劉　峰　蘇煒華　黃　瓏　肖新?lián)Q　黃　寧　凌　輝　蘇亞春張　華　闕友雄

福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室/國家甘蔗產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心,福建福州 350002

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甘蔗Na+/H+逆轉(zhuǎn)運蛋白基因的克隆與表達分析

劉峰**蘇煒華**黃瓏肖新?lián)Q黃寧凌輝蘇亞春張華闕友雄*

福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室/國家甘蔗產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心,福建福州 350002

摘要:Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因SOS1 (salt overly sensitive 1)是植物耐鹽性的必需基因之一,在植物抵御鹽脅迫過程中發(fā)揮十分重要的作用。本研究以小麥EST序列KJ563230為探針,利用電子克隆技術(shù)結(jié)合RT-PCR,獲得一條甘蔗SOS1基因的cDNA序列,命名為ScSOS1 (GenBank登錄號為KT003285)。序列分析結(jié)果表明,該基因全長1403 bp,包含一個1272 bp的開放閱讀框,編碼423個氨基酸的蛋白質(zhì)。ScSOS1蛋白的相對分子質(zhì)量為47.6 kD,理論等電點(pI) 為9.12。氨基酸序列分析表明,ScSOS1蛋白具有一個CAP-ED superfamily結(jié)構(gòu)域。生物信息學(xué)預(yù)測顯示,ScSOS1的編碼蛋白為親水性蛋白,不存在信號肽,二級結(jié)構(gòu)元件多為無規(guī)則卷曲,主要參與中間代謝。實時熒光定量PCR分析表明,ScSOS1基因的表達具有組織特異性,在甘蔗葉鞘、蔗皮、蔗髓、側(cè)芽和根中均有表達,其中在葉鞘中的表達量最高,根中的表達量最低。此外在NaCl、PEG、ABA、SA和MeJA的脅迫過程中,該基因表達均受到調(diào)控,其中受NaCl和PEG誘導(dǎo)后上調(diào)表達,均在24 h表達量達最高,分別約為對照組的1.5倍和4.0倍。推測該基因的表達與甘蔗耐鹽性和抗?jié)B透脅迫有關(guān)。

關(guān)鍵詞:甘蔗;SOS1基因;電子克隆;生物信息學(xué);實時熒光定量PCR

本研究由國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-20),國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201503119)和福建省高等學(xué)校新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計劃(JA14095)資助。

This study was supported by the China Agriculture Research System (CARS-20),the Special Fund for Agro-Scientific Research in the Public Interest (201503119),and the Program for New Century Excellent Talents in Fujian Province University (JA14095).

第一作者聯(lián)系方式:劉峰,E-mail:760733016@qq.com;蘇煒華,E-mail:410946470@qq.com

土壤鹽漬化是一個世界性難題,我國約有3.3×107公頃的鹽漬化土壤,嚴(yán)重影響我國農(nóng)業(yè)的生產(chǎn)效率和可持續(xù)發(fā)展[1]。土壤鹽分過多會對植物生長發(fā)育造成危害,如引起離子平衡和滲透平衡的失調(diào),影響酶的活性,甚至?xí)种乒夂献饔玫纫恍┲匾拇x途徑[2-5]。前人研究表明,在受到鹽脅迫時,植物細(xì)胞內(nèi)活性氧的增加會加快葉綠體的氧化降解速度,進而抑制葉綠體片層的合成,降低葉片中的葉綠素含量,最終降低光合作用[6-12]。同時,在鹽脅迫下,植物細(xì)胞內(nèi)還會產(chǎn)生大量氧自由基,降低超氧化物歧化酶(SOD)的活性,改變細(xì)胞膜通透性,從而損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞功能[13-15]。

