劉鳳嬌，周 兵，張璐瑤，胡國(guó)偉，廖小軍，胡小松，張 燕

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，國(guó)家果蔬加工工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部果蔬加工重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，北京 100083)

1 引 言

烯丙基異硫氰酸酯(Allyl Isothiocyanate,AITC)是由烯丙基硫苷與硫代葡萄糖苷酶反應(yīng)生成的一種異硫氰酸酯類物質(zhì)[1-2]，廣泛存在于西蘭花、紫甘藍(lán)、花椰菜、芥菜、蘿卜等十字花科植物中[3]。AITC具有較強(qiáng)的揮發(fā)性，以及強(qiáng)烈的刺激性氣味[4-5]，賦予十字花科植物辛辣刺激的口感和特殊的風(fēng)味。

紫甘藍(lán)色素是紫甘藍(lán)中的內(nèi)源色素物質(zhì)，作為一種天然食用色素現(xiàn)已被用作食品的著色劑。在提取紫甘藍(lán)色素過程中，由于細(xì)胞破損，硫代葡萄苷酶作用于硫代葡萄糖苷，產(chǎn)生AITC、烯丙基腈等異味物質(zhì)[6]，嚴(yán)重影響紫甘藍(lán)色素的風(fēng)味和應(yīng)用范圍。因此，如何在提取紫甘藍(lán)色素的同時(shí)脫除其中的異味物質(zhì)，成為紫甘藍(lán)色素工業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用的技術(shù)難點(diǎn)。

高壓二氧化碳(High Pressure Carbon Dioxide，HPCD)技術(shù)是一種新型的冷殺菌技術(shù)，它通過CO2在50 MPa以下壓力的分子效應(yīng)影響微生物和酶，從而保持食品新鮮的質(zhì)地、營(yíng)養(yǎng)和感官品質(zhì)[7-8]。HPCD的作用機(jī)理主要是壓力與CO2共同作用，形成酸性的高壓環(huán)境和可控的溫度環(huán)境。CO2分子具有對(duì)稱結(jié)構(gòu)，因而具有非極性，能溶解非極性物質(zhì)。在高壓下，隨著壓強(qiáng)的增大，CO2的物化特性改變，非極性物質(zhì)在CO2中的溶解性增強(qiáng)，并隨CO2逸出，同時(shí)溫度也會(huì)影響非極性物質(zhì)的熱降解。AITC是一種非極性物質(zhì)，因此HPCD可以用于紫甘藍(lán)色素中主要異味物質(zhì)AITC的脫除。

本實(shí)驗(yàn)通過研究不同工藝參數(shù)(壓強(qiáng)、溫度、處理時(shí)間、卸壓時(shí)間)對(duì)HPCD脫除AITC效果的影響，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)主要影響因素進(jìn)行工藝優(yōu)化，分析最佳工藝條件下HPCD對(duì)紫甘藍(lán)色素異味物質(zhì)的脫除效果，旨在為紫甘藍(lán)異味物質(zhì)的脫除提供一種有效可行的工藝方法，促進(jìn)十字花科植物提取物在食品工業(yè)中的應(yīng)用。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

紫甘藍(lán)紅色素，晨光生物科技集團(tuán)贈(zèng)送，于4 ℃環(huán)境儲(chǔ)藏備用。AITC標(biāo)品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于或等于95%)，色譜純，購于美國(guó)Sigma公司。乙腈，色譜純，購于美國(guó)Honeywell公司。二氧化碳?xì)怏w(純度99.5%)，購于北京千禧氣體有限公司。

2.2 實(shí)驗(yàn)儀器

實(shí)驗(yàn)采用CAU-HPCD-1(ZL200520132590.X)型HPCD處理裝置(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)自行設(shè)計(jì))[9]，該裝置中高壓二氧化碳產(chǎn)生輸送單元與反應(yīng)釜連接，能將產(chǎn)生的高壓二氧化碳經(jīng)預(yù)熱器預(yù)熱后輸送到反應(yīng)釜中。實(shí)驗(yàn)中還應(yīng)用了GC7890A/MS5975C型氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫公司)，S-HH-W21-Cr600型恒溫水浴箱(北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠)，2000D超純水器(北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司)。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1HPCD不同工藝參數(shù)處理

將HPCD設(shè)備的反應(yīng)釜預(yù)熱到預(yù)定溫度，將裝有2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10-3的AITC水溶液的50 mL離心管置于反應(yīng)釜中。經(jīng)過1～5 min的升壓過程達(dá)到預(yù)定壓強(qiáng)，在恒定的壓強(qiáng)和溫度下處理一定時(shí)間后，迅速卸壓(卸壓時(shí)間約為2～4 min)，取出離心管。

