購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。
1.3轉(zhuǎn)基因小麥光合生理指標(biāo)測定
1.3.1NADP-ME酶活性測定2013年3月12日小麥返青期,將轉(zhuǎn)基因植株和對照周麥23移植于直徑285 mm、高386 mm花盆內(nèi),每份材料移植30盆,每盆定苗3株,常規(guī)管理。參照Ku等[5]描述的方法測定抽穗期(4月25日)、開花期(5月2日)、花后第7天(5月13日)和花后第15天(5月20 日)旗葉中NADP-ME酶活性。
1.3.2氣體交換參數(shù)測定2013年,分別在抽穗期(4 月25日)、開花期(5月2日)、花后第7天(5月13日)和花后第15天(5月20日),利用CIRAS-2光合儀測定轉(zhuǎn)基因小麥和對照旗葉的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr)和胞間CO2濃度(Ci)日變化。測定時CO2濃度為大氣CO2濃度,氣體流速為300 mL min-1。測定時間從6:00到18:00,每間隔1 h往返重復(fù)測定3次。參照王蘭蘭等[27]描述的方法計算單位日光合總量。測定時段的光合有效輻射和大氣溫度見表1。
表1 5個生育期的最大光合有效輻射和最高溫度Table 1 Maximal values of photosynthetically active radiation(PAR) and temperatures at five stages
式中,PN(D)為單位日光合總量值(μmol m-2);Pi為i次測光合速率(μmol m-2s-1);ti為Pi與Pi+1次測定間隔時間(s);n為測定次數(shù)。
1.3.3旗葉Pn對光強和CO2響應(yīng)曲線測定2013年在開花期(5月2日) 9:00—11:30測定光合速率(Pn)對光強(PPFD)的響應(yīng)曲線,葉室溫度為29℃,葉室光強設(shè)定梯度依次為1800、1600、1400、1200、1000、800、600、400、200、150、80、40、10 μmol m-2s-1,CO2濃度為380 μmol mol-1。測定光合速率(Pn)對CO2濃度響應(yīng)的相應(yīng)曲線,CO2濃度由系統(tǒng)配置的CO2鋼瓶提供。利用初始期胞間CO2濃度(Ci) 35～215 μmol mol-1的Pn與Ci進行回歸,其斜率為羧化效率。葉室光強為1450 μmol m-2s-1,葉室溫度為29℃。
1.4氣孔張開率和氣孔導(dǎo)度測定
氣孔張開率是指視野內(nèi)開放氣孔數(shù)與總氣孔數(shù)的百分比。2013年在抽穗期(4月25日),剪取小麥葉片中部約5 cm長,迅速投入到FAA固定液(甲醛5 mL+冰醋酸5 mL+70％酒精90 mL)中。將固定好的樣品葉片表皮上的溶液擦拭干凈,于其上、下表皮均勻涂上一層薄薄的透明的指甲油。風(fēng)干后將指甲油層用透明膠粘住剝?nèi)?平放在載玻片上,在400倍顯微鏡下觀測,分別統(tǒng)計視野內(nèi)開放和關(guān)閉的氣孔數(shù),所得數(shù)據(jù)為10個視野的平均值。氣孔導(dǎo)度采用CRIAS-2光合儀測定。所有樣品各選取5片旗葉進行測試指標(biāo)分析。
1.5蘋果酸和丙酮酸含量的測定
2013年抽穗期(4月25日)選取轉(zhuǎn)基因小麥和對照各6片旗葉,參照Boehringer等[28]和李琳等[29]描述的方法分別進行蘋果酸和丙酮酸含量的測定。
1.6外施蘋果酸處理和凈光合速率的測定
2013年在抽穗期(4月25日)的上午9:30—11:30,按照Ji等[30]方法將蘋果酸溶液(150 mmol L-1)均勻噴施于轉(zhuǎn)基因小麥株系10T(9)-225-4及對照旗葉表面,每個處理選取5片旗葉,噴施蒸餾水作為對照組。將處理后的植株置于暗處(20～30 μmol m-2s-1)下處理1 h,使蘋果酸溶液和蒸餾水充分滲入葉片組織內(nèi)。自然光下適應(yīng)1 h后,采用CIRAS-2型光合作用系統(tǒng)測定其光合速率的變化,重復(fù)往返測定3次。
1.7產(chǎn)量和農(nóng)藝性狀調(diào)查
2013年6月,收獲后取自然風(fēng)干的轉(zhuǎn)基因植株和對照各30株,調(diào)查株高、單株穗數(shù)、小穗數(shù)、穗粒數(shù)、千粒重和單株籽粒重,使用DPS7.55統(tǒng)計軟件對轉(zhuǎn)基因株系和對照各項指標(biāo)進行統(tǒng)計分析和顯著性比較。
2 結(jié)果與分析
2.1轉(zhuǎn)基因小麥的分子鑒定
2.1.1Souhern雜交結(jié)果對3個轉(zhuǎn)基因株系中PCR陽性的T3代植株和對照周麥23的葉片提取基因組DNA進行Southern雜交分析。經(jīng)限制性內(nèi)切酶Xbal I酶切消化的陽性質(zhì)粒與探針雜交后出現(xiàn)1條11.5 kb左右的雜交帶,受體對照植株中無雜交信號,PCR檢測陽性的轉(zhuǎn)基因植株中出現(xiàn)有雜交帶(圖1),表明外源NADP-ME基因已整合到小麥基因組中。
圖1 T3代轉(zhuǎn)基因株系的基因組Southern雜交分析Fig.1 Southern blot analysis of T3transgenic linesM:λDNA;+:質(zhì)粒pMW003-NADP-ME;-:受體周麥23;1～2轉(zhuǎn)基因植株依次為10T(9)-1-1和10T(9)-225-4。M:λDNA;+:Plasmid pMW003-NADP-ME;-:recipient Zhoumai23;1-2:transgenic plants 10T(9)-1-1 and 10T(9)-225-4.
2.1.2轉(zhuǎn)錄水平分析對不同生育期轉(zhuǎn)基因小麥中NADP-ME的轉(zhuǎn)錄水平進行分析,受體對照中出現(xiàn)cDNA擴增產(chǎn)物,內(nèi)
說明小麥中可能存在有源NADP-ME基因。外源NADP-ME基因?qū)牒?2個轉(zhuǎn)基因株系中NADP-ME基因的相對表達量與對照周麥23相比均顯著提高(P <0.01),且開花期>抽穗期>花后第7天>花后第15天。其中,轉(zhuǎn)基因株系10T(9)-1-1和10T(9)-225-4的NADP-ME基因表達量,開花期分別高2.32倍和3.75倍,抽穗期分別較對照高3.41倍和3.60倍(圖2)。
圖2 轉(zhuǎn)基因小麥及其對照(WT)不同生育期旗葉NADP-ME基因的相對表達量Fig.2 Relative expressions of NADP-ME in flag leaves of transgenic wheat lines and wild type (WT) at different stages內(nèi)參基因為β-actin。**表示轉(zhuǎn)基因植株與對照之間差異顯著(P<0.01)。Gene β-actin was used as the internal reference.** indicates significant difference between the transgenic plant and WT (P<0.01).