植物抗鹽或耐鹽的生理基礎(chǔ)主要包括滲透調(diào)節(jié)、離子區(qū)域化、光合作用途徑改變、抗氧化防御系統(tǒng)的活性增加和植物激素調(diào)節(jié)[16]。有機小分子物質(zhì)和無機離子如脯氨酸、甜菜堿、甘露醇、Na+、K+等可以調(diào)節(jié)植物的滲透壓平衡,還可以通過離子區(qū)域化將鹽離子儲存在細(xì)胞器或組織中,減輕鹽離子對植物的損害[17]。另一方面,在鹽脅迫下,植物主要通過增加水的利用率和改變光合碳同化途徑增強耐鹽性,同時體內(nèi)的SOD、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)等酶的活性升高,以有效清除過多的活性氧,防止膜脂過氧化[16]。當(dāng)植物處于鹽脅迫環(huán)境時,植物內(nèi)源信號激素脫落酸(ABA)被誘導(dǎo)合成,通過改變植物體內(nèi)水分和離子平衡,對鹽脅迫作出適應(yīng)性反應(yīng),最終提高植物的耐鹽性[18]。陳義強等[19]研究發(fā)現(xiàn),在200 mmol L-1NaCl處理下,斑茅體內(nèi)的超氧化物歧化酶和過氧化物酶(POD)活性升高,表現(xiàn)出較強的抗鹽性。

迄今,離子區(qū)域化酶類基因,尤其是Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因SOS (salt overly sensitive)的克隆和功能分析,是植物耐鹽分子機制研究的熱點。Gaxiola等[20]從擬南芥克隆到一個液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因AtNHX1 (Na+/H+exchanger,NHX),發(fā)現(xiàn)該基因與擬南芥H+-PPase基因AVP1 (Arabidopis thaliana vacuolar-type H+-pumping pyrophosphatase 1)共同執(zhí)行Na+的液泡轉(zhuǎn)運功能。Waditee等[21]的研究發(fā)現(xiàn),藻青菌的質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因ApNhaP (a halotolerant cyanobacterium)編碼蛋白的主要作用是驅(qū)使Na+的外排,這也是光合生物耐鹽性的關(guān)鍵因素。前人研究揭示,SOS信號通路與植物耐鹽性密切相關(guān),目前,研究者[22-26]已從擬南芥中獲得6個耐鹽基因SOS1、SOS2、SOS3、SOS4、SOS5 和SOS6,其中SOS1在SOS信號通路中扮演十分重要的角色[27-29]。擬南芥SOS1基因編碼一個質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白,SOS1的C-末端為一長親水性尾鏈,位于胞質(zhì)中,作為感受器感知胞質(zhì)中Na+濃度的變化,進而引發(fā)胞質(zhì)Ca2+信號的產(chǎn)生,隨后Ca2+信號刺激SOS3-SOS2復(fù)合物激活SOS1,最后將Na+排出胞外,提高植物的耐鹽性[27-29]。擬南芥SOS1蛋白是質(zhì)膜Na+/H+的逆向運輸體,同時也是SOS信號通路中最初的調(diào)節(jié)對象[30]。擬南芥SOS1突變體對鹽非常敏感,表明SOS1基因在擬南芥耐鹽性中發(fā)揮重要的作用。權(quán)庚等[31]研究發(fā)現(xiàn),過量表達互花米草SaSOS1的轉(zhuǎn)基因水稻對鹽脅迫具有較強的適應(yīng)能力,說明該基因可以增強植株的耐鹽性。此外,SOS1基因也已經(jīng)在包括水稻[32]、小麥[33]、大葉補血草[34]等植物上被克隆和鑒定。但是,國內(nèi)外尚未見甘蔗SOS1基因的克隆和表達分析的報道。

我國甘蔗主要種植在鹽堿地和旱地[35],研究表明,鹽脅迫對甘蔗的發(fā)芽率和植株生長具有重要的影響,是造成甘蔗產(chǎn)量和糖分下降的主要原因之一[36-37]。因此,了解甘蔗耐鹽機理和挖掘甘蔗耐鹽基因?qū)ε嘤望}甘蔗品種具有非常重要的意義。本研究以甘蔗品種崖城05-179 (YC05-179)為材料,利用電子克隆結(jié)合RT-PCR及RT-qPCR技術(shù),分析甘蔗中ScSOS1基因的表達情況,以期進一步揭示該基因的功能和作用模式。