采用單因素實(shí)驗(yàn)，分別考察不同壓強(qiáng)(8、12、16、20、24 MPa)、處理溫度(35、40、45、50、55 ℃)、處理時(shí)間(5、15、30、45、60 min)和卸壓時(shí)間(1、2、3、4、5 min)對(duì)HPCD脫除AITC效果的影響。在單因素的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，分析重要因素的作用大小及最優(yōu)組合，從而對(duì)HPCD處理的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

2.3.2AITC含量的測(cè)定

對(duì)HPCD處理后的樣品進(jìn)行高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)測(cè)定[10]。色譜條件為：島津液相色譜系統(tǒng)，LG-20AT泵，SPD-20AV紫外可見檢測(cè)器；SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，進(jìn)樣量為20 μL；CTO-20A柱溫箱，Agela公司ASB C18柱(4.6 mm×250 mm)，柱溫為30 ℃；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為超純水，梯度洗脫：0～2 min，100% B；2～3 min，100%～35% B；3～20 min，35% B；20～30 min，35%～100% B。流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為243 nm。

準(zhǔn)確稱取一定量的AITC標(biāo)品(精確到0.1 mg)，用超純水配成不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，過0.45 μm濾膜，用HPLC進(jìn)行測(cè)定。確定供試液質(zhì)量分?jǐn)?shù)在4.0×10-5～1.4×10-3范圍內(nèi)時(shí)，AITC的進(jìn)樣量與相應(yīng)色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2達(dá)0.995。

2.3.3HPCD處理前、后紫甘藍(lán)色素異味物質(zhì)鑒定

采用氣相色譜-質(zhì)譜(Gas Chromatograph-Mass Spectrometer，GC-MS)技術(shù)分析測(cè)定紫甘藍(lán)色素的異味物質(zhì)。取HPCD處理前、后的紫甘藍(lán)色素水溶液各8 mL，置于15 mL樣品瓶?jī)?nèi)，40 ℃恒溫?cái)嚢?，固相微萃?0 min，然后進(jìn)行GC-MS測(cè)定。測(cè)試儀器選用Agilent公司GC7890A/MS5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，色譜條件為：DB-5 MS柱(30 m×250 mm×0.25 mm)，測(cè)定時(shí)柱溫為60 ℃，保持2 min；后以4 ℃/min的速率升至125 ℃；最后以8 ℃/min的速率升至230 ℃，保持8.625 min。進(jìn)樣口溫度為250 ℃，載氣為He氣，流速為1 mL/min。質(zhì)譜條件為：離子源為EI，電子能量為70 eV，接口溫度為250 ℃，質(zhì)量范圍為30～550 u。

3 結(jié)果與討論

3.1 HPCD不同工藝參數(shù)對(duì)脫除AITC的影響

3.1.1壓強(qiáng)對(duì)HPCD脫除AITC的影響

為了考察壓強(qiáng)對(duì)HPCD脫除AITC效果的影響，采用50 ℃下，HPCD處理30 min，卸壓2 min，以5種不同壓強(qiáng)(8、12、16、20、24 MPa)對(duì)AITC進(jìn)行脫除，結(jié)果如圖1所示。隨著壓強(qiáng)的增大，AITC質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化差異不顯著，在1.432×10-5到1.567×10-5之間波動(dòng),表明壓強(qiáng)對(duì)HPCD脫除AITC效果的影響并不顯著(P>0.05)。在較低壓力下(10 MPa左右)，弱極性或非極性物質(zhì)即可溶于CO2流體中[11]。經(jīng)過8 MPa HPCD處理后，溶液中AITC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)已經(jīng)較低，而AITC在CO2流體中的溶解能力有限，接近飽和狀態(tài)，因此繼續(xù)加壓，AITC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不大。綜合而言，壓強(qiáng)對(duì)脫除AITC的效果影響不大，因此選擇較低壓強(qiáng)8 MPa即可。

3.1.2溫度對(duì)HPCD脫除AITC效果的影響

為了考察溫度對(duì)HPCD脫除AITC效果的影響，采用8 MPa下，HPCD處理15 min，卸壓2 min，以5種不同溫度(35、40、45、50、55 ℃)對(duì)AITC進(jìn)行脫除，結(jié)果如圖2所示。隨著溫度的升高，AITC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸減少，呈兩段式變化。當(dāng)溫度低于40 ℃時(shí)，溫度的變化對(duì)脫除效果影響劇烈,當(dāng)溫度由35 ℃升至40 ℃時(shí)，AITC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由6.629×10-5減少為4.023×10-5；當(dāng)溫度高于40 ℃時(shí)，繼續(xù)升高溫度，AITC質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低的幅度減小，溫度達(dá)到55 ℃時(shí)，AITC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.122×10-5。升溫可以提高AITC的揮發(fā)度，增強(qiáng)對(duì)AITC的脫除效果，但溫度升高也會(huì)使CO2的密度降低，導(dǎo)致溶解度下降，影響脫除效果。另外，較高溫度會(huì)影響AITC的降解[12]。張清風(fēng)等人[13]研究了溫度對(duì)辣根油中異硫氰酸酯水解穩(wěn)定性的影響，結(jié)果表明，溫度對(duì)異硫氰酸酯的影響很大，25 ℃下異硫氰酸酯水解很慢，而在65 ℃時(shí)水解速度相當(dāng)快。較高溫度有利于AITC脫除的原因可能是AITC不穩(wěn)定，發(fā)生降解，而降解產(chǎn)物揮發(fā)性強(qiáng)，故脫除。

