汪 影，楊 進(jìn)，劉 輝，畢繼蕊，衛(wèi)園園，操基玉，陸友金

C-8神經(jīng)酰胺對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞通透性及緊密連接蛋白的影響

汪 影1，楊 進(jìn)1，劉 輝1，畢繼蕊1，衛(wèi)園園1，操基玉2，陸友金1

目的研究外源性 C-8神經(jīng)酰胺對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（AECⅡ）單層通透性的影響，探討其作用機(jī)制。方法將體外分離培養(yǎng)的 AECⅡ通過差速貼壁法純化，在 Transwell上構(gòu)建 單層，待細(xì) 胞融合后給 予不同 濃度的 C-8神經(jīng)酰胺（0、25、50、100μmol／L）繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，應(yīng)用伏歐計測定跨上皮電阻值（TEER）及辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記法檢測吸光度（OD）值；分別提取細(xì)胞總蛋白及總 RNA，采用Western blot和實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方 法檢測不同濃度的 C-8神經(jīng)酰胺對 AECⅡ緊密連接蛋白 ZO-1和 Occludin蛋白水平和 mRNA水平表達(dá)的影響。結(jié)果不同濃度的 C-8神經(jīng)酰胺刺激融合的 AECⅡ單層 24 h后，各組間 TEER值、OD值 差 異 均 有 統(tǒng) 計 學(xué)意 義 （F=38.780、19.780，P＜0.001）。C-8神 經(jīng) 酰 胺 作 用 后，ZO-1、Occludin蛋 白 （F= 71.150，P＜0.01；F=7.703，P=0.002）及 mRNA（F= 4.887，P=0.014；F=3.637，P=0.048）表達(dá)量明顯降低。

神經(jīng)酰胺；緊密連接；肺上皮細(xì)胞；跨上皮電阻

急性 呼 吸窘迫綜合征 （acute respiratory distress syndrome，ARDS）最顯著的病理學(xué)變化是彌漫性肺泡上皮細(xì)胞損傷，包括肺泡上皮屏障、肺泡水清除、肺泡表面活性物質(zhì)的分泌等［1］。其中肺泡上皮屏障損傷是 ARDS發(fā)病環(huán)節(jié)中的重要一步，而肺泡上皮屏障發(fā)揮選擇性通透作用主要依賴于肺泡上皮細(xì)胞間緊密連接［2］。研究［3］表明，神經(jīng)酰胺在 ARDS肺水腫發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，其可抑制肺泡表面活性物質(zhì)生成而促進(jìn)肺水腫形成，然而目前有關(guān)神經(jīng)酰胺與肺泡上皮屏障之間關(guān)系的研究甚少。研究［4］表明神經(jīng)酰胺能夠增加腸道上皮細(xì)胞的通透性。該研究試圖在細(xì)胞水平上研究 C-8神經(jīng)酰胺對肺上皮屏障通透性的影響，初步探討其作用機(jī)制，為下一步抑制神經(jīng)酰胺生成從而治療ARDS提供理論依據(jù)，為 ARDS的診療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 SPF級 6～8周齡 ICR小鼠 8只，雌雄各半，20～25 g，由安徽省實驗動物中心提供。動物房溫度維持于 20～25℃，相對濕度（50± 5）%，每日光照時間約 12 h。將實驗鼠按雄：雌為 1∶1于 21∶00進(jìn)行合籠，次日 9∶00查陰栓，陰栓陽性者記為妊娠第1天。

1.1.2試劑及器材 DMEM、胰酶、胎牛血清（fatal bovine serum，F(xiàn)BS）、PBS均購自美國 Hyclone公司；C-8神經(jīng)酰胺購自美國 Cayman公司；Transwell小室購自美國 Corning公司；跨上皮電阻儀購自美國 Millipore公司；ZO-1單克隆抗體購自美國 Zymed公司；Occludin多克隆抗體購自美國 Abcam公司；RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國 Promega公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)條件及方法 參照王勇 等［5］方法將第 17天 ICR孕鼠頸椎脫臼法處死，于酒精中浸泡5 min，取出胎鼠后置于預(yù)冷 4℃無菌 PBS中，提取雙肺并盡量除去氣管、支氣管、血管等組織，潤洗 3遍后用無菌眼科剪于 5 min之內(nèi)剪成 1 mm3的小塊并用 PBS清洗直至液體清亮。0.25%胰蛋白酶消化組織塊 10 min，消化期間每隔 5 min震蕩 1次，隨即加入等體積的含有 10%FBS的 DMEM終止消化，過濾，1000 r／min（離心半徑為 156 mm）離心 5 min，棄上清液，加入含10%FBS的 DMEM制成細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1 h后換皿，重復(fù) 3次。24 h后換液，此時貼壁細(xì)胞即為肺泡 Ⅱ 型上皮 細(xì)胞（alveolar typeⅡ epithelial cells，AECⅡ）。