2.1.3翻譯水平檢測Western雜交結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因小麥和受體對照中均出現(xiàn)65 kD的目的蛋白,說明NADP-ME抗體能與小麥內(nèi)源NADP-ME雜交,不同轉(zhuǎn)基因單株中NADP-ME翻譯水平上存在差異(圖3-A);雜交條帶灰度分析顯示,轉(zhuǎn)基因株系10T(9)-1-1和10T(9)-225-4分別比對照高0.90～1.77倍和1.50～1.95倍(圖3-B)。
圖3 T3代轉(zhuǎn)基因株系Western雜交(A)和雜交圖片灰度分析(B)結(jié)果Fig.3 Western blot (A) and gray level analysis (B) of T3transgenic lines以WT的表達蛋白含量為1。The expression protein content of WT was 1.
2.2旗葉NADP-ME酶活性變化
外源NADP-ME基因的導(dǎo)入,使兩個轉(zhuǎn)基因株系中NADP-ME酶活性均不同程度的增強。在4個測定生育期,除10T(9)-1-1在花后第15天與對照未達顯著差異外,兩個株系的旗葉NADP-ME酶活性均比對照顯著提高(圖4-A)。其變化規(guī)律為花后第7天>開花期>抽穗期>花后第15天;其中,花后第7天轉(zhuǎn)基因小麥NADP-ME酶活性提高幅度最大,分別較對照高1.33倍和1.13倍。
圖4 不同生育期轉(zhuǎn)基因小麥及對照(WT)旗葉NADP-ME酶活性(A)和凈光合速率(B)的變化Fig.4 Dynamic changes of NADP-ME enzyme activity(A) and photosynthetic rate (B) in flag leaves of transgenic wheat lines and the wild type (WT) at different stages*和**分別表示轉(zhuǎn)基因植株與對照在P <0.05和P <0.01水平差異顯著。* and ** indicate significant difference between the transgenic plant and WT at P <0.05 and P <0.01 level,respectively.
2.3旗葉Pn變化
外源NADP-ME基因?qū)牒?4個測定生育期的轉(zhuǎn)基因小麥旗葉Pn均比對照明顯下降,除花后第15天轉(zhuǎn)基因小麥的Pn與對照無顯著差異外,其他生育期兩轉(zhuǎn)基因株系Pn均顯著低于對照(圖4-B);花后第7天下降幅度最大,10T(9)-1-1下降了17.26％,10T(9)-225-4下降了10.35％,其次為抽穗期,10T(9)-1-1和10T(9)-225-4 Pn降幅分別為16.15％和9.26％。
2.4產(chǎn)量性狀分析
與對照周麥23相比,轉(zhuǎn)基因小麥株系10T(9)-1-1和10T(9)-225-4的各產(chǎn)量性狀指標(biāo)均不同程度降低,但只有籽粒產(chǎn)量(P=0.015與0.028)和千粒重(P=0.020與0.025)達到顯著水平,其中千粒重平均下降10％ (表2)。結(jié)果表明,玉米C4型NADP-ME基因的引入導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因小麥千粒重下降,進而造成籽粒減產(chǎn)。
2.5旗葉Pn日變化
4個測定生育期轉(zhuǎn)基因小麥株系10T(9)-225-4和對照周麥23的Pn日變化均表現(xiàn)為雙峰曲線,轉(zhuǎn)基因小麥的Pn低于對照周麥23,其差異在花后第7天最明顯(圖5),此時轉(zhuǎn)基因小麥旗葉Pn的最大值為24.59 μmol m-2s-1,較對照周麥23下降了10.26％。轉(zhuǎn)基因小麥Gs、Tr和Ci等光合特性參數(shù)的日變化呈現(xiàn)與對照一致的趨勢,但轉(zhuǎn)基因小麥的Ci明顯高于對照周麥23,而Gs和Tr明顯低于對照周麥23 (圖6)。
表2 轉(zhuǎn)NADP-ME基因小麥和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏漠a(chǎn)量及農(nóng)藝性狀比較Table 2 Comparison of yield related traits between NADP-ME transgenic wheat lines and WT
圖5 轉(zhuǎn)基因株系和對照(WT)不同時期旗葉凈光合速率日變化曲線Fig.5 Diurnal variation of photosynthetic rate of flag leaves in transgenic line and wild type (WT) at different stages
圖6 轉(zhuǎn)基因株系和對照(WT)不同時期旗葉Gs、Tr和Ci平均日變化曲線Fig.6 Average diurnal variation of Gs,Tr,and Ciof flag leaves in transgenic line and wild type (WT) at different stages圖中數(shù)值均為4個生育期測定數(shù)值的平均值。Data are the mean of four growth stages.
