施　泉，陳曉沛，林新春，徐永漢，徐英武（浙江農林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江臨安311300）

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雷竹和擬南芥SOC1多聚體差異性分析

施泉，陳曉沛，林新春，徐永漢，徐英武
（浙江農林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江臨安311300）

摘要：MADS-box是一個超家族基因，可通過形成多聚體復合物實現對花發(fā)育的調控。其中SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO1（SOC1）作為MADS-box家族的重要成員，對花形成時間起決定作用。作為轉錄因子蛋白，SOC1包含MADS，I，K和C 4個獨特功能的結構域，發(fā)揮功能的過程中，其中K結構域能夠調控同源或是異源蛋白多聚體的形成，I結構域能夠穩(wěn)定轉錄因子結合DNA的作用。在單子葉植物雷竹Phyllostachys violascens和擬南芥Arabidopsis thaliana中，開花時間模式上存在明顯差異，前者開花時間不確定，后者是確定的。盡管不能直接推斷這種現象與SOC1形成植物不同復合物相關聯，但雷竹和擬南芥SOC1是否具有形成相同模式的復合物對于竹類植物開花時間的研究具有重要意義。以雷竹和擬南芥SOC1作為研究對象，通過酵母雙雜交實驗，重點分析SOC1在形成多聚體模式方面的差異性。結果表明：擬南芥SOC1能形成同源二聚體，并且可通過結構域是I和K區(qū)形成同源多聚體；而雷竹SOC1不能形成多聚體，但可以通過K結構域形成同源二聚體。因此，I結構域可能是引起擬南芥和雷竹SOC1多聚體狀態(tài)不同的一個原因，這個結構域是否對開花定時起決定作用還有待進一步轉基因功能驗證。圖5表2參29

關鍵詞：植物學；MADS-box；SOC1；雷竹；擬南芥；酵母雙雜交；多聚體狀態(tài)；I和K結構域

植物從營養(yǎng)生長向生殖生長的過程中，花的發(fā)育是一個重要的環(huán)節(jié)，由一系列外部環(huán)境和內部因子決定［1-2］。大多數MADS-box基因參與花發(fā)育的不同階段，相互之間可形成復雜的復合物并構成復雜的網絡，控制花發(fā)育的整個過程［2-4］。SOC1基因作為MADS-box家族中的一員，能夠整合自主途徑、春化途徑、光周期途徑和赤霉素途徑中的信號分子，作用于下游特異性基因，進而調控花期［2, 5］。在光周期途徑中，SOC1不僅受CO的調控，同時SOC1還反饋作用于CO。實驗表明CO的過量表達能夠促進下游基因SOC1的表達，此外功能缺失的SOC1可以通過CO轉基因植株而提前開花［6-9］。SOC1基因的活化同時受到開花素蛋白FT的調控，另外在調控開花時，FT和FD的共同作用可以提高SOC1基因的表達［10-11］。SOC1編碼的蛋白屬于MIKC型轉錄因子，其結構域中MADS盒子能夠與特異性的DNA結合形成復合物［12-13］，并且與其他蛋白相互作用調控靶基因的表達［14］。SOC1的C末端屬于保守的motif結構域［14-15］，且能夠調整MADS結構域的相互作用，穩(wěn)定或增強K結構域介導的相互作用［16］。植物開花過程中，SOC1不僅能夠與AGL24形成異源二聚體，整合開花信號來促進開花［16-17］，還能夠作為赤霉素（GA）的靶基因調控開花［1, 18-19］。植物開花具有多樣性特征，如木本植物雷竹Phyllostachys violascens，開花時間不確定，通常零星開花，且開花類型復雜多樣，花序為假花序，結實率低［20］。草本植物擬南芥Arabidopsis thaliana開花時間和形態(tài)具有確定性。雷竹和擬南芥開花時間特征明顯不同，開花整合因子SOC1在這2種植物中均已被發(fā)現［21］，并且PvSOC1在雷竹開花過程中的作用做了初步研究。作為研究SOC1對開花時間多樣性作用的開始，這里我們分析雷竹和擬南芥SOC1在多聚體形成方面是否存在差異。研究采用同源克隆的方法，分別獲得成花開關基因PvSOC1［21］和AtSOC1，同時構建2個基因全長的酵母雙雜交載體，利用酵母雙雜交方法，分析形成同源聚集狀態(tài)的差異。通過構建不同結構域酵母雙雜交載體，確定引起多聚體差異性對應的結構域。這一研究結果，對于理解SOC1基因在雷竹和擬南芥定時開花過程中的特異性作用，提供了一定的實驗基礎。

