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采用基因鑒定方法控制微生物污染

利用遺傳基因方法檢測和鑒定導(dǎo)致紙廠清水系統(tǒng)污染的微生物，一旦某種微生物被確定，即可采用現(xiàn)有殺菌劑制訂最適宜的方案有效地處理問題微生物。與傳統(tǒng)方法相比，該方法具有快速、準(zhǔn)確和操作簡單的特點(diǎn)。該文介紹了這一新型實(shí)用的微生物污染控制方法及其在6家紙廠的應(yīng)用情況。

造紙系統(tǒng)中清水的污染會導(dǎo)致絲狀菌沉積，其沉積物統(tǒng)稱為“粉紅泥渣”。采用現(xiàn)代微生物控制系統(tǒng)難以處理這些沉積物，而紙廠的腐蝕現(xiàn)象令工廠擔(dān)憂。我們采用DNA指紋圖譜分析鑒定清水中的污染微生物，一旦微生物被分離和確定，即可采用現(xiàn)有殺菌劑制訂最適宜的方案并有效地處理沉積物。盡管可以采用類似的方法鑒定這些問題微生物，但是控制這些問題微生物所用的最佳產(chǎn)品以及所需要的最低抑菌濃度（MIC）差別較大。

采用現(xiàn)代前沿技術(shù)鑒定問題微生物，不僅可以為客戶提供先進(jìn)的控制助劑，而且可以將這些結(jié)果信息輸入數(shù)據(jù)庫，有助于識別和處理其他工廠出現(xiàn)的問題。

1　概述

眾所周知，微生物會通過原材料、水、土壤和空氣等多種渠道進(jìn)入造紙生產(chǎn)系統(tǒng)。造紙生產(chǎn)過程中微生物的不可控生長會給生產(chǎn)系統(tǒng)帶來各種問題，包括產(chǎn)生臭味、紙斑、斷紙、粘滑、管道堵塞和腐蝕等。通常采用殺菌劑、分散劑或者煮沸的方法控制微生物。

對生產(chǎn)系統(tǒng)的微生物進(jìn)行深入檢測對制備有效的微生物控制劑會大有幫助，因?yàn)闄z測結(jié)果會提供微生物的種類、性質(zhì)和相對多度。檢測通常采用顯微鏡、肉眼觀測、ATP檢測和微生物平板計(jì)數(shù)法。

利用DNA法檢測和鑒定微生物越來越普遍。將DNA法用于皮革工業(yè)和制漿造紙工業(yè)，對于深入了解微生物菌群在這些環(huán)境中的知識具有重要意義。如果這些方法能夠有效檢測和鑒定紙廠中的問題微生物，這將有利于紙廠微生物的污染控制。

本文介紹了基因鑒定方法，該方法能夠有效鑒定微生物，且常與其他檢測方法聯(lián)合共同用于微生物的控制。與此同時，本文也介紹了將這些方法用于控制6家工廠中“粉紅泥渣”沉積的結(jié)果。

2　細(xì)菌的取樣和分離

采用DNA檢測法的第1步是選擇取樣點(diǎn)，通常會選擇含有水和腐漿沉積物的幾個點(diǎn)，將腐漿沉積物連同水一并收集，然后送入實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物分析。樣品送入實(shí)驗(yàn)室后需要立即進(jìn)行處理分析。利用生理鹽水對樣品進(jìn)行連續(xù)稀釋，然后置于計(jì)數(shù)培養(yǎng)基、R2A培養(yǎng)基、Stokes培養(yǎng)基和放線菌分離培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將培養(yǎng)基置于溫度30℃或溫度45～50℃環(huán)境中（具體溫度取決于現(xiàn)場條件）培養(yǎng)2～7天，選擇菌落，重新劃線以獲得純培養(yǎng)細(xì)菌；也可以采用平板劃線法分離細(xì)菌，但是我們通常采用連續(xù)稀釋的方法，因?yàn)樵摲椒ㄓ兄谠u估容易產(chǎn)生污染的細(xì)菌數(shù)量。