表3 轉(zhuǎn)NADP-ME小麥不同生育時期的單位日光合總量Table 3 Diurnal photosynthesis cumulative Pnin NADP-ME transgenic wheat lines at different growth stages (′105μmol m-2)
4個測定生育期轉(zhuǎn)基因小麥株系10T(9)-225-4平均日光合總量與對照周麥23相比均明顯下降,尤其在花后第7 天,比對照下降13.93％ (表3)。上述結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因小麥株系10T(9)-225-4的光合效率低于對照周麥23。
2.6旗葉Pn對光強、CO2濃度的響應(yīng)
轉(zhuǎn)基因小麥株系10T(9)-225-4和對照周麥23的飽和光強分別為1400.33 μmol m-2s-1和1599.33 μmol m-2s-1,比對照周麥23下降12.44％ (圖7-A);羧化效率分別為0.055 和0.085,較對照周麥23下降35.29％;CO2補償點分別為102.00 μmol mol-1和86.50 μmol mol-1,較對照周麥23高17.92％ (圖7-B)。上述結(jié)果表明,與對照周麥23相比,轉(zhuǎn)基因小麥株系10T(9)-225-4利用強光和同化CO2能力下降。
圖7 轉(zhuǎn)基因小麥旗葉凈光合速率對光照強度(A)和胞間CO2濃度(C)的響應(yīng)曲線Fig.7 Response curves of photosynthesis to PPDF (A) and Ci(C) in transgenic wheat
表4 轉(zhuǎn)NADP-ME小麥和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ仗O果酸、丙酮酸含量比較Table 4 Comparison of malic acid and pyruvate acid content between NADP-ME transgenic wheat and WT
2.5作用機制分析
2.5.1氣孔張開率和氣孔導(dǎo)度變化與對照周麥23相比,轉(zhuǎn)基因小麥株系10T(9)-225-4的氣孔并沒有完全張開,氣孔張開率為43.54％,比對照周麥23 (51.32％)下降了15.16％。在氣孔數(shù)量上兩者無明顯差異(圖8)。轉(zhuǎn)基因小麥株系10T(9)-225-4的氣孔導(dǎo)度為253.30 mmol m-2s-1,比對照周麥23 (288.49 mmol m-2s-1)下降了12.18％;旗葉Pn為22.85 μmol m-2s-1,比對照周麥23 (26.22 μmol m-2s-1)下降了12.85％。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因小麥中氣孔導(dǎo)度的下降是其凈光合速率降低的原因。
2.5.2蘋果酸和丙酮酸含量變化與對照周麥23相比,抽穗期轉(zhuǎn)基因小麥株系10T(9)-225-4的蘋果酸含量降低了8.89％,而丙酮酸含量則和25.00％,差異達到顯著水平(表4)。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因小麥氣孔導(dǎo)度的下降可能是由于其葉片中NADP-ME酶活性的增強,使得蘋果酸濃度降低造成的。
2.5.3噴施外源蘋果酸旗葉Pn變化噴施蘋果酸前,轉(zhuǎn)基因小麥株系10T(9)-225-4的旗葉Pn為22.77 μmol m-2s-1,較對照周麥23 (26.67 μmol m-2s-1)下降了12.20％,差異達到顯著水平;噴施蘋果酸后,轉(zhuǎn)基因小麥株系10T(9)-225-4的Pn達到25.15 μmol m-2s-1,比噴施前提高了9.46％,但與噴施蘋果酸后的對照周麥23 (26.98 μmol m-2s-1)相比兩者無明顯差異(圖9)。外施蘋果酸可恢復(fù)轉(zhuǎn)基因小麥的光合特性,由此可見,轉(zhuǎn)基因小麥氣孔導(dǎo)度的下降是由于葉肉細胞蘋果酸含量下降所導(dǎo)致的,進而導(dǎo)致其凈光合速率下降。
圖8 400倍目鏡下轉(zhuǎn)基因小麥(A)和對照(B)旗葉氣孔導(dǎo)度Fig.8 Stomatal conductance of the flag leaves in transgenic wheat (A) and wild type (B) at a magnification of ×400
圖9 外施蘋果酸后轉(zhuǎn)基因小麥和對照(WT)旗葉凈光合速率比較Fig.9 Dynamic changes of exogenous malate on photosynthetic rate in transgenic wheat and wild type (WT)
3 討論
自Ku等[5]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)玉米全長PEPC基因水稻后,世界各國研究人員開始將C4光合相關(guān)基因?qū)氲紺3植物中,以期提高C3植物的光合生產(chǎn)力,改善其產(chǎn)量潛力[31]。然而將C4光合關(guān)鍵酶基因引入C3植物中提高光合效率的研究一直備受爭議[2,7]。Hu等[13]研究表明,轉(zhuǎn)玉米C4型PEPC基因小麥光合高達31.95 μmol m-2s-1,較對照提高26％。Takeuchi等[20]將玉米C4型NADP-ME基因全長cDNA導(dǎo)入水稻,轉(zhuǎn)化植株的NADP-ME活性提高了至少30倍,葉綠體內(nèi)高活性的NADP-ME可能影響了葉綠體發(fā)育。Jiao等[32]研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)玉米C4型NADP-ME基因水稻中NADP-ME的活性比對照提高了5倍,達到玉米的50％,但轉(zhuǎn)基因水稻的光合效率仍然沒有提高。遲偉等[22]的研究也得到相似的結(jié)果。本研究以T3代轉(zhuǎn)NADP-ME基因小麥株系10T(9)-1-1和10T(9)-225-4為材料,證實外源NADP-ME基因已整合到小麥基因組中,并能夠正常轉(zhuǎn)錄和翻譯;在4個測定生育期轉(zhuǎn)基因株系的NADP-ME酶活性與對照周麥23相比均有所提高,而凈光合速率(Pn)則明顯下降;尤其在花后第7天,2個轉(zhuǎn)基因株系的酶活性分別較對照提高1.33倍和1.13倍,凈光合速率(Pn)分別下降17.26％和10.35％;籽粒產(chǎn)量和千粒重較對照下降顯著。
光合速率的提高是一個復(fù)雜的過程,受諸多因素影響。有研究表明,轉(zhuǎn)PEPC基因水稻光合速率增加可能是由于PEPC過量表達促進了蘋果酸的合成,并通過蘋果酸調(diào)節(jié)了氣孔保衛(wèi)細胞的有機酸代謝,提高了氣孔導(dǎo)度[6,15]。遲偉等[21]研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)NADP-ME基因水稻在強光下葉綠體會積累大量還原性的NADPH,過量的NADPH會造成大量活性氧的產(chǎn)生,進而對光反應(yīng)系統(tǒng)PSII的反應(yīng)中心進行破壞,使轉(zhuǎn)基因植株光抑制作用增強。蘋果酸和丙酮酸分別是NADP-ME酶反應(yīng)的底物和產(chǎn)物(即:L-蘋果酸+ NADP+→丙酮酸+CO2+ NADPH+H+),而蘋果酸在葉肉表皮細胞具有調(diào)節(jié)氣孔開閉的作用。陳根云等[33]用外源C4光合原初產(chǎn)物OAA或MA飼喂C3菠菜葉片,觀察到其光合能力提高。朱素琴等[34]在水稻上也得到相似的結(jié)果。本研究中,用150 mmol L-1的蘋果酸溶液處理轉(zhuǎn)基因小麥及對照旗葉后,兩者旗葉Pn均有所提高,其中轉(zhuǎn)基因小麥增幅最大(9.46％),對照略微提高。對轉(zhuǎn)基因株系10T(9)-225-4的光合效率降低的原因進行分析,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)NADP-ME基因小麥中NADP-ME活性提高,但是其氣孔張開率和氣孔導(dǎo)度下降;旗葉蘋果酸含量顯著低于對照周麥23,而丙酮酸含量則顯著提高;外施蘋果酸則可提高其Pn值,與對照基本接近。由此可見,轉(zhuǎn)基因小麥氣孔導(dǎo)度的下降可能是由于其蘋果酸含量的降低造成的,進而導(dǎo)致其光合效率下降,而外施蘋果酸可恢復(fù)其光合特性。
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Photosynthetic Characteristics of Transgenic Wheat Expressing Maize C4-Type NADP-ME Gene
WANG Yong-Xia1,2,DU Xin-Hua1,2,XU Wei-Gang1,2,*,QI Xue-Li2,LI Yan2,WANG Hui-Wei2,and HU Lin21Nanjing Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China;2Henan Provincial Laboratory of Wheat Biology/Wheat Research Institute,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China
Abstract:To explore the physiological characteristics of the transgenic wheat expressing maize C4-type NADP-ME,we introduced NADP-ME into the C3crop wheat by using particle bombardment transformation.Two transgenic wheat lines (10T(9)-1-1,10T(9)-225-4) and parental control (Zhoumai 23) were used to study molecular characteristics and photosynthesis property,to reveal the mechanism.The results showed that the NADP-ME sequence was integrated into wheat genome,and the transcription and translation were exactly same as expect.The enzyme activity of NADP-ME in flag leaf in transgenic plants were increased significantly than untransformed plants,for instance it was increased 1.33 and 1.13 times on the 7th day after flowering.Net photosynthetic rate (Pn) of flag leaf in transgenic plants obviously decreased when compared to the untransformed plants.On the 7th day after anthesis,Pnof transgenic wheat decreased by 17.26％ and 10.35％.The yield and 1000-grain weight were decreased than the control.Utilization efficiency on strong light utilizing and ability of CO2assimilation in transgenic line 10T(9)-225-4 were significantly declined,photosynthesis rate was also decreased.Stomatal opening rate and stomatal conductance were significant decrease,malic acid content of transgenic wheat reducing 5.6％ while pyruvate level is raised by 17.1％,and Pnof transgenic wheat can be restored by feeding with exogenous malate.Those results indicated that the transgenic wheat expressing maize NADP-ME gene showed lower photosynthetic characteristics than the control,the reason was maybe the decrease of stomatal aperture caused by decline of malic acid content.