1　材料與方法

1.1試驗材料和試劑

甘蔗品種YC05-179由福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室提供。主要試劑為PrimeScript TM RT-PCR Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa,中國大連、TRIzol Reagent (Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)、Gel Extracti on Kit (Tiangen Biotech Co.,中國北京)、SYBR Green PCR Master Mix Kit (Roche,USA)。

1.2材料處理

從田間挑選健康無病長勢相近的YC05-179蔗株,將其切成單芽莖段,并種植于經(jīng)過高溫高壓滅菌的營養(yǎng)土中催芽(16 h/8 h,光/暗,28℃),直至蔗苗長出4～6葉。其次,選取長勢一致的蔗苗,用于組培苗的誘導(dǎo)、壯苗、生根。最后,將組培甘蔗幼苗移出并在溫室內(nèi)開放水培一周,再挑選長勢均一的組培苗分為對照和4個試驗組,設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。試驗組處理[35]為5 mmol L-1水楊酸(SA:6、12 和24 h)、100 μmol L-1茉莉酸甲酯(MeJA:6、12和24 h)、100 μmol L-1脫落酸(ABA:6、12和24 h)、25.0％ PEG (模擬干旱:6、12和24 h)和250 mmol L-1NaCl (高鹽:12、24和48 h) 水溶液培養(yǎng),以處理0 h的蔗苗為對照。取以上所有植物材料的樣本立即投入液氮速凍并保存于-80℃冰箱至RNA提取。

1.3總RNA提取和cDNA合成

用TRIzol Reagent試劑提取樣品RNA,包括組織特異性材料YC05-179的葉片、葉鞘、側(cè)芽、蔗皮、蔗髓、根及經(jīng)SA、MeJA、ABA、PEG和NaCl脅迫處理的蔗苗,根據(jù)Prime-Script RT Reagent Kit操作說明書,將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,用1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量。

1.4甘蔗SOS1基因的電子克隆和RT-PCR

采用電子克隆方法,以小麥SOS1基因(KJ563230)的EST序列作為探針,應(yīng)用NCBI的BlastN工具檢索甘蔗EST數(shù)據(jù)庫,將獲得的甘蔗EST序列群(表1),同源性達到84％以上者,用CAP3 sequence Assembly Program (CAP3) (http://pbil.univlyon1.fr/cap3.php)軟件拼接組裝獲得cDNA序列。最后利用ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)在線軟件,對所獲得的cDNA序列進行ORF預(yù)測分析。

以上述電子克隆獲得的cDNA序列為模板,設(shè)計一對特異性的RT-PCR擴增引物SOS1-1F和SOS1-1R (表2)用于驗證電子克隆序列的正確性。采用TRIzol法,以NaCl處理過的YC05-179蔗苗為材料,提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板。PCR擴增體系總體積25 mL,含10′Ex Taq buffer 2.5 mL、10 mmol L-1dNTPs 2 mL、20 mmol L-1上下游引物各1.0 mL、Ex Taq酶0.125 mL、cDNA模板1.0 mL、ddH2O 17.375 mL。PCR反應(yīng)程序為:95℃預(yù)變性4 min,95℃變性30 s,48℃退火30 s,72℃延伸2 min,35個循環(huán);72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物切膠回收后連接到pMD19-T載體上,隨后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。將PCR擴增驗證篩選獲得的陽性單菌落的菌液送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.5甘蔗SOS1基因序列的生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)分析方法[38]如下。利用ORF finder在線軟件,對甘蔗SOS1基因進行開放閱讀框分析并翻譯;利用ExPASy中ProtParam pI/Mw (http://web.expasy.org/compute_pi/)在線工具對甘蔗SOS1基因所編碼蛋白一級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測;利用GOR IV (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_ gor4.html)進行甘蔗SOS1二級結(jié)構(gòu)預(yù)測;利用SWISSMODEL (http://swissmodel.expasy.org/)進行甘蔗SOS1三級結(jié)構(gòu)預(yù)測;利用SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行甘蔗SOS1蛋白信號肽分析;利用ProtScale (http://web.expasy.org/protscale/)進行甘蔗SOS1疏水性/親水性預(yù)測;利用Profun 2.2 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/)對甘蔗SOS1進行功能預(yù)測以及利用Psort (http://www.psort.org/)在線工具預(yù)測其亞細(xì)胞定位。同時,用NCBI上Blast工具進行同源氨基酸序列查找,并利用DNAMAN對所獲得同源氨基酸序列以及甘蔗SOS1蛋白序列進行序列比對,最后在MEGA6.0中采用NJ (Neighbor-Joining)法(BootStrap 1000)構(gòu)建進化樹。