3　 DNA制備

基因鑒定細(xì)菌法是基于美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（Applied Biosystem，位于加利福尼亞福斯特城）的MicroSep系統(tǒng)。該方法需要利用純培養(yǎng)細(xì)菌的DNA。采用配套的PrepMan Ultra試劑盒提供的儀器從純培養(yǎng)細(xì)菌中提取DNA。

4　基因擴(kuò)增

在獲取DNA之后，需要進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）。PCR是一種基因擴(kuò)增技術(shù)，并能復(fù)制百萬計(jì)的具有特定基因序列的DNA。鑒定真細(xì)菌時，16S rRNA基因被擴(kuò)增。該基因可用于大多數(shù)細(xì)菌的鑒定，因?yàn)?6S rRNA存在于所有細(xì)菌的基因組中。16S rRNA基因具有保守性，在基因變革過程中，16S rRNA幾乎保持恒定。此外，16S rRNA具有顯著的序列變異區(qū)，用以區(qū)分和鑒定不同種類的細(xì)菌。

PCR反應(yīng)混合液包括DNA模板、反應(yīng)引物、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶、核苷酸（dNTP）、鎂離子和緩沖溶液。MicroSeq 500 16S rRNA細(xì)菌鑒定PCR Kit系統(tǒng)包括所有16S rRNA基因擴(kuò)增的試劑和方法。

在反應(yīng)的最后，選取反應(yīng)混合物試樣和瓊脂糖凝膠來確定PCR反應(yīng)是否成功。如果能夠在凝膠上觀測到預(yù)期產(chǎn)物帶，則PCR反應(yīng)成功，最后需要清洗最終產(chǎn)物中的未反應(yīng)試劑。

5　 16S rRNA基因序列和數(shù)據(jù)分析

清洗后的擴(kuò)增DNA用于循環(huán)測序，主要是分析特定DNA片段的堿基（ATGC）序列或排列方式。循環(huán)測序法采用4種不同的熒光染色劑標(biāo)記DNA中的相應(yīng)堿基。

各菌系的16S rRNA基因序列采用MicroSeq 500 16S rRNA細(xì)菌鑒定系統(tǒng)確定。循環(huán)測序之后，按照廠商提供的方法清洗反應(yīng)混合物，去除未反應(yīng)試劑和未聯(lián)合染色劑。

然后，將經(jīng)循環(huán)測序后的反應(yīng)產(chǎn)物置于自動DNA測序儀上進(jìn)行電泳測試。

利用美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的MicroSeq微生物分析和數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)進(jìn)行序列分析和細(xì)菌鑒定。如果未找到匹配的細(xì)菌系列，則需要開展GenBank或Ribosomal數(shù)據(jù)項(xiàng)目的BLAST研究進(jìn)行可能的匹配。

6　結(jié)果與討論

在制定適宜的微生物污染控制體系之前，需要應(yīng)用基因鑒定系統(tǒng)，分析粉紅泥渣沉積物中“粉紅泥渣”的組分。實(shí)驗(yàn)所用試樣分別取自美國、中國、德國和捷克的工廠，進(jìn)行具體鑒定實(shí)驗(yàn)的純培養(yǎng)細(xì)菌來自其中的3家工廠。對于余下的試樣，嘗試分離粉色或紅色細(xì)菌。

在進(jìn)行研究的6家工廠中，產(chǎn)生粉紅泥渣的主要細(xì)菌源包括Flectobacillussp、Runellasp、Meiothermusruber、Deionococcusgeothermalis和Serratiamarcescens。表1所示為不同工廠的細(xì)菌鑒定結(jié)果。