Keywords:Transgenic wheat;NADP-dependent malic enzyme;Net photosynthetic rate;Stomata conductance
收稿日期Received():2015-10-12;Accepted(接受日期):2016-01-11;Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期):2016-01-25.
*通訊作者(
Corresponding author):許為鋼,E-mail:xuwg1958@163.com,Tel:0371-65712307
DOI:10.3724/SP.J.1006.2016.00600
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王永霞 杜新華 許為鋼,* 齊學(xué)禮 李 艷 王會偉 胡 琳南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室,江蘇南京 0095;河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所/河南省小麥生物學(xué)重點實驗室,河南鄭州 45000
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導(dǎo)入外源玉米C4型NADP-ME基因?qū)π←湽夂闲艿挠绊?/p>
王永霞1,2杜新華1,2許為鋼1,2,*齊學(xué)禮2李艷2王會偉2胡琳21南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室,江蘇南京 210095;2河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所/河南省小麥生物學(xué)重點實驗室,河南鄭州 450002
摘要:為研究玉米C4型NADP-ME基因?qū)π←湽夂咸匦缘挠绊?以T3代轉(zhuǎn)NADP-ME基因小麥株系10T(9)-1-1和10T(9)-225-4及其對照周麥23為試材,進行了分子特征鑒定、光合生理特性分析和單株產(chǎn)量性狀調(diào)查,并對其作用機制進行了初步解析。結(jié)果表明,外源基因已整合到轉(zhuǎn)基因小麥的基因組中,并能正確轉(zhuǎn)錄和翻譯;與對照周麥23相比,兩個轉(zhuǎn)基因株系在4個測定時期旗葉NADP-ME酶活性均明顯提高,而旗葉凈光合速率(Pn)則明顯下降;尤其在花后第7 天,兩個轉(zhuǎn)基因株系的酶活性較對照分別提高1.33倍和1.13倍,Pn分別較對照下降17.26％和10.35％;千粒重和籽粒產(chǎn)量較對照均顯著下降。與對照周麥23相比,轉(zhuǎn)基因株系10T(9)-225-4利用強光和同化CO2能力下降,光合效率下降;旗葉氣孔張開率和氣孔導(dǎo)度均顯著下降;蘋果酸含量降低了5.6％,丙酮酸含量則提高了17.1％;外施蘋果酸可恢復(fù)其光合速率。以上研究結(jié)果表明,玉米C4型NADP-ME基因的導(dǎo)入降低了小麥的光合特性,蘋果酸含量降低引起的氣孔導(dǎo)度下降可能是導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因小麥光合效能降低的原因。
關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)基因小麥;NADP蘋果酸酶;凈光合速率;氣孔導(dǎo)度
本研究由國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(2011ZX08002-003)和國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-3-1-9)資助。
This study was supported by the National GMO Program of China (2011ZX08002-003) and the China Agriculture Research System (CARS-3-1-9).
第一作者聯(lián)系方式:E-mail:wangyongxia005@163.com,Tel:0371-65721637
長期以來,許多科學(xué)家都在努力將C4作物的高光效關(guān)鍵基因引入水稻、小麥等C3作物中,試圖利用C4型高光效基因來改良C3作物光合作用的內(nèi)在遺傳基礎(chǔ),使之具備高光效特性,從而大幅度提高光合效率,實現(xiàn)生物學(xué)產(chǎn)量和籽粒產(chǎn)量的同步提高[1-2]。隨著分子生物學(xué)和植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的快速發(fā)展,通過基因工程手段將C4途徑光合關(guān)鍵酶基因?qū)隒3植物中,在國內(nèi)外已取得了顯著進展[3-4]。特別是在水稻、小麥、煙草等植物中轉(zhuǎn)入C4途徑高光效關(guān)鍵基因PEPC和PPDK,并獲得高效表達的轉(zhuǎn)基因植株的成功報道[5-16],為進一步提升C3植物產(chǎn)量潛力開辟了一條新的道路。NADP-ME也是C4途徑的關(guān)鍵酶之一,具有催化蘋果酸脫羧,釋放的CO2富集在Rubisco周圍,從而促進Rubisco的羧化反應(yīng),降低其加氧反應(yīng),提高光合作用效率作用。Ku等[17]認為NADP-ME基因的活性與光呼吸的速率呈負相關(guān),將NADP-ME基因轉(zhuǎn)入C3植物,可能是降低C3植物的光呼吸,提高其光合效率的一種有效途徑。目前,已成功的將C4型NADP-ME基因?qū)氲綌M南芥、煙草和水稻等上C3植物上,但大多數(shù)結(jié)果是對光合產(chǎn)量的提高無實質(zhì)性的效果[18-23]。Tsuchida等[21]發(fā)現(xiàn)在過量表達玉米葉綠體NADP-ME cDNA的水稻轉(zhuǎn)化體中,NADP-ME酶活性比對照增加30倍左右,轉(zhuǎn)化體葉色變白并且生長明顯受到抑制。遲偉等[22]研究結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)高粱C4型NADP-ME cDNA的轉(zhuǎn)基因水稻植株中,NADP-ME酶活性比對照提高了1～7倍,但光合速率沒有提高。Laporte等[23]發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)玉米NADP-ME基因的煙草的氣孔導(dǎo)度與NADP-ME的水平成反比,轉(zhuǎn)基因水稻的水分利用效率(鮮重/水耗)比野生型高15％～20％。截至目前,外源C4型NADP-ME基因?qū)π←湽夂闲艿挠绊懠捌錂C制研究尚未見報道。