1.6甘蔗SOS1基因表達的RT-qPCR分析

根據(jù)甘蔗ScSOS1基因序列設(shè)計定量PCR引物SOS1-2F和SOS1-2R (表1)。本試驗采用2個內(nèi)參基因CUL和CAC,內(nèi)參基因的定量引物見(表2)[39]。采用RT-qPCR技術(shù)檢測ScSOS1基因在甘蔗YC05-179上的相對表達量。PCR反應(yīng)體系(20 μL)含:SYBRGreen Primix Ex Taq (2×) 10 μL、上/下游引物(10 μmol L-1) 各0.8 μL、cDNA 2.0 μL、ddH2O 6.4 μL。根據(jù)ABI7500實時熒光定量PCR儀默認(rèn)程序設(shè)定實時定量PCR擴增程序為50℃ 2 min;95℃ 10 min;95℃ 15 s;60℃1 min;45個循環(huán);反應(yīng)時設(shè)置3次技術(shù)重復(fù),以無菌水作對照[40]。熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后,在ABI PRISM7500 Real-time PCR System軟件上對定量數(shù)據(jù)進行初步分析,導(dǎo)出數(shù)據(jù)文件,采用2-ΔΔCt[41]算法分析試驗結(jié)果。

2　結(jié)果與分析

2.1甘蔗ScSOS1基因序列的獲得

以小麥SOS1基因(GenBank登錄號為KJ563230) 的EST序列為探針,借助電子克隆技術(shù)結(jié)合RT-PCR擴增驗證,從甘蔗中分離獲得一條SOS1基因的cDNA序列。利用特異性引物進行RT-PCR擴增,產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝聚電泳得到單一條帶如圖1。經(jīng)測序驗證,電子克隆所得核酸序列與測序序列(圖2)的同源性達98.34％,表明電子克隆序列是正確的,最終得到的序列是使用2個克隆的測序結(jié)果校對所得的,其中部分堿基的差異可能是PCR擴增中的錯配所致。該基因被命名為ScSOS1,GenBank登錄號為KT003285。其cDNA序列片段長1403 bp,包含一個1272 bp的開放閱讀框,編碼一個423個氨基酸的蛋白。

表1　本研究電子克隆中用到的甘蔗EST序列Table 1　ESTs of sugarcane used in silicon cloning of this study

表2　ScSOS1基因克隆與表達所用引物Table 2　Primers used in ScSOS1 gene cloning and expression analysis

圖1　甘蔗ScSOS1基因的RT-PCR擴增Fig.1　RT-PCR amplification of ScSOS1 gene in sugarcaneM:marker 2000 bp;1:RT-PCR產(chǎn)物。M:DNA marker 2000 bp;1:RT-PCR product.

2.2甘蔗ScSOS1基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1甘蔗SOS1基因編碼氨基酸的一級結(jié)構(gòu)預(yù)測通過在線工具ExPASy中ProtParam pI/Mw,預(yù)測甘蔗ScSOS1基因編碼蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)顯示,該蛋白分子式為C2078H3357N621O622S19,分子量Mw 為47.6 kD,包含423個氨基酸殘基。SOS1蛋白等電點(pI)為9.12,有負(fù)電荷殘基(Asp+Glu) 47個,正電荷殘基(Arg+Lys) 54個,蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定系數(shù)(II)為60.01,平均疏水性(GRAVY)-0.396,脂肪系數(shù)(AI) 86.69。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)大于40,蛋白質(zhì)表現(xiàn)為不穩(wěn)定狀態(tài)[42],因此推測甘蔗ScSOS1基因編碼的蛋白質(zhì)為不穩(wěn)定的堿性蛋白質(zhì)。