1.2.2胎鼠 AECⅡ的鑒定 ① 倒置相差顯微鏡觀察：運(yùn)用倒置顯微鏡觀察 AECⅡ貼壁生長情況及形態(tài)學(xué)特征；② 堿性磷酸酶 （alkaline phosphatase，AKP）染色法鑒定：將對數(shù)生長期的 AECⅡ接種到12孔板制作細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定，按照BCIP／NBT AKP顯色試劑盒說明書進(jìn)行操作；③ 透射電鏡鑒定：對數(shù)生長期的 AECⅡ經(jīng) PBS清洗，胰酶消化后，2 500 r／min（離心半徑為 156 mm）離心10 min，2.5%戊二醛固定、包埋，制作超薄切片，于透射電鏡下觀察。

1.2.3肺上皮細(xì)胞單層通透性 ① 跨上皮電阻（transepithelial electrical resistance，TEER）的 測 定：AECⅡ以 3×105／cm2接種于 Transwell的頂層小室微孔膜上，根據(jù)本課題組前期 MTT實驗結(jié)果［6］，隨機(jī)分為 0、25、50、100μmol／L C-8神經(jīng)酰胺培養(yǎng) 24 h，應(yīng)用跨上皮電阻測量儀檢測各組 TEER。② 辣根過氧化物酶標(biāo)記法（horseradish peroxidase notation，HRP）：細(xì)胞融合后加入終濃度為 0、25、50、100 μmol／LC-8神經(jīng)酰胺培養(yǎng) 24 h，棄去上室培養(yǎng)液，加入濃度為 0.34 mg／ml HRP的 DMEM，孵育 1 min后，取下室液 60μl，加入 860μl混合反應(yīng)液（50 mmol／L NaH2PO4和 5 mmol／L愈創(chuàng)木酚）及 100μl新鮮配制的 0.6 mmol／L H2O2溶液，置于 12孔板中，室溫反應(yīng) 15 min后檢測波長在 470 nm 下的HRP吸光度（optical density，OD）變化。

1.2.4Western blot法檢測緊密連接蛋白的表達(dá)給予不 同 濃 度 的 C-8神 經(jīng) 酰 胺 （0、25、50、100 μmol／L）刺激后消化收集各組細(xì)胞，裂解離心（12 000 r／min，離心 10 min）提取蛋白質(zhì)。二烷基硫酸鈉 -聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，再轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉 90 min，TBST漂洗 10 min×3次；分別加入抗 ZO-1鼠單抗（1∶200）、抗 Occludin兔多抗（1∶250）4℃過夜，TBST漂洗 3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶100 000）于搖床室溫孵育 75 min，TBST漂洗 10 min×4次，ECL顯色。用天能圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.2.5實時定量 PCR檢測緊密連接 mRNA的表達(dá)

提取 RNA，逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò) 增。本 實 驗 所用 引 物 使用 PubMed在 線Primer3軟件設(shè)計，由上海生工公司合成，小鼠各基因引物序列見表1。

表1 各基因引物序列和基因片段長度

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用 SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，正態(tài)性數(shù)據(jù)以 ˉx±s表示；兩組之間的均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本 t檢驗，多組間的均數(shù)比較采用方差分析；兩兩比較采用 LSD檢驗。

