蔣果廷　王婷婷　孫　申　郁韻秋△

(1復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室　上海　201203;2復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院麻醉科　上?！?00090)

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液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定羅庫溴銨血藥濃度

蔣果廷1王婷婷2孫申2郁韻秋1△

(1復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室上海201203;2復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院麻醉科上海200090)

【摘要】目的建立液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 (liquid chromatography-tandem mass spectrum,LC-MS)方法測定血漿中羅庫溴銨濃度,并對(duì)靜脈注射0.9 mg/kg該藥物的患者2 h內(nèi)的血藥濃度進(jìn)行測定。方法血漿中加入內(nèi)標(biāo)鹽酸維拉帕米后用乙腈沉淀蛋白法進(jìn)行處理,離心后取上清進(jìn)樣。選用Atlantis T3 (4.6 mm×150 mm,5 μm)色譜柱分離,流動(dòng)相為乙腈-甲酸銨 (60∶40，5 mmol/L,pH=5.5),流速1 mL/min,柱后三通分流,0.2 mL/min流量進(jìn)入質(zhì)譜。質(zhì)譜采用電噴霧 (electrospray ionization,ESI)接口,選用正離子模式,檢測方式為選擇性離子監(jiān)測 (selected ion monitor,SIM)模式。結(jié)果羅庫溴銨在0.1～10 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,精密度及穩(wěn)定性均符合生物樣本測定要求。結(jié)論LC-MS是一種簡單、快速、準(zhǔn)確測定羅庫溴銨血藥濃度的方法,并成功應(yīng)用于靜注2 h內(nèi)臨床樣本的測定。

【關(guān)鍵詞】羅庫溴銨;液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用;靜脈注射;選擇性離子監(jiān)測

羅庫溴銨 (Rocuronium bromide)是一種甾類非去極化肌肉松弛劑,為季銨鹽結(jié)構(gòu)，于1989年首次被報(bào)道[1],驗(yàn)證其安全性和有效性后,于1994年在美國及英國上市,并于2000年以“愛可松”為商品名進(jìn)入中國市場。相對(duì)于其他肌松藥,羅庫溴銨具有起效快、代謝產(chǎn)物少的優(yōu)點(diǎn),其主要經(jīng)過肝臟代謝,膽道排除,經(jīng)腎排泄只占次要地位[2-3],臨床用于開腹手術(shù)及腹腔鏡手術(shù)麻醉。

文獻(xiàn)中測定羅庫溴銨血藥濃度主要采用液質(zhì)聯(lián)用的方法,前處理采用二氯甲烷提取法[4-5]或固相微萃取[6]等,過程較為復(fù)雜費(fèi)時(shí),給快速高通量檢測帶來困難，因此需要一種更為簡便可靠的測定方法來實(shí)現(xiàn)臨床監(jiān)測。考慮到相關(guān)手術(shù)在2 h之內(nèi)即可完成,手術(shù)過程實(shí)時(shí)監(jiān)測，無需非常低的定量限,本課題預(yù)處理采用一步蛋白沉淀方法，簡化了實(shí)驗(yàn)流程，并按照2015版《中國藥典》中《9012 生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》驗(yàn)證了該分析方法，最終成功應(yīng)用于臨床樣本(復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院麻醉科提供)的測定。本文建立了一種準(zhǔn)確、可靠、方便的LC-MS法測定羅庫溴銨的血藥濃度,為治療藥物臨床檢測提供了依據(jù)。

材 料 和 方 法

儀器1260型高效液相色譜儀 (美國安捷倫公司)包括G1311B型Quat Pump四元泵、G1329B型ALS自動(dòng)進(jìn)樣器、AT330型色譜柱恒溫箱和OpenLAB CDS ChemStation Edition工作站,6120型四級(jí)桿質(zhì)譜檢測器；TGL-16G型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器T)；GB204型電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；ER-182A型電子天平(日本A&D公司)。