本課題組從玉米高光效材料中分離了C4型NADP-ME基因的cDNA序列[24],并將其導(dǎo)入擬南芥[25]和小麥中。本研究以T3代轉(zhuǎn)玉米C4型NADP-ME基因小麥株系為材料,研究該基因在小麥基因組中的整合與表達情況,光合生理特性和產(chǎn)量性狀的表現(xiàn),并對其影響機制進行了初步解析,為合理利用C4型NADP-ME基因改良C3作物光合效能提供依據(jù)。
1 材料與方法
1.1轉(zhuǎn)基因小麥獲得
從玉米高光效自交系Z1194中分離了C4型NADP-ME基因的cDNA序列[24],將其構(gòu)建到含35S啟動子的雙元表達載體pCambia3301中,通過基因槍法導(dǎo)入普通小麥品種周麥23中,獲得的T3代轉(zhuǎn)NADP-ME基因小麥株系10T(9)-1-1和10T(9)-225-4為試驗材料。
2012年10月,將各轉(zhuǎn)基因小麥株系和對照周麥23種植于國家黃淮海轉(zhuǎn)基因小麥中試基地(河南原陽,35°00′ N,113°40′ E),每系行長2 m,行距25 cm,株距10 cm。田間常規(guī)管理。
1.2轉(zhuǎn)基因小麥的分子特征鑒定
1.2.1Southern雜交檢測2013年4月7日,取拔節(jié)期小麥葉片3 g,用改良的CTAB法提取基因組DNA[26]。取150 μg基因組DNA和50 ng質(zhì)粒DNA,使用限制性內(nèi)切酶Xbal I酶切消化,純化后電泳分離,轉(zhuǎn)移至尼龍膜(N+)上。以質(zhì)粒pCambia3301-NADP-ME為模板,使用引物擴增520 bp的 NADP-ME基因片段為探針標(biāo)記模板。取外源基因探針模板1 μL,用DIG標(biāo)記及檢測試劑盒(德國Roche公司)進行探針標(biāo)記和雜交,暗室中過夜、壓片并檢測信號。
1.2.2qRT-PCR分析2013年分別在抽穗期(4月25 日)、開花期(5月2日)、花后第7天(5月13日)和花后第15天(5月20日),選取100 mg旗葉,采用植物總RNA提取試劑盒(天根生物科技有限公司)提取總RNA。RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA (Promega公司試劑盒),使用SYBR Green Real-time PCR Master Mix QPK-201 (TOYOBO),在Bio-Rad iQ5上進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。擴增引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。NADP-ME基因引物(QF:5'-CGTG GAGTACGAAGGAAAGACT-3';QR:5'-GAGATCTTTC TGATGCTGGTGA-3')。擴增程序為:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性15 s,58℃復(fù)性10 s,72℃延伸15 s,38個循環(huán)。以小麥肌動蛋白β-actin為內(nèi)參照基因(引物序列AF:5'-GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC-3';AR:5'-GAA CCTCCACTGAGAACAACATTACC-3')。擴增程序為:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性15 s,55℃復(fù)性15 s,72℃延伸15 s,35個循環(huán)。所有試驗樣品均3次重復(fù)。
1.2.3Western雜交檢測為進一步驗證玉米C4型NADP-ME基因在小麥中能否正確翻譯出相應(yīng)的蛋白,在抽穗期對T3代轉(zhuǎn)基因小麥進行Western雜交分析。參照Ku 等[17]描述的方法從抽穗期(2013年4月25日)旗葉中提取粗蛋白。取20 μg粗蛋白樣品,經(jīng)SDS-PAGE、100 V濕轉(zhuǎn)2 h轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,新鮮脫脂奶粉封閉1 h后加入一抗(NADP-ME兔多抗)孵育2 h,TBST洗膜3次,每次5 min,再用HRP標(biāo)記的二抗(山羊抗兔)孵育1 h,TBST洗膜6次,每次5 min,最后用ECL發(fā)光檢測試劑盒暗室發(fā)光顯影,用Quantity One軟件進行雜交條帶的灰度分析。NADP-ME兔多克隆抗體由美國Abcam公司制備,HRP標(biāo)記的二抗購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。
1.3轉(zhuǎn)基因小麥光合生理指標(biāo)測定
1.3.1NADP-ME酶活性測定2013年3月12日小麥返青期,將轉(zhuǎn)基因植株和對照周麥23移植于直徑285 mm、高386 mm花盆內(nèi),每份材料移植30盆,每盆定苗3株,常規(guī)管理。參照Ku等[5]描述的方法測定抽穗期(4月25日)、開花期(5月2日)、花后第7天(5月13日)和花后第15天(5月20 日)旗葉中NADP-ME酶活性。
1.3.2氣體交換參數(shù)測定2013年,分別在抽穗期(4 月25日)、開花期(5月2日)、花后第7天(5月13日)和花后第15天(5月20日),利用CIRAS-2光合儀測定轉(zhuǎn)基因小麥和對照旗葉的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr)和胞間CO2濃度(Ci)日變化。測定時CO2濃度為大氣CO2濃度,氣體流速為300 mL min-1。測定時間從6:00到18:00,每間隔1 h往返重復(fù)測定3次。參照王蘭蘭等[27]描述的方法計算單位日光合總量。測定時段的光合有效輻射和大氣溫度見表1。
表1 5個生育期的最大光合有效輻射和最高溫度Table 1 Maximal values of photosynthetically active radiation(PAR) and temperatures at five stages
式中,PN(D)為單位日光合總量值(μmol m-2);Pi為i次測光合速率(μmol m-2s-1);ti為Pi與Pi+1次測定間隔時間(s);n為測定次數(shù)。
1.3.3旗葉Pn對光強和CO2響應(yīng)曲線測定2013年在開花期(5月2日) 9:00—11:30測定光合速率(Pn)對光強(PPFD)的響應(yīng)曲線,葉室溫度為29℃,葉室光強設(shè)定梯度依次為1800、1600、1400、1200、1000、800、600、400、200、150、80、40、10 μmol m-2s-1,CO2濃度為380 μmol mol-1。測定光合速率(Pn)對CO2濃度響應(yīng)的相應(yīng)曲線,CO2濃度由系統(tǒng)配置的CO2鋼瓶提供。利用初始期胞間CO2濃度(Ci) 35～215 μmol mol-1的Pn與Ci進行回歸,其斜率為羧化效率。葉室光強為1450 μmol m-2s-1,葉室溫度為29℃。
1.4氣孔張開率和氣孔導(dǎo)度測定