2 結(jié)果

2.1 AECⅡ細(xì)胞鑒定倒置顯微鏡下觀察到原代培養(yǎng)18～24 h后，AECⅡ貼壁伸展，呈圓形或立方形，胞質(zhì)內(nèi)有大量細(xì)小顆粒圍繞細(xì)胞核分布（圖1A）；體外培養(yǎng)24 h后進(jìn)行 AKP染色，細(xì)胞內(nèi) AKP反應(yīng)產(chǎn)物呈深藍(lán)色（圖1B）；透射電鏡下可見 AECⅡ內(nèi)有特征性的板層小體（箭頭所示），于細(xì)胞膜上有時可見微絨毛（圖1C）。

2.2 C-8神經(jīng)酰胺對AECⅡ單層細(xì)胞通透性的影響隨著 C-8神經(jīng)酰胺濃度的增加，TEER值逐漸下降，各組間 TEER值差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （F= 38.780，P＜0.001）。不同濃度組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。HRP測定結(jié)果顯示，隨著濃度的增加 OD值呈上升趨勢，各組間 OD值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=19.780，P＜0.001），神經(jīng)酰胺 50μmol／L組和 100μmol／L組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表 2。

圖1 AECⅡ細(xì)胞鑒定圖片A：倒置顯微鏡下可見 AECⅡ呈圓形或立方形 ×200；B：顯微鏡下可見細(xì)胞內(nèi)的 AKP反應(yīng)產(chǎn)物呈深藍(lán)色 AKP染色 ×200；C：電鏡下可見 AECⅡ內(nèi)有特征性板層小體 ×15 000

表2 不同濃度 C-8神經(jīng)酰胺對 AECⅡ單層通透性的影響（n=5，ˉx±s）

2.3 C-8神經(jīng)酰胺對AECⅡ緊密連接蛋白表達(dá)的影響采用 Western blot法檢測各組 ZO-1和 Occludin蛋白的表達(dá)情況（圖2），結(jié)果顯示各組 ZO-1的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=71.150，P＜0.001）。C-8神經(jīng)酰胺各劑量組與對照組相比，ZO-1的表達(dá)均顯著下調(diào)（P＜0.05）。各組 Occludin的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=7.703，P=0.002）。神經(jīng)酰胺50μmol／L組和 100μmol／L組與對照組相比，Occludin的表達(dá)均下調(diào)（P＜0.05）。

圖2 C-8神經(jīng)酰胺對 AECⅡ緊密連接蛋白表達(dá)的影響1：0μmol／L組；2：25μmol／L組；3：50μmol／L組；4：100μmol／L組；A：ZO-1；B：Occludin；與對照組（0μmol／L）比較：*P＜0.05

2.4 C-8神經(jīng)酰胺對AECⅡ緊密連接mRNA表達(dá)的影響C-8神經(jīng)酰胺作用后，ZO-1及 Occludin mRNA表達(dá)水平均有所下調(diào)（ZO-1：F=4.887，P= 0.014；Occludin：F=3.637，P=0.048），與對照組相比，C-8神經(jīng)酰胺 100μmol／L組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

圖3 C-8神經(jīng)酰胺對 AECⅡ緊密連接 mRNA表達(dá)的影響A：ZO-1；B：Occludin；與對照組（0μmol／L）比較：*P＜0.05

3 討論

ARDS是臨床高病死率疾病，目前尚缺乏有效的診 斷 及 治 療 手 段［7］。 既 往 研 究［8-9］顯 示，在ARDS發(fā)生過程中，緊密連接蛋白表達(dá)和分布發(fā)生改變，對液體和蛋白質(zhì)經(jīng)細(xì)胞旁途徑選擇性通透作用增強(qiáng)而導(dǎo)致肺水腫。當(dāng)機(jī)體遭受應(yīng)激刺激時，神經(jīng)酰胺可作為“第二信號分子”發(fā)揮信號傳導(dǎo)作用，放大炎癥反應(yīng)引起組織損傷［10］。前期研究［6］已驗證神經(jīng)酰胺可引起肺泡細(xì)胞損傷，本研究顯示在神經(jīng)酰胺刺激下 TEER顯著下降，OD值呈上升趨勢，即神經(jīng)酰胺導(dǎo)致肺泡上皮通透性增加，且這種變化具有一定的濃度依賴性。在哺乳動物體內(nèi)，多種神經(jīng)酰胺合酶可催化合成不同長度酰基鏈的神經(jīng)酰胺。研究［11］表明 C-8神經(jīng)酰胺水溶性較好，細(xì)胞膜穿透力較強(qiáng)，對細(xì)胞的增殖分化具有更明顯的影響，故本實驗使用 C-8神經(jīng)酰胺作為研究對象。