1　材料與方法

1.1實驗材料

研究所用材料來自于實驗室大棚內的已開花雷竹和溫室內栽植的哥倫比亞野生型擬南芥。AtSOC1在開花的野生型擬南芥花、莖、葉中均有表達［4］，故分別采取開花雷竹和擬南芥的莖、葉、花等不同組織，用液氮速凍保存，實驗材料放置-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2RNA的提取和cDNA的反轉錄

將不同組織部位的樣品等比例混合，用液氮磨碎，根據總核糖核酸（RNA）提取法（Trizol法）提取植物組織混合樣品RNA，以10.0 g·L-1的瓊脂糖凝膠電泳對RNA進行質量檢測；采用PrimeScriptTM進行RNA的反轉錄，反轉錄的cDNA用于基因的克隆。

1.3PvSOC1和AtSOC1的基因克隆

根據美國生物技術信息中心（NCBI）中已知的擬南芥AtSOC1序列和實驗室得到的雷竹PvSOC1序列，設計引物（表1），聚合酶鏈式反應（PCR）反應擴增目的片段，反應體系：cDNA 2.0 μL，10×PCR緩沖液3.0 μL，三磷酸堿基脫氧核苷酸（dNTPs）3.0 μL，上下游引物各1.5 μL，去離子水補足30.0 μL。瓊脂糖凝膠電泳檢測目的片段的擴增，膠回收目的片段，純化后的產物連接到pMD-19（simple）載體上，轉入感受態(tài)細胞DH5α藍白斑篩選，PCR驗證，提取質粒送往生物公司測序。

1.4PvSOC1和AtSOC1氨基酸序列分析

采用BioEidt軟件對PvSOC1-like基因序列進行翻譯，NCBI中進行氨基酸序列對比，結合DANman軟件，進行PvSOC1-IKC（缺少MADS結構域部分）氨基酸序列同源性分析。

1.5PvSOC1和AtSOC1自激活活性檢測

采用特異性引物（表1），構建SOC1酵母雙雜交載體，雙酶切產物分別連入pGADT7（AD-Active domain）和pGBKT7（BD-Binding domain）載體中去，轉入感受態(tài)細胞DH5α，陽性單克隆提取質粒測序驗證序列正確性，LiAc轉化法將AD和BD重組載體分別轉入Y187和AH109感受態(tài)細胞中，分別涂布在缺少亮氨酸和色氨酸（SD/-Leu和SD/-Trp）的培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3～5 d，挑取單克隆活化培養(yǎng)進行菌液PCR驗證，陽性單克隆采用點滴法在含有X-a-Gal的缺陷培養(yǎng)皿上進行自激活活性檢測，其中AD和BD載體為陰性對照，PcL為陽性對照。30℃培養(yǎng)，觀察菌斑顯色情況。

表1　實驗過程中所用的引物Table 1 Primer sequences used in experiment

1.6PvSOC1和AtSOC1多聚體分析檢測

經過驗證的陽性單克隆菌液AD-PvSOC1/AtSOC1（或BD-PvSOC1/AtSOC1）分別與BD-PvSOC1/AtSOC1（AD-PvSOC1/AtSOC1），BD（AD）空載雜交，分別吸取10.0 μL的菌液，600.0 μL的完全培養(yǎng)劑（YPDA）液體過夜培養(yǎng)，100.0 μL培養(yǎng)液涂布在同時缺少亮氨酸和色氨酸（SD/-Leu-Trp）的培養(yǎng)皿上，30℃培養(yǎng)3～5 d，挑取單克隆在液體培養(yǎng)基SD/-Leu-Trp中培養(yǎng)，吸取10.0 μL培養(yǎng)液，點滴在含有X-a-Gal的4缺（SD/-Leu-Trp-Ade-His）固體培養(yǎng)皿上培養(yǎng)，觀察是否顯色，如果單克隆變藍證明發(fā)生相互作用形成二聚體結構。

1.7PvSOC1和AtSOC1不同結構域載體的構建并轉入酵母細胞

將PvSOC1和AtSOC1分成M，I，K和C 4個不同的結構域，構建包括M，MIK，KC和C不同結構域的酵母雙雜交載體，設計引物（表1），純化的PCR產物經雙酶切后分別連入AD和BD載體中去，轉入DH5α，菌液檢測陽性克隆，提取質粒。采用LiAc轉化法，PEG3350/DMSO制備感受態(tài)細胞。轉入酵母宿主中去，在相應的缺陷培養(yǎng)皿上培養(yǎng)，挑取單克隆驗證插入片段的大小。