表1　6家工廠沉積物中“粉紅泥渣”的細(xì)菌組成

Flectobacillus sp.是粉紅絲狀細(xì)菌，本研究發(fā)現(xiàn)在3家工廠中都含有這種細(xì)菌。根據(jù)在其他工廠的研究經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為這種粉紅絲狀細(xì)菌是導(dǎo)致現(xiàn)代紙機(jī)粉紅泥渣產(chǎn)生粉紅色的主要原因。在其中的一家工廠中，同時發(fā)現(xiàn)了Flectobacillus sp.和紅色短桿菌Rhodovariuslipocyclicus。Rhodovarius sp已被發(fā)現(xiàn)存在于其他領(lǐng)域，但是并未有發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌存在于紙機(jī)環(huán)境中的信息。

在其中一家工廠，產(chǎn)生粉紅泥渣的原因是Runellasp絲狀細(xì)菌，這些細(xì)菌是從廢水處理廠和水體中分離而來，但是至今為止，尚未發(fā)現(xiàn)其他紙廠中出現(xiàn)這類細(xì)菌的信息報(bào)道以及這些細(xì)菌與粉紅泥渣之間聯(lián)系的報(bào)道。

Meiothermusruber和Deionococcusgeothermalis是其中一家工廠產(chǎn)生粉紅泥渣的原因。在這家工廠中，Meiothermusruber被認(rèn)為是粉紅或紅色細(xì)菌的主導(dǎo)。這些有機(jī)微生物是中毒嗜熱菌，在溫度45～50℃時被分離。泥渣沉積物中Meiothermussp和Deionococcusgeothermalis是導(dǎo)致紙廠產(chǎn)生紅色或粉紅泥渣的原因，這一觀點(diǎn)已有相關(guān)報(bào)道。

20世紀(jì)50年代，有研究認(rèn)為紙廠中的粉紅泥渣主要與Serratiasp有關(guān)，但是近年來眾多的研究表明，除Serratiasp之外許多其他的細(xì)菌也是產(chǎn)生粉紅泥渣的原因。其中，在本研究中的一家工廠，我們發(fā)現(xiàn)Serratiamarcescens是主要的粉紅或紅色細(xì)菌，且是紙廠中產(chǎn)生粉紅泥渣的原因，如圖1和圖2所示。近年來對Serratiasp研究較少的原因主要包括設(shè)備設(shè)計(jì)和運(yùn)行、造紙工藝、漿料種類、殺菌劑及其他助劑的變化。

實(shí)驗(yàn)中，大量的細(xì)菌被分離且進(jìn)行了16S rRNA基因測序，但是不能最終“命名”這些細(xì)菌，因?yàn)槟承┘?xì)菌未被完全表征或者在實(shí)驗(yàn)條件下未進(jìn)行純培養(yǎng)，所有這些細(xì)菌被認(rèn)定為“未培養(yǎng)/未鑒定”細(xì)菌。采用序列鑒定法進(jìn)行檢測的其中一個優(yōu)點(diǎn)是，可以將這些“未培養(yǎng)/未鑒定”細(xì)菌保存在研究數(shù)據(jù)庫中，以便在未來的研究中應(yīng)用。龐大的數(shù)據(jù)庫以及控制細(xì)菌的經(jīng)驗(yàn)為粉紅泥渣的研究提供了可靠的工具。

綜上所述，本研究所用的鑒定系統(tǒng)具有比傳統(tǒng)方法更加快速、準(zhǔn)確和簡便的特點(diǎn)。這種方法可以在短時間內(nèi)鑒定大量的微生物。16S rRNA基因序列儲存在數(shù)據(jù)庫中，在需要時可以隨時查詢。此外，還可以確定大多數(shù)微生物對各種不同的控制劑的敏感性，這一信息可用于在特殊情況下及時作出控制細(xì)菌的合適決策。

（楊揚(yáng)編譯）

圖1　 Serratiamarcescen“s紅色泥渣”

圖2　 Serratiamarcescens培養(yǎng)細(xì)菌