在 ARDS動物模型中神經(jīng)酰胺增加［12］，通過抑制神經(jīng)酰胺表達(dá)可以減輕肺水腫、炎癥反應(yīng)，改善小鼠生存率［13］。同時神經(jīng)酰胺參與腸上皮屏障及皮膚上皮屏障功能的調(diào)節(jié)［4］，本研究表明神經(jīng)酰胺通過降低緊密連接蛋白的表達(dá)增加肺泡上皮細(xì)胞的通透性。本研究中4組間 AECⅡ各緊密連接表達(dá)量有明顯差異，Western blot顯示隨著神經(jīng)酰胺劑量的增加，ZO-1及 Occludin表達(dá)逐漸減弱；應(yīng) 用 Realtime PCR檢測到給予 100μmol／L神經(jīng)酰胺刺激后AECⅡ表達(dá) ZO-1、Occludin mRNA明顯降低。上述結(jié)果提示 C-8神經(jīng)酰胺可能通過緊密連接影響肺上皮通透性，同時也可表明神經(jīng)酰胺對緊密連接 ZO-1和 Occludin的調(diào)節(jié)主要發(fā)生在蛋白水平，加大劑量才發(fā)生轉(zhuǎn)錄水平的變化，這可能與神經(jīng)酰胺導(dǎo)致的損傷是個急性損傷有關(guān)，具體機(jī)制仍有待研究。

綜上所述，本研究顯示 C-8神經(jīng)酰胺能夠增加AECⅡ單層細(xì)胞的通透性，下調(diào)緊密連接蛋白的表達(dá)，這些蛋白可能是神經(jīng)酰胺增加肺上皮屏障通透性的作用靶點，為進(jìn)一步研究神經(jīng)酰胺引起肺上皮屏障功能受損的分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)，同時為 ALI提供新的診斷思路及治療靶點。

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Effects of C-8 ceram ide on themonolayer permeability and the tight junction proteins in alveolar epithelial typeⅡ cells

Wang Ying，Yang Jin，Liu Hui，et al
（Dept of Respiratory Medicine，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

Objective To study the impactof C-8 ceramide on the alveolar epithelial barrier and the tight junction proteins of alveolar epithelial typeⅡ cells（AECⅡ）.Methods The primarily cultured AECⅡ was purified by differential adherencemethod.The cellswere seeded on Transwell polyestermembranes to construct in vitro models of AECⅡ monolayerswith different concentrations of C-8 ceramide（0，25，50，100μmol／L）for24 hourswhen they became fused.Themonolayer permeability wasmeasured by transepithelial electrical resistance（TEER）and horseradish peroxidase notation（HRP）.The total protein and RNA were extracted from AECⅡ.Western blot and real-time quantitative pclymerase chain reaction were used to detect the protein and mRNA levelsof ZO-1，Occludinrespectively.Results Stimulated with different concentration of C-8 ceramide for 24 h，the TEER of cells decreased（F=38.78，P＜0.001）and the OD470increased（F=19.78，P＜0.001）significantly.Results from Western blot and RT-PCR demonstrated significant decrease of ZO-1（F=71.150，P＜0.01；F=4.887，P= 0.014）and Occludin（F=7.703，P=0.002；F=3.637，P=0.048）expression in the AEC Ⅱ with C-8ceramide.Conclusion C-8 ceramidemay disrupt the alveolar epithelial barrier by decreasing expression of ZO-1 and Occludin.

ceramides；tight junction；pulmonary epithelial cell；trans-epithelial electrical resistance

R 563

A

1000-1492（2016）02-0195-05

時間：2016-1-20 10：32：26

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.020.htm l

2015-11-23接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81400058）；安徽省自然科學(xué)基金項目（編號：1208085QH165）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，合肥 2306012安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，合肥 230032

汪 影，女，碩士研究生；陸友金，男，副教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：luyougolden＠hotmail.com

結(jié)論C-8神經(jīng)酰胺可能通過下調(diào)緊密連接蛋白的表達(dá)增加肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞通透性。