氣孔張開率是指視野內(nèi)開放氣孔數(shù)與總氣孔數(shù)的百分比。2013年在抽穗期(4月25日),剪取小麥葉片中部約5 cm長,迅速投入到FAA固定液(甲醛5 mL+冰醋酸5 mL+70％酒精90 mL)中。將固定好的樣品葉片表皮上的溶液擦拭干凈,于其上、下表皮均勻涂上一層薄薄的透明的指甲油。風(fēng)干后將指甲油層用透明膠粘住剝?nèi)?平放在載玻片上,在400倍顯微鏡下觀測,分別統(tǒng)計視野內(nèi)開放和關(guān)閉的氣孔數(shù),所得數(shù)據(jù)為10個視野的平均值。氣孔導(dǎo)度采用CRIAS-2光合儀測定。所有樣品各選取5片旗葉進行測試指標(biāo)分析。
1.5蘋果酸和丙酮酸含量的測定
2013年抽穗期(4月25日)選取轉(zhuǎn)基因小麥和對照各6片旗葉,參照Boehringer等[28]和李琳等[29]描述的方法分別進行蘋果酸和丙酮酸含量的測定。
1.6外施蘋果酸處理和凈光合速率的測定
2013年在抽穗期(4月25日)的上午9:30—11:30,按照Ji等[30]方法將蘋果酸溶液(150 mmol L-1)均勻噴施于轉(zhuǎn)基因小麥株系10T(9)-225-4及對照旗葉表面,每個處理選取5片旗葉,噴施蒸餾水作為對照組。將處理后的植株置于暗處(20～30 μmol m-2s-1)下處理1 h,使蘋果酸溶液和蒸餾水充分滲入葉片組織內(nèi)。自然光下適應(yīng)1 h后,采用CIRAS-2型光合作用系統(tǒng)測定其光合速率的變化,重復(fù)往返測定3次。
1.7產(chǎn)量和農(nóng)藝性狀調(diào)查
2013年6月,收獲后取自然風(fēng)干的轉(zhuǎn)基因植株和對照各30株,調(diào)查株高、單株穗數(shù)、小穗數(shù)、穗粒數(shù)、千粒重和單株籽粒重,使用DPS7.55統(tǒng)計軟件對轉(zhuǎn)基因株系和對照各項指標(biāo)進行統(tǒng)計分析和顯著性比較。
2 結(jié)果與分析
2.1轉(zhuǎn)基因小麥的分子鑒定
2.1.1Souhern雜交結(jié)果對3個轉(zhuǎn)基因株系中PCR陽性的T3代植株和對照周麥23的葉片提取基因組DNA進行Southern雜交分析。經(jīng)限制性內(nèi)切酶Xbal I酶切消化的陽性質(zhì)粒與探針雜交后出現(xiàn)1條11.5 kb左右的雜交帶,受體對照植株中無雜交信號,PCR檢測陽性的轉(zhuǎn)基因植株中出現(xiàn)有雜交帶(圖1),表明外源NADP-ME基因已整合到小麥基因組中。
圖1 T3代轉(zhuǎn)基因株系的基因組Southern雜交分析Fig.1 Southern blot analysis of T3transgenic linesM:λDNA;+:質(zhì)粒pMW003-NADP-ME;-:受體周麥23;1～2轉(zhuǎn)基因植株依次為10T(9)-1-1和10T(9)-225-4。M:λDNA;+:Plasmid pMW003-NADP-ME;-:recipient Zhoumai23;1-2:transgenic plants 10T(9)-1-1 and 10T(9)-225-4.
2.1.2轉(zhuǎn)錄水平分析對不同生育期轉(zhuǎn)基因小麥中NADP-ME的轉(zhuǎn)錄水平進行分析,受體對照中出現(xiàn)cDNA擴增產(chǎn)物,內(nèi)
說明小麥中可能存在有源NADP-ME基因。外源NADP-ME基因?qū)牒?2個轉(zhuǎn)基因株系中NADP-ME基因的相對表達量與對照周麥23相比均顯著提高(P <0.01),且開花期>抽穗期>花后第7天>花后第15天。其中,轉(zhuǎn)基因株系10T(9)-1-1和10T(9)-225-4的NADP-ME基因表達量,開花期分別高2.32倍和3.75倍,抽穗期分別較對照高3.41倍和3.60倍(圖2)。
圖2 轉(zhuǎn)基因小麥及其對照(WT)不同生育期旗葉NADP-ME基因的相對表達量Fig.2 Relative expressions of NADP-ME in flag leaves of transgenic wheat lines and wild type (WT) at different stages內(nèi)參基因為β-actin。**表示轉(zhuǎn)基因植株與對照之間差異顯著(P<0.01)。Gene β-actin was used as the internal reference.** indicates significant difference between the transgenic plant and WT (P<0.01).
2.1.3翻譯水平檢測Western雜交結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因小麥和受體對照中均出現(xiàn)65 kD的目的蛋白,說明NADP-ME抗體能與小麥內(nèi)源NADP-ME雜交,不同轉(zhuǎn)基因單株中NADP-ME翻譯水平上存在差異(圖3-A);雜交條帶灰度分析顯示,轉(zhuǎn)基因株系10T(9)-1-1和10T(9)-225-4分別比對照高0.90～1.77倍和1.50～1.95倍(圖3-B)。
圖3 T3代轉(zhuǎn)基因株系Western雜交(A)和雜交圖片灰度分析(B)結(jié)果Fig.3 Western blot (A) and gray level analysis (B) of T3transgenic lines以WT的表達蛋白含量為1。The expression protein content of WT was 1.
2.2旗葉NADP-ME酶活性變化
外源NADP-ME基因的導(dǎo)入,使兩個轉(zhuǎn)基因株系中NADP-ME酶活性均不同程度的增強。在4個測定生育期,除10T(9)-1-1在花后第15天與對照未達顯著差異外,兩個株系的旗葉NADP-ME酶活性均比對照顯著提高(圖4-A)。其變化規(guī)律為花后第7天>開花期>抽穗期>花后第15天;其中,花后第7天轉(zhuǎn)基因小麥NADP-ME酶活性提高幅度最大,分別較對照高1.33倍和1.13倍。
圖4 不同生育期轉(zhuǎn)基因小麥及對照(WT)旗葉NADP-ME酶活性(A)和凈光合速率(B)的變化Fig.4 Dynamic changes of NADP-ME enzyme activity(A) and photosynthetic rate (B) in flag leaves of transgenic wheat lines and the wild type (WT) at different stages*和**分別表示轉(zhuǎn)基因植株與對照在P <0.05和P <0.01水平差異顯著。* and ** indicate significant difference between the transgenic plant and WT at P <0.05 and P <0.01 level,respectively.