1.8結構域重組體自激活活性檢測和多聚體分析

將不同結構域酵母雙雜載體雜交培養(yǎng)，在SD/-Leu-Trp培養(yǎng)皿上篩選雜合體，并在含有X-a-Gal的SD/-Leu-Trp缺培養(yǎng)皿上進行顯色反應。為進一步確定實驗的結果，將SD/-Leu-Trp缺培養(yǎng)皿上挑選出來的單克隆并在SD/-Leu-Trp+X-a-Gal培養(yǎng)皿上進行生長狀態(tài)的培養(yǎng)，觀察酵母的生長狀態(tài)。

2　結果與分析

2.1PvSOC1和AtSOC1目的片段的結構域分析

部分結構域同源性分析結果表明：雷竹和其他SOC1基因序列存在差異性的部位主要集中在I和C結構域。不同的植物中I結構域差異性極大，大約有10～20個氨基酸組成。另外，C結構域氨基酸保守性較差，多疏水氨基酸結構。I和C結構域之間具有相對保守性的K結構域（圖1）。

圖1　結構域示意圖和不同植物SOC1局部氨基酸序列對比Figure 1 Structural diagrams and amino acid sequence alignment

2.2全長PvSOC1和AtSOC1自激活和多聚體分析

實驗結果分析可表明：雷竹PvSOC1和擬南芥AtSOC1都不存在自激活活性（圖2A）。酵母雙雜交多聚體分析結果表明：雷竹PvSOC1蛋白自身不存在相互作用，而AtSOC1易形成二聚體現象，自身相互作用（圖2B和圖2C）。

圖2　PvSOC1和AtSOC1自激活檢測和酵母雙雜交實驗Figure 2 Analysis of transcriptional activation and polymerization for PvSOC1 and AtSOC1

2.3雷竹PvSOC1不同結構域雙雜交分析

PvSOC1基因不同結構域酵母雙雜交實驗可知：AD/BD-M/MIK/KC/C不存在自激活活性現象（圖3B），不同結構域雙雜實驗可知PvSOC1中的KC結構域存在二聚體現象，自身相互作用；M，MIK和C結構域蛋白沒有相互作用，圖3C為陽性與陰性對照組（圖3）。

圖3　PvSOC1和AtSOC1不同結構域蛋白酵母轉錄激活檢測Figure 3 Yeast two hybrid system to detect the transcriptional activation among different domains in PvSOC1 and AtSOC1, respectively

圖4　PvSOC1不同結構域蛋白酵母雙雜交實驗多聚體分析Figure 4 Yeast-two hybrid assays to analyze the domain polymerization in PvSOC1

2.4擬南芥AtSOC1不同結構域雙雜交分析

AtSOC1酵母雙雜交不同結構域實驗顯示：結構域之間不存在自身活性現象（圖3A）；盡管實驗中AtSOC1全長存在相互作用，能形成同源多聚體，但是單獨的M和C結構域沒有同樣的多聚體現象發(fā)生；KC結構域并沒有發(fā)生相互作用，在有I存在的MIK結構域蛋白可以形成多聚體狀態(tài)，發(fā)生相互作用（圖5）。

圖5　AtSOC1不同結構域蛋白酵母雙雜交實驗多聚體分析Figure 5 Yeast-two hybrid assays to analyze the domain polymerization in AtSOC1

3　討論

本研究以單子葉木本植物雷竹和雙子葉草本植物擬南芥作為研究對象，針對PvSOC1和AtSOC1進行研究。擬南芥在開花的過程中，AtSOC1起到主要的樞紐作用。AtSOC1通過和自己形成不同的多聚體或者與其他MADS-box轉錄因子形成蛋白復合物來調節(jié)上下游基因的蛋白表達，進而調控花期［17, 22-23］。通過相關實驗的證明，揭示了PvSOC1和AtSOC1的多聚體存在差異性。擬南芥中，酵母雙雜交實驗表明：AtSOC1自身可發(fā)生相互作用，形成同源二聚體，這一結果與文獻［24］報道的一致；通過不同結構域雙雜交實驗進一步可知：C末端缺失的MIK結構域也能形成同源二聚體，KC結構域不能發(fā)生相互作用。由此判定，AtSOC1主要功能部位的是I和K結構域。另外，有研究發(fā)現K結構域在MADS轉錄因子蛋白中相對保守。K結構域包括3個疏水性的K1，K2和K3結構域，這些疏水性的氨基酸不僅僅能夠協調自身同源二聚體的形成，還能夠促進一些開花基因異源二聚體的形成。比如K結構域中的某些疏水氨基酸可以促進AP3和PI異源二聚體的形成從而調節(jié)花器官的發(fā)育［25］。同時K結構域在植物進化過程中也扮演著重要的角色。例如所有的MADS家族蛋白都能與特定的DNA相互結合形成同源或者異源二聚體［26］，或者與其他非MADS家族中的蛋白形成三聚體。但是，K結構域的疏水特異性，更能夠促進MADS家族內部成員形成各種各樣復雜的高聚體，調節(jié)植物內部生殖生長的需要［27-28］。