2.2.2甘蔗ScSOS1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測和分析

根據(jù)GOR IV軟件預(yù)測,甘蔗SOS1蛋白無規(guī)則卷曲所占的比例高達51.30％,其次是α-螺旋占32.86％,延伸鏈所占比例是15.84％,β-螺旋的比例為0 (表3)。

圖2　甘蔗ScSOS1基因的RT-PCR擴增驗證所獲得的序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列(*:終止密碼子)Fig.2　Nucleotide acid sequence and deduced amino acid sequence of sugarcane ScSOS1 gene obtained by cloning (* stop codon)黑色框部分為特異性引物在基因序列中的位置。The sequence fragment complementary to primer is highlighted in black box.

表3　甘蔗ScSOS1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析Table 3　Secondary structure prediction of sugarcane ScSOS1 protein

2.2.3甘蔗ScSOS1蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測根據(jù)SWISSMODEL軟件預(yù)測,ScSOS1空間結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲和螺旋為主。比較甘蔗、玉米、小麥和水稻的ScSOS1蛋白的三維結(jié)構(gòu)虛擬圖,結(jié)果如圖3顯示,甘蔗ScSOS1蛋白的三級結(jié)構(gòu)與高粱、水稻、小麥和玉米SOS1蛋白的三級結(jié)構(gòu)都存在一定的差異。

2.2.4甘蔗ScSOS1蛋白信號肽預(yù)測和分析根據(jù)SignalP 4.1 Server軟件預(yù)測可知,第40位賴氨酸殘基具有最高的原始剪切位點分值0.130和最高的信號肽分值0.125,第39位丙氨酸殘基具有最高的綜合剪切位點分值0.267。由于最后獲得氨基酸殘基的加權(quán)平均值較小,為0.0.118 (遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0.5),推測ScSOS1基因所編碼的蛋白不存在信號肽,即為非分泌型蛋白,說明該蛋白在細(xì)胞質(zhì)中合成后不能被轉(zhuǎn)運(表4)。

2.2.5甘蔗ScSOS1蛋白疏水性/親水性的預(yù)測和分析蛋白質(zhì)的疏水性可根據(jù)蛋白的平均疏水性(GRAVY)值來預(yù)測,當(dāng)GRAVY大于零時,為疏水蛋白;當(dāng)GRAVY小于零時,為親水蛋白[43]。根據(jù)ProtScale軟件預(yù)測,第77位具有最高分值,為2.589,疏水性最強;第332位具有最低分值,為-3.644,親水性最強。平均疏水性(GRAVY) -0.396,故推測甘蔗S0S1蛋白是一種親水蛋白。

圖3　甘蔗、高粱、水稻、小麥和玉米SOS1蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3　Predicted third structure of SOS1 protein in sugarcane,sorghum,nice,wheat,and maize

表4　甘蔗ScSOS1蛋白信號肽預(yù)測Table 4　Signal P-NN prediction for sugarcane ScSOS1 protein

2.2.6甘蔗ScSOS1蛋白的功能預(yù)測根據(jù)Profun

2.2 Server軟件預(yù)測,該蛋白主要參與中間代謝,可能性為3.189,其次也可能參與翻譯、氨基酸生物合成及脂肪酸代謝,可能性依次為2.957、2.656和1.729。

2.2.7甘蔗ScSOS1亞細(xì)胞定位預(yù)測根據(jù)Psort軟件預(yù)測,甘蔗ScSOS1蛋白可能被定位于細(xì)胞核(60.0％),其次是微體(過氧化物酶體) (30.0％),再次是線粒體基質(zhì)的空間(10.0％)、溶酶體(10.0％)。

2.2.8甘蔗ScSOS1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測如圖4所示,甘蔗ScSOS1蛋白包含CAP-ED (catabolite gene activator protein-effector domain) superfamily和一個Crp domain (cAMP-receptor proteins),含有一個ligand結(jié)合位點和一個cNMP (cyclic nucleotide-monophosphate)結(jié)合位點。

圖4　甘蔗ScSOS1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.4　Conserved domain prediction of ScSOS1 protein