試劑羅庫溴銨 (浙江仙琚制藥股份有限公司)，鹽酸維拉帕米 (99%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，甲醇 (HPLC級(jí),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，乙腈 (HPLC級(jí),美國Biologic-Reagents公司)，甲酸 (HPLC級(jí),美國Dikma Technologies公司)，甲酸銨 (98%,美國Anaqua Chemicals Supply公司)。

儲(chǔ)備液的配制GB204天平(萬分之一天平)精密稱取羅庫溴銨0.020 0 g,乙腈溶解并于100 mL容量瓶中定容,配成200 μg/mL儲(chǔ)備液;ER-182A天平(十萬分之一天平)精密稱取內(nèi)標(biāo)鹽酸維拉帕米0.002 50 g,甲醇溶解并于50 mL容量瓶中定容,配成50 μg/mL儲(chǔ)備液,均于4 ℃條件下儲(chǔ)存,臨用時(shí)稀釋至所需濃度。

工作液的配制取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液室溫放置,用乙腈稀釋到10 μg/mL。取羅庫溴銨儲(chǔ)備液室溫放置,用乙腈逐級(jí)稀釋得一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,濃度分別為200、150、100、40、20、10、4及2 μg/mL。再與濃度為10 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液等體積混合,得到濃度為100、75、50、20、10、5、2及1 μg/mL的工作液 (含內(nèi)標(biāo)5 μg/mL),供標(biāo)準(zhǔn)血樣配制用。

標(biāo)準(zhǔn)血樣的配制取人空白血漿90 μL與上述方法配制的工作液10 μL混合,渦旋3 min。制得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,濃度為10、5、2、1、0.5、0.2及0.1 μg/mL (含內(nèi)標(biāo)0.5 μg/mL),質(zhì)控樣品濃度為7.5、1、0.2及0.1 μg/mL (含內(nèi)標(biāo)0.5 μg/mL)。

臨床樣本加內(nèi)標(biāo)向90 μL臨床樣本中加入10 μL濃度為5 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液,渦旋3 min,制得含內(nèi)標(biāo)0.5 μg/mL的臨床血樣。

血漿樣品前處理向100 μL含內(nèi)標(biāo)血樣中加入300 μL乙腈,渦旋1 min,靜置5 min,之后采用6 640×g轉(zhuǎn)速離心10 min,取上清進(jìn)樣。

液相色譜條件色譜柱:Atlantis T3 (4.6 mm×150 mm,5 μm);預(yù)柱:Phenomenex C18 (4 mm×3.0 mm);流動(dòng)相:乙腈:甲酸銨 (5 mmol/L,pH=5.5,60∶40);流速:1 mL/min,三通柱后分流0.2 mL/min進(jìn)質(zhì)譜;柱溫:40 ℃;進(jìn)樣體積:5 μL;洗針溶液:60%乙腈水溶液。

質(zhì)譜條件離子源:電噴霧接口 (electrospray ionization,ESI),正離子模式;干燥氣流速:12 mL/min;干燥氣溫度:350 ℃;霧化器電壓:35 psi;質(zhì)譜檢測器:選擇性離子監(jiān)測 (selected ion monitor,SIM)模式,通道1檢測藥物m/z=529.3,通道2檢測內(nèi)標(biāo)m/z=455.3。

結(jié)果

專屬性圖1A為空白血樣的SIM圖,圖1B為空白血樣加羅庫溴銨及內(nèi)標(biāo)的SIM圖,圖1C為患者2靜注0.9 mg/kg的羅庫溴銨90 min后采集血樣的SIM圖,結(jié)果顯示羅庫溴銨及內(nèi)標(biāo)在實(shí)驗(yàn)條件下均有較好的保留與分離,羅庫溴銨和內(nèi)標(biāo)的測定處均未見明顯干擾。

線性范圍和靈敏度取羅庫溴銨濃度為0.1、0.2、0.5、1、2、5及10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)血樣并按照“血漿樣品前處理”進(jìn)行操作并進(jìn)樣分析,得到羅庫溴銨以及內(nèi)標(biāo)的峰面積。以羅庫溴銨的理論濃度為自變量x,羅庫溴銨與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為因變量y,并且以1/x2為權(quán)重,用加權(quán)最小二乘法作線性回歸。同時(shí)計(jì)算校正標(biāo)樣回算濃度(表1)處于標(biāo)示值的95.36%～103.39%,符合指導(dǎo)原則的要求。顯示本方法在0.1～10 μg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。在S/N=10的條件下,可對(duì)濃度為0.1 μg/mL的羅庫溴銨血樣進(jìn)行含量測定。