2.3旗葉Pn變化
外源NADP-ME基因?qū)牒?4個測定生育期的轉(zhuǎn)基因小麥旗葉Pn均比對照明顯下降,除花后第15天轉(zhuǎn)基因小麥的Pn與對照無顯著差異外,其他生育期兩轉(zhuǎn)基因株系Pn均顯著低于對照(圖4-B);花后第7天下降幅度最大,10T(9)-1-1下降了17.26％,10T(9)-225-4下降了10.35％,其次為抽穗期,10T(9)-1-1和10T(9)-225-4 Pn降幅分別為16.15％和9.26％。
2.4產(chǎn)量性狀分析
與對照周麥23相比,轉(zhuǎn)基因小麥株系10T(9)-1-1和10T(9)-225-4的各產(chǎn)量性狀指標(biāo)均不同程度降低,但只有籽粒產(chǎn)量(P=0.015與0.028)和千粒重(P=0.020與0.025)達到顯著水平,其中千粒重平均下降10％ (表2)。結(jié)果表明,玉米C4型NADP-ME基因的引入導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因小麥千粒重下降,進而造成籽粒減產(chǎn)。
2.5旗葉Pn日變化
4個測定生育期轉(zhuǎn)基因小麥株系10T(9)-225-4和對照周麥23的Pn日變化均表現(xiàn)為雙峰曲線,轉(zhuǎn)基因小麥的Pn低于對照周麥23,其差異在花后第7天最明顯(圖5),此時轉(zhuǎn)基因小麥旗葉Pn的最大值為24.59 μmol m-2s-1,較對照周麥23下降了10.26％。轉(zhuǎn)基因小麥Gs、Tr和Ci等光合特性參數(shù)的日變化呈現(xiàn)與對照一致的趨勢,但轉(zhuǎn)基因小麥的Ci明顯高于對照周麥23,而Gs和Tr明顯低于對照周麥23 (圖6)。
表2 轉(zhuǎn)NADP-ME基因小麥和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏漠a(chǎn)量及農(nóng)藝性狀比較Table 2 Comparison of yield related traits between NADP-ME transgenic wheat lines and WT
圖5 轉(zhuǎn)基因株系和對照(WT)不同時期旗葉凈光合速率日變化曲線Fig.5 Diurnal variation of photosynthetic rate of flag leaves in transgenic line and wild type (WT) at different stages
圖6 轉(zhuǎn)基因株系和對照(WT)不同時期旗葉Gs、Tr和Ci平均日變化曲線Fig.6 Average diurnal variation of Gs,Tr,and Ciof flag leaves in transgenic line and wild type (WT) at different stages圖中數(shù)值均為4個生育期測定數(shù)值的平均值。Data are the mean of four growth stages.
表3 轉(zhuǎn)NADP-ME小麥不同生育時期的單位日光合總量Table 3 Diurnal photosynthesis cumulative Pnin NADP-ME transgenic wheat lines at different growth stages (′105μmol m-2)
4個測定生育期轉(zhuǎn)基因小麥株系10T(9)-225-4平均日光合總量與對照周麥23相比均明顯下降,尤其在花后第7 天,比對照下降13.93％ (表3)。上述結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因小麥株系10T(9)-225-4的光合效率低于對照周麥23。
2.6旗葉Pn對光強、CO2濃度的響應(yīng)
轉(zhuǎn)基因小麥株系10T(9)-225-4和對照周麥23的飽和光強分別為1400.33 μmol m-2s-1和1599.33 μmol m-2s-1,比對照周麥23下降12.44％ (圖7-A);羧化效率分別為0.055 和0.085,較對照周麥23下降35.29％;CO2補償點分別為102.00 μmol mol-1和86.50 μmol mol-1,較對照周麥23高17.92％ (圖7-B)。上述結(jié)果表明,與對照周麥23相比,轉(zhuǎn)基因小麥株系10T(9)-225-4利用強光和同化CO2能力下降。
圖7 轉(zhuǎn)基因小麥旗葉凈光合速率對光照強度(A)和胞間CO2濃度(C)的響應(yīng)曲線Fig.7 Response curves of photosynthesis to PPDF (A) and Ci(C) in transgenic wheat
表4 轉(zhuǎn)NADP-ME小麥和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ仗O果酸、丙酮酸含量比較Table 4 Comparison of malic acid and pyruvate acid content between NADP-ME transgenic wheat and WT
2.5作用機制分析
2.5.1氣孔張開率和氣孔導(dǎo)度變化與對照周麥23相比,轉(zhuǎn)基因小麥株系10T(9)-225-4的氣孔并沒有完全張開,氣孔張開率為43.54％,比對照周麥23 (51.32％)下降了15.16％。在氣孔數(shù)量上兩者無明顯差異(圖8)。轉(zhuǎn)基因小麥株系10T(9)-225-4的氣孔導(dǎo)度為253.30 mmol m-2s-1,比對照周麥23 (288.49 mmol m-2s-1)下降了12.18％;旗葉Pn為22.85 μmol m-2s-1,比對照周麥23 (26.22 μmol m-2s-1)下降了12.85％。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因小麥中氣孔導(dǎo)度的下降是其凈光合速率降低的原因。
2.5.2蘋果酸和丙酮酸含量變化與對照周麥23相比,抽穗期轉(zhuǎn)基因小麥株系10T(9)-225-4的蘋果酸含量降低了8.89％,而丙酮酸含量則和25.00％,差異達到顯著水平(表4)。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因小麥氣孔導(dǎo)度的下降可能是由于其葉片中NADP-ME酶活性的增強,使得蘋果酸濃度降低造成的。
2.5.3噴施外源蘋果酸旗葉Pn變化噴施蘋果酸前,轉(zhuǎn)基因小麥株系10T(9)-225-4的旗葉Pn為22.77 μmol m-2s-1,較對照周麥23 (26.67 μmol m-2s-1)下降了12.20％,差異達到顯著水平;噴施蘋果酸后,轉(zhuǎn)基因小麥株系10T(9)-225-4的Pn達到25.15 μmol m-2s-1,比噴施前提高了9.46％,但與噴施蘋果酸后的對照周麥23 (26.98 μmol m-2s-1)相比兩者無明顯差異(圖9)。外施蘋果酸可恢復(fù)轉(zhuǎn)基因小麥的光合特性,由此可見,轉(zhuǎn)基因小麥氣孔導(dǎo)度的下降是由于葉肉細胞蘋果酸含量下降所導(dǎo)致的,進而導(dǎo)致其凈光合速率下降。
圖8 400倍目鏡下轉(zhuǎn)基因小麥(A)和對照(B)旗葉氣孔導(dǎo)度Fig.8 Stomatal conductance of the flag leaves in transgenic wheat (A) and wild type (B) at a magnification of ×400
圖9 外施蘋果酸后轉(zhuǎn)基因小麥和對照(WT)旗葉凈光合速率比較Fig.9 Dynamic changes of exogenous malate on photosynthetic rate in transgenic wheat and wild type (WT)
3 討論