2.2.9甘蔗ScSOS1蛋白的氨基酸同源性分析

選擇高粱(Sorghum bicolor,gb|XP_002443674.1|)、海濱鹽草(Distichlis spicata,gb|ACZ05629.1|)、海棗(Phoenix dactylifera,gb|XP_008798100.1|)、黑麥草(Lolium perenne,gb| AAY42598.1|)、蘆葦(Phragmites australis,gb|BAF41924.1|)、水稻(Oryza sativa Indica Group,gb|EEC69753.1|)、小麥(Triticum aestivum,gb|AEI28609.1|)、小米(Setaria italica,g b | X P _ 0 0 4 9 6 3 3 5 4 .1 | )、玉米( Z e a m a y s ,gb|XP_008645743.1|)、中華大葉竹(Indosasa sinica,gb|AGB06353.1|)進行氨基酸同源性分析,與甘蔗ScSOS1蛋白的氨基酸序列相似性分別為87％、58％、53％、63％、72％、68％、64％、71％、81％和69％。從圖5可以看出,甘蔗ScSOS1蛋白與同屬單子葉植物的高粱的氨基酸相似性最高,而與海濱鹽草和海棗的的相似性較低。

圖5　甘蔗ScSOS1蛋白與其他植物種蛋白的氨基酸序列比對Fig.5　Homology analysis of sequences from sugercane ScSOS1 and those of other species

系統(tǒng)進化樹(圖6)顯示,同屬禾本科植物的甘蔗和高粱同源性最高。甘蔗、高粱、玉米、小米、黑麥草、小麥、水稻、中華大節(jié)竹、海濱鹽草和蘆葦為一個分支,海棗屬于棕櫚科,獨立地成為一個分支,但是甘蔗與高粱的親緣關(guān)系最近。

圖6　不同物種SOS1蛋白的系統(tǒng)進化分析Fig.6　Phylogenetic analysis of SOS1 protein sequences from different species

2.3甘蔗ScSOS1基因的組織特異性表達分析

組織特異性表達的RT-qPCR分析顯示(圖7),該基因的表達具有組織特異性,在甘蔗品種YC05-179的葉鞘、蔗皮、蔗髓、側(cè)芽、根等組織中均有表達,但是在根中的表達量最少,葉鞘中的表達量最高,約是根的23倍;其次是在蔗髓中的表達量,約為根的5倍。

圖7　甘蔗ScSOS1基因在不同組織中的表達Fig.7　Relative expression of ScSOS1 gene in different sugarcane tissues誤差線為每組處理的標(biāo)準(zhǔn)誤差(n = 3)。The error bars represent the standard error of each treating group (n = 3).

2.4甘蔗ScSOS1基因在不同外源脅迫下的表達特性分析

RT-qPCR表達分析結(jié)果表明,甘蔗ScSOS1基因在不同外源脅迫下具有不同的表達特性(圖8)。從圖中可以看出,在NaCl處理下,ScSOS1基因在甘蔗品種YC05-179中的表達量上調(diào),在24 h達到最高表達量,約為0 h的1.5倍。此外,該基因在48 h后的表達量逐漸下降但還是高于0 h的表達量。在PEG處理的3個時間點(6、12和24 h),ScSOS1基因的表達呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢,在24 h達到最高,約為0 h的4.0倍。在SA和ABA處理下,該基因的表達出現(xiàn)上調(diào)和恢復(fù)兩個階段,在6 h和12 h時呈現(xiàn)上調(diào)表達,在12 h后表達量均達到最高,分別是0 h的2.0和1.5倍,且都在處理24 h后恢復(fù)到與0 h相當(dāng)?shù)谋磉_水平。值得注意的是,與SA和ABA脅迫下的表達模式相反,在MeJA的處理下,ScSOS1基因的表達量先減少后增加,在6 h的表達量最低,約為0 h的0.5倍;12 h后該基因的表達量逐漸上升并在24 h到達最高,約為0 h的1.5倍。