A:Blank plasma; B:Plasma spiked with Rocuronium bromide (0.1 μg/mL) and IS (0.5 μg/mL);C:Plasma collected at 90 min after intravenous injection of patient 2 spiked with IS (0.5 μg/mL).

圖1　LC-MS法測定人血中羅庫溴銨的典型色譜圖

a:y=0.001 870+0.651x;b:y=0.001 111+0.707x;c:y=0.003 607+0.676x.

精密度與準(zhǔn)確度選取高 (7.5 μg/mL)、中 (1 μg/mL)、低 (0.2 μg/mL)以及定量限 (0.1 μg/mL)共4個(gè)濃度,另行配制。在同一天內(nèi)對(duì)每一考察濃度平行配制5個(gè)樣品進(jìn)行分析,連續(xù)測定3天,每日繪制隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線。進(jìn)行日內(nèi)和日間精密度、準(zhǔn)確度的考察。精密度以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (relative standard devia-tion,RSD)進(jìn)行衡量,準(zhǔn)確度以方法回收率來衡量。

結(jié)果顯示(表2),本方法的日間和日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD%)≤6.94%;方法回收率在85%～115%,僅有一個(gè)位于定量下限 (0.1 μg/mL)的樣品方法回收率115.2%,也在標(biāo)準(zhǔn)范圍 (定量下線為標(biāo)示值±20%)之內(nèi)，符合指導(dǎo)原則的要求。

基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率選擇0.2、1、5 μg/mL 3個(gè)濃度進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)的考察。由空白基質(zhì)提取后加入分析物和內(nèi)標(biāo)測得基質(zhì)存在下峰面積 (G1組),由分析物和內(nèi)標(biāo)的純?nèi)芤簻y得不含基質(zhì)的相應(yīng)峰面積 (G2組)。由峰面積之比得到待測物及內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子,并由此計(jì)算經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子。結(jié)果如表3所示,3個(gè)濃度經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子的變異系數(shù)均小于15%,符合指導(dǎo)原則的要求。

表2　分析方法的精密度與準(zhǔn)確度

表3　各濃度樣品的基質(zhì)效應(yīng)

空白血樣加入分析物和內(nèi)標(biāo),預(yù)處理后進(jìn)樣得相應(yīng)峰面積 (G3組),由G3組與G1組峰面積之比可求得提取回收率,3個(gè)濃度及內(nèi)標(biāo)的提取回收率分別為103.35%、101.98%、102.41%和104.89%,符合要求。

穩(wěn)定性

樣品凍融循環(huán)穩(wěn)定性配制0.2 μg/mL以及7.5 μg/mL兩個(gè)濃度的模擬血樣,置于-20 ℃冰箱中,凍融3次后進(jìn)行測定,結(jié)果為標(biāo)示濃度的91.07%～103.23%。

短期放置穩(wěn)定性配制0.2 μg/mL以及7.5 μg/mL兩個(gè)濃度的模擬血樣,樣品分別于4 ℃及25 ℃放置2、4 h后處理進(jìn)樣,結(jié)果為標(biāo)示濃度的89.12%～101.55%。

ALS放置穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)樣品處理后進(jìn)樣并于4、8 h后重復(fù)進(jìn)樣測定,結(jié)果為標(biāo)示濃度的88.45%～109.82%。

以上測定結(jié)果與標(biāo)示濃度相比較偏差均在±15%之內(nèi),符合指導(dǎo)原則的要求。

樣品測定按照所建立的方法,對(duì)兩組臨床樣本進(jìn)行測定(圖2),考察靜注0.9 mg/kg的羅庫溴銨后2 h內(nèi)的血藥濃度變化,取血時(shí)間分別為注射后5、10、20、30、60、90和120 min。