對雷竹PvSOC1進行酵母雙雜交實驗，實驗發(fā)現：盡管PvSOC1不易形成同源二聚體，但是在MADS和C結構域同時缺失的情況下，KC結構域可以形成同源二聚體，結構域K是主要的作用部位。雷竹PvSOC1和擬南芥AtSOC1酵母雙雜交實驗進行對比（表2），結果發(fā)現：引起PvSOC1和AtSOC1多聚體差異性的原因主要在于I結構域。I結構域大約有20～30個氨基酸組成，這些氨基酸相對的不保守，但是有實驗發(fā)現I結構域不僅能夠幫助轉錄因子結合DNA，還能夠起到促進自身二聚體形成的作用［7, 22, 29］。氨基酸序列對比進一步表明，PvSOC1和AtSOC1中的I序列差異性極大，這種差異性有可能是PvSOC1和AtSOC1形成不同聚體狀態(tài)的一個主要原因。盡管如此，雷竹與擬南芥SOC1蛋白在形成多聚體模式上的差異性，是否與PvSOC1在調控雷竹花期過程中的特異功能相關聯，尚需通過轉基因功能實驗進行驗證。

表2　PvSOC1和AtSOC1不同結構域雙雜結果總結Table 2 Summary of the yeast two hybrid

4　參考文獻

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Oligomeric status of the SOC1 gene from Phyllostachys violascens and Arabidopsis thaliana

SHI Quan, CHEN Xiaopei, LIN Xinchun, XU Yonghan, XU Yingwu
（The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, Zhejiang, China）

Abstract:MADS-box genes are a super family, which can form different polymers to mediate the development of floral primordia and floral organs.The important one of MADs-box genes, SOC1［suppressor of overexpression of cytochrome oxidase 1］, determine the flowering time.The MADS-box transcription factor, SOC1 contains four different functions domains: MADS, I, K, and C.The K domain controls the homologous or heterologous protein polymer formation.The I domain could stabilize the MADS-box proteins binding the DNA.In order to control the floral development, MADS-box proteins can form different complex.Visible difference in floral timing is demonstrated in Phyllostachys violascens and Arabidopsis thaliana.A.thaliana is certain in floral timing while Phyllostachys violascens is not.Though we cannot compare the difference in floral timing with the difference in SOC1 complex formation, it is still interesting.MADS-box genes such as SOC1 containing four different functions: MADS, I, K and C, control floral timing.To determine whether SOC1’s from different species demonstrated similar patterns in forming a complex, this study analyzed the differences of polymer for-book=184,ebook=5mation for SOC1 that originated from Phyllostachys violascens and Arabidopsis thaliana using a yeast two-hybrid assay.Results of the assay showed that the full-length AtSOC1 gene from A.thaliana formed strong homopolymers with the I and K domains being the main regions for formation of the interaction.However, the fulllength SOC1 from Phyllostachys violascens（PvSOC1）did not form a homodimer.Thus, even though the K protein domain could form a homodimer, the presence of the I protein domain disrupted the dimer meaning the I domain could be a key factor in SOC1 polymer formation; the role of the I domain in floral timing should be verified with a plant transgene study.［Ch, 5 fig.2 tab.29 ref.］

Key words:botany; MADS-box; SOC1; Phyllostachys violascens; Arabidopsis thaliana; yeast two-hybrid; polymer; I and K protein domain

作者簡介：施泉，從事植物蛋白互作研究。E-mail：702431524@qq.com。通信作者：徐英武，教授，博士，博士生導師，從事蛋白和藥物結構生物學等研究。E-mail：yxu@zafu.edu.cn

基金項目：國家自然科學基金資助項目（31270715，31000295）；浙江省林學一級重中之重學科開放基金資助項目（KF201304）；國家重點基礎研究發(fā)展計劃（“973”計劃）項目（2012CB723008）；浙江農林大學研究生創(chuàng)新基金資助項目（3122013240226）

收稿日期：2015-04-03；修回日期：2015-05-12

doi:10.11833/j.issn.2095-0756.2016.02.001

中圖分類號：S718.3

文獻標志碼：A

文章編號：2095-0756（2016）02-0183-08