3　討論

植物耐鹽性研究主要集中在鹽脅迫的信號傳導(dǎo)機制[44]。SOS信號途徑是植物鹽脅迫信號傳導(dǎo)的重要途徑之一[25]。其中,SOS1是SOS信號途徑的一個重要組成部分,與植物耐鹽性密切相關(guān)[25]。權(quán)庚等[31]的水稻轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炞C明,過量表達SaSOS1能夠增強水稻植株的耐鹽性。因此,克隆并研究甘蔗SOS1基因的特征特性及其在甘蔗耐鹽機制中的作用機理具有較為重要的理論和實踐意義。

本研究以小麥SOS1基因的EST序列為探針,采用電子克隆和RT-PCR擴增驗證相結(jié)合的方法,成功克隆到甘蔗ScSOS1基因。該基因具有完整的開放閱讀框。同源比對結(jié)果顯示,ScSOS1蛋白與高粱SbSOS1蛋白的同源性最高,達87.0％,說明SOS1基因的編碼蛋白在不同物種間具有較高的保守性。生物信息學(xué)分析顯示,甘蔗ScSOS1蛋白是一種親水性的不穩(wěn)定蛋白,這與Zhao[45]對玉米ZmSOS1基因的生物信息學(xué)分析的結(jié)果相同。Tang等[46]研究發(fā)現(xiàn)雖然胡楊SOS1蛋白主要定位于細(xì)胞膜,也有少量定位在細(xì)胞質(zhì)中。但是,本研究分析結(jié)果顯示,甘蔗ScSOS1蛋白可能定位于細(xì)胞核。此外,該蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要為無規(guī)則卷曲和α-螺旋,這與徐立新等[47]等獲得的木欖質(zhì)膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的二級結(jié)構(gòu)特征相符。從三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果可以看出,甘蔗ScSOS1與其他物種該蛋白的三級結(jié)構(gòu)都存在差異,與高粱的差異較小,而與水稻、小麥、玉米的差異較大,其原因可能是甘蔗與高粱的親緣關(guān)系較近而與其他物種的較遠(yuǎn)。保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示,ScSOS1蛋白含有一個CAP-ED superfamily,該結(jié)構(gòu)域包含一個分解代謝物激活蛋白并且該蛋白主要位于離子通道中,推測ScSOS1參與中間代謝和離子轉(zhuǎn)運。cAMP為細(xì)胞內(nèi)的第二信使,當(dāng)細(xì)胞外信號與相應(yīng)受體結(jié)合后,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP (cyclic adenosine monophosphate)的水平變化而引起細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)。本研究中,ScSOS1蛋白還含有一個Crp結(jié)構(gòu)域和一個cAMP受體結(jié)構(gòu)域,推測該蛋白可能是胞內(nèi)SOS信號通路最早的作用對象,這與Zhang等[30]的研究結(jié)論相符。

圖8　甘蔗ScSOS1基因在不同外源脅迫下的表達Fig.8　ScSOS1 gene expression of sugarcane under different exogenous stresses誤差線為每組處理的標(biāo)準(zhǔn)誤差(n=3)。The error bars represent the standard error of each treating group (n=3).

前人研究表明,SOS1基因在植物耐鹽和抵抗?jié)B透脅迫方面發(fā)揮了重要的作用[48-53]。周玲玲等[48]研究發(fā)現(xiàn),過量表達大葉補草LgSOS1基因的擬南芥,耐鹽性顯著提高。王姝杰等[49]研究表明,過表達藍藻質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因Nhap能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草Fl代的耐鹽性。此外,還有研究表明,在鹽脅迫下,質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因在擬南芥、苔蘚、胡楊、海草等植物中均呈現(xiàn)上調(diào)表達趨勢[50-53]。Munns等[54]認(rèn)為,植物激素與植物耐鹽性之間有著密切的聯(lián)系,其中ABA在植物應(yīng)答鹽脅迫過程中具有重要的作用,ABA是植物適應(yīng)鹽脅迫過程中的最初的信號物質(zhì)。RT-qPCR表達分析結(jié)果表明,ScSOS1基因在甘蔗葉鞘、蔗皮、蔗髓、側(cè)芽和根中均有表達,其中在葉鞘中的表達量最高,在根中的表達量最低,說明該基因在甘蔗中的表達具有組織特異性。此外,在NaCl處理條件下,ScSOS1基因被誘導(dǎo)表達,并在24 h的表達量達到最高,這與Zhao[45]研究玉米SOS1基因的表達分析結(jié)果相同,推測該基因可能在甘蔗耐鹽機制中起作用。ScSOS1基因的表達量在PEG、SA和ABA脅迫下都會增加,其中受PEG誘導(dǎo)最強烈并隨處理時間的延長而持續(xù)增加。前人研究表明,當(dāng)植物處于高鹽環(huán)境時,最先受到水分脅迫的影響[55],因此PEG是模擬滲透脅迫的理想物質(zhì)[56]。有文獻報道,ABA處理植株能增強其在鹽脅迫條件下的適應(yīng)能力[57]。謝崇波等[58]構(gòu)建的SOS轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中有依賴ABA途徑和不依賴ABA途徑,其中有25個基因與ABA信號途徑相關(guān)。本研究結(jié)果揭示,甘蔗ScSOS1基因可能在甘蔗耐鹽性方面發(fā)揮一定的作用,同時還可能參與了甘蔗的抗旱反應(yīng)。