討論

色譜柱選擇羅庫溴銨是一類季銨鹽,在一般的反相色譜條件下不易保留。實(shí)驗(yàn)中分別采用①Syncronis C18 (4.6 mm×250 mm,5 μm),②Venusil XBP Phenyl (2.1 mm×100 mm,5 μm),③Luna NH2(4.6 mm×250 mm,5 μm),④Syncronis HILIC (2.1 mm×100 mm,5 μm)和⑤Atlantis T3 (4.6 mm×150 mm,5 μm)等柱子進(jìn)行了嘗試,結(jié)果顯示⑤號(hào)柱對(duì)羅庫溴銨和內(nèi)標(biāo)均有較好保留。故本實(shí)驗(yàn)選擇⑤號(hào)柱進(jìn)行分離。

色譜條件優(yōu)化以乙腈-水為流動(dòng)相,分別對(duì)有機(jī)相的比例和水相pH進(jìn)行了考察,綜合考慮保留時(shí)間和峰形后,選擇乙腈水相為60∶40,水相pH為5.5 (5 mmol/L甲酸銨,用甲酸調(diào)節(jié)pH)。此外,將柱溫由30 ℃升至40 ℃時(shí),峰形明顯改善。

質(zhì)譜條件選擇確定色譜條件后,進(jìn)樣質(zhì)譜掃描 (掃描范圍150～600),得總離子流圖,根據(jù)羅庫溴銨以及內(nèi)標(biāo)相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間質(zhì)荷比情況最終選擇m/z=529.3檢測羅庫溴銨以及m/z=455.3 檢測內(nèi)標(biāo)鹽酸維拉帕米(圖3)。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)相關(guān)指導(dǎo)原則,建立了LC-MS聯(lián)用的方法來測定靜注2 h內(nèi)羅庫溴銨血藥濃度的方法,并成功應(yīng)用于臨床樣品的測定,為藥物臨床監(jiān)測及相關(guān)研究提供了依據(jù)。

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Quantitative determination of Rocuronium bromide in human plasma by a liquid chromatography-tandem mass spectrum method

JIANG Guo-ting1, WANG Ting-ting2, SUN Shen2, YU Yun-qiu1△

(1DepartmentofPharmaceuticalAnalysis,SchoolofPharmacy,FudanUniversity,Shanghai201203,China;2DepartmentofAnesthesiology,ObstetricsandGynecologyHospital,FudanUniversity,Shanghai200090,China)

【Abstract】ObjectiveTo establish a liquid chromatography-tandem mass spectrum (LC-MS) method to determine the concentration of Rocuronium bromide in plasma． The method was applied to the plasma of patients who use the drug via intravenous injection within 2 hours．MethodsAfter addition of Verapamil Hydrochloride as internal standard (IS),plasma samples were precipitated by acetonitrile.After centrifuging,the supernate was taken to analysis． The separation was carried out on an Atlantis T3 (4.6 mm×150 mm,5 μm) column,and the mobile phase was acetonitrile-ammonium formate (60∶40,5 mmol/L,pH=5.5) at a rate of 1 mL/min with a three-way valve after the column to separate the flow and control the flow which runs in the mass spectrum at a rate of 0.2 mL/min． An electrospray ionization (ESI) was adopted as the interface.The samples were detected in positive mode with selected ion monitor (SIM)． ResultsA good linearity was obtained in the range of 0.1～10 μg/mL,and the accuracy,stability and other parameters of the method meet the detecting require for biological samples.ConclusionsLC-MS method is a simple,rapid and accurate method that can be applied to measuring the concentration of Rocuronium bromide in plasma,and it′s also succeed in measuring the clinical samples within 2 hours．

【Key words】Rocuronium bromide;liquid chromatography-tandem mass spectrum method;intravenous injection;selected ion monitor

(收稿日期:2015-09-01;編輯:王蔚)

【中圖分類號(hào)】R917

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.02.016

△Corresponding authorE-mail:yqyu@shmu.edu.cn