自Ku等[5]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)玉米全長PEPC基因水稻后,世界各國研究人員開始將C4光合相關(guān)基因?qū)氲紺3植物中,以期提高C3植物的光合生產(chǎn)力,改善其產(chǎn)量潛力[31]。然而將C4光合關(guān)鍵酶基因引入C3植物中提高光合效率的研究一直備受爭議[2,7]。Hu等[13]研究表明,轉(zhuǎn)玉米C4型PEPC基因小麥光合高達31.95 μmol m-2s-1,較對照提高26％。Takeuchi等[20]將玉米C4型NADP-ME基因全長cDNA導(dǎo)入水稻,轉(zhuǎn)化植株的NADP-ME活性提高了至少30倍,葉綠體內(nèi)高活性的NADP-ME可能影響了葉綠體發(fā)育。Jiao等[32]研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)玉米C4型NADP-ME基因水稻中NADP-ME的活性比對照提高了5倍,達到玉米的50％,但轉(zhuǎn)基因水稻的光合效率仍然沒有提高。遲偉等[22]的研究也得到相似的結(jié)果。本研究以T3代轉(zhuǎn)NADP-ME基因小麥株系10T(9)-1-1和10T(9)-225-4為材料,證實外源NADP-ME基因已整合到小麥基因組中,并能夠正常轉(zhuǎn)錄和翻譯;在4個測定生育期轉(zhuǎn)基因株系的NADP-ME酶活性與對照周麥23相比均有所提高,而凈光合速率(Pn)則明顯下降;尤其在花后第7天,2個轉(zhuǎn)基因株系的酶活性分別較對照提高1.33倍和1.13倍,凈光合速率(Pn)分別下降17.26％和10.35％;籽粒產(chǎn)量和千粒重較對照下降顯著。
光合速率的提高是一個復(fù)雜的過程,受諸多因素影響。有研究表明,轉(zhuǎn)PEPC基因水稻光合速率增加可能是由于PEPC過量表達促進了蘋果酸的合成,并通過蘋果酸調(diào)節(jié)了氣孔保衛(wèi)細胞的有機酸代謝,提高了氣孔導(dǎo)度[6,15]。遲偉等[21]研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)NADP-ME基因水稻在強光下葉綠體會積累大量還原性的NADPH,過量的NADPH會造成大量活性氧的產(chǎn)生,進而對光反應(yīng)系統(tǒng)PSII的反應(yīng)中心進行破壞,使轉(zhuǎn)基因植株光抑制作用增強。蘋果酸和丙酮酸分別是NADP-ME酶反應(yīng)的底物和產(chǎn)物(即:L-蘋果酸+ NADP+→丙酮酸+CO2+ NADPH+H+),而蘋果酸在葉肉表皮細胞具有調(diào)節(jié)氣孔開閉的作用。陳根云等[33]用外源C4光合原初產(chǎn)物OAA或MA飼喂C3菠菜葉片,觀察到其光合能力提高。朱素琴等[34]在水稻上也得到相似的結(jié)果。本研究中,用150 mmol L-1的蘋果酸溶液處理轉(zhuǎn)基因小麥及對照旗葉后,兩者旗葉Pn均有所提高,其中轉(zhuǎn)基因小麥增幅最大(9.46％),對照略微提高。對轉(zhuǎn)基因株系10T(9)-225-4的光合效率降低的原因進行分析,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)NADP-ME基因小麥中NADP-ME活性提高,但是其氣孔張開率和氣孔導(dǎo)度下降;旗葉蘋果酸含量顯著低于對照周麥23,而丙酮酸含量則顯著提高;外施蘋果酸則可提高其Pn值,與對照基本接近。由此可見,轉(zhuǎn)基因小麥氣孔導(dǎo)度的下降可能是由于其蘋果酸含量的降低造成的,進而導(dǎo)致其光合效率下降,而外施蘋果酸可恢復(fù)其光合特性。
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URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160125.1622.012.html
Photosynthetic Characteristics of Transgenic Wheat Expressing Maize C4-Type NADP-ME Gene
WANG Yong-Xia1,2,DU Xin-Hua1,2,XU Wei-Gang1,2,*,QI Xue-Li2,LI Yan2,WANG Hui-Wei2,and HU Lin21Nanjing Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China;2Henan Provincial Laboratory of Wheat Biology/Wheat Research Institute,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China
Abstract:To explore the physiological characteristics of the transgenic wheat expressing maize C4-type NADP-ME,we introduced NADP-ME into the C3crop wheat by using particle bombardment transformation.Two transgenic wheat lines (10T(9)-1-1,10T(9)-225-4) and parental control (Zhoumai 23) were used to study molecular characteristics and photosynthesis property,to reveal the mechanism.The results showed that the NADP-ME sequence was integrated into wheat genome,and the transcription and translation were exactly same as expect.The enzyme activity of NADP-ME in flag leaf in transgenic plants were increased significantly than untransformed plants,for instance it was increased 1.33 and 1.13 times on the 7th day after flowering.Net photosynthetic rate (Pn) of flag leaf in transgenic plants obviously decreased when compared to the untransformed plants.On the 7th day after anthesis,Pnof transgenic wheat decreased by 17.26％ and 10.35％.The yield and 1000-grain weight were decreased than the control.Utilization efficiency on strong light utilizing and ability of CO2assimilation in transgenic line 10T(9)-225-4 were significantly declined,photosynthesis rate was also decreased.Stomatal opening rate and stomatal conductance were significant decrease,malic acid content of transgenic wheat reducing 5.6％ while pyruvate level is raised by 17.1％,and Pnof transgenic wheat can be restored by feeding with exogenous malate.Those results indicated that the transgenic wheat expressing maize NADP-ME gene showed lower photosynthetic characteristics than the control,the reason was maybe the decrease of stomatal aperture caused by decline of malic acid content.
Keywords:Transgenic wheat;NADP-dependent malic enzyme;Net photosynthetic rate;Stomata conductance
收稿日期Received():2015-10-12;Accepted(接受日期):2016-01-11;Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期):2016-01-25.
*通訊作者(
Corresponding author):許為鋼,E-mail:xuwg1958@163.com,Tel:0371-65712307
DOI:10.3724/SP.J.1006.2016.00600
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