4　結(jié)論

從甘蔗中成功克隆到一個ScSOS1基因,該基因包含一個1272 bp的開放讀碼框,編碼423個氨基酸。ScSOS1蛋白與高粱SbSOS1蛋白的氨基酸同源性最高,達87.0％。同時,該基因的表達具有組織特異性,在葉鞘中的表達量最大。ScSOS1基因在高鹽和其他非生物脅迫下的表達量都會增加,推測該基因可能在甘蔗耐鹽和抗旱的分子機制上發(fā)揮一定的作用。研究結(jié)果為甘蔗SOS家族基因中其他成員的克隆及其深入的功能解析積累了基礎(chǔ)資料。

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Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding (Fujian),Ministry of Agriculture,Fujian Agriculture and Forestry University/Sugarcane Research &Development Center,China Agricultural Technology System,Fuzhou 350002,China

Abstract:Salt overly sensitive 1 (SOS1) gene,encoding a Na+/H+antiport protein,plays an important role in biological processes of plants against salt stress.Using a SOS1 mRNA sequence from Triticum aestivum (KJ563230) as the probe,the homologous ESTs of sugarcane were obtained from NCBI database.A sugarcane cDNA sequence of SOS1 gene was cloned by in silico cloning combined with RT-PCR,and named as ScSOS1 (GenBank accession number:KT003285).The bioinformatics analysis showed that ScSOS1 has a length of 1403 bp with a complete open reading frame (ORF,107 to 1423 bp),encoding a 423 amino acid residues of sugarcane SOS1 protein with an estimated molecular weight of 47.6 kD and a calculated isoelectric point (pI) of 9.12.The protein of ScSOS1 belongs to a conserved CAP-ED superfamily.Yet the ScSOS1 protein has no signal peptide and belongs to hydrophilic protein with the main function for intermediary metabolism.The mainly secondary structure element of ScSOS1 protein is random coil.Real-time quantitative PCR (RT-qPCR) analysis revealed that ScSOS1 was tissue-specifically expressed in leaf sheath,bark,pulp,bud and root of sugarcane,with the highest expression in leaf sheath and the lowest in root.Besides,the expression of ScSOS1 gene could be regulated by the treatments of NaCl,PEG,ABA,SA,and MeJA,and up-regulated by the stresses of NaCl and PEG,with the highest inducible expression levels of 1.5 times and 4.0 times as high as those of control at 24 hours,respectively.This paper suggested that ScSOS1 involves in sugarcane tolerance salt and osmotic stresses.It can set up abook=502,ebook=41basis for the elucidation of sugarcane salt resistance mechanism.

Keywords:Sugarcane;SOS1 gene;in silico cloning;Bioinformatics;Real-time quantitative PCR

收稿日期Received():2015-09-07;Accepted(接受日期):2016-01-11;Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期):2016-01-19.

*通訊作者(

Corresponding author):闕友雄,E-mail:queyouxiong@126.com

DOI:10.3724/SP.J.1006.2016.00501