圖1 不同壓強(qiáng)下溶液中AITC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.1 Mass fraction of AITC in solution under different pressures

圖2 不同處理溫度下溶液中AITC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.2 Mass fraction of AITC in solution under different treatment temperatures

3.1.3處理時(shí)間對(duì)HPCD脫除AITC效果的影響

為了考察處理時(shí)間對(duì)HPCD脫除AITC效果影響，采用8 MPa、55 ℃下HPCD處理，卸壓2 min，以5種不同處理時(shí)間(5、15、30、45、60 min)對(duì)AITC進(jìn)行脫除，結(jié)果如圖3所示。隨著處理時(shí)間的增加，AITC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸減少。當(dāng)處理30 min時(shí)，AITC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大幅度降為1.445×10-5；處理30 min后，延長(zhǎng)處理時(shí)間，AITC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)仍呈降低趨勢(shì)，但降低的幅度減小?？梢?，處理時(shí)間的延長(zhǎng)能促進(jìn)AITC的脫除，AITC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷減少。由于AITC對(duì)溫度敏感，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，AITC會(huì)發(fā)生降解，因而45 min后AITC的脫除速率增大。

3.1.4卸壓時(shí)間對(duì)HPCD脫除AITC效果的影響

為了考察卸壓時(shí)間對(duì)HPCD脫除AITC效果的影響，采用8 MPa、55 ℃下，HPCD處理5 min，以5種不同卸壓時(shí)間(1、2、3、4、5 min)對(duì)AITC進(jìn)行脫除，結(jié)果如圖4所示。隨著卸壓時(shí)間的增加，AITC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)先減后增的趨勢(shì)，在卸壓2 min時(shí)AITC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最小值6.471×10-5。其可能原因是若卸壓速度過快，處理釜內(nèi)溫度急劇降低，樣品因溫度過低而結(jié)冰，不利于CO2將AITC帶出；另一方面，若卸壓速度過慢，會(huì)減弱CO2從水溶液中溢出所產(chǎn)生的爆破作用，從而減少AITC被帶出的量。為達(dá)到較好的脫除效果，確定卸壓時(shí)間為1～3 min較為合適。

圖3 不同處理時(shí)間下溶液中AITC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.3 Mass fraction of AITC in solution under different treatment time

圖4 不同卸壓時(shí)間下溶液中AITC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.4 Mass fraction of AITC in solution under different pressure relief time

3.2 HPCD脫除AITC工藝參數(shù)優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)影響HPCD脫除AITC效果的主要因素(溫度、處理時(shí)間、卸壓時(shí)間)進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1～表3所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Experimental levels employed for orthogonal experimental design

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response value of orthogonal experimental design

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析Table 3 Analysis of orthogonal experimental results

Note：Ki(i=1,2,3) is the mean value of factors at leveli，andRbis the extreme differences.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果極差分析表明，溫度對(duì)HPCD脫除AITC效果的影響最大，其次是處理時(shí)間，卸壓時(shí)間對(duì)其影響最小，即A>B>C；最佳工藝組合為A3B3C2，即HPCD脫除AITC的最佳工藝為溫度50 ℃、處理時(shí)間60 min、卸壓2 min。

3.3 HPCD對(duì)紫甘藍(lán)色素異味脫除的效果分析

在最佳工藝條件下對(duì)紫甘藍(lán)色素進(jìn)行HPCD處理，為了考察HPCD處理前、后異味物質(zhì)的變化情況，分別對(duì)HPCD處理前、后的紫甘藍(lán)色素樣品進(jìn)行GC-MS分析，得到的結(jié)果如表4所示。

表4 HPCD處理前、后紫甘藍(lán)色素?fù)]發(fā)性成分的GC-MS結(jié)果比較Table 4 Comparison of GC-MS results of volatile compounds in purple cabbage pigmentbefore and after HPCD treatment

從表4可以看出，HPCD處理前，紫甘藍(lán)色素中揮發(fā)性成分有17種，其中醛類7種、烴類6種、含硫類化合物4種，主要成分為癸醛(26.77%)、壬醛(23.86%)、二甲基三硫醚(15.18%)、辛醛(10.25%)、烯丙基異硫氰酸酯(3.15%)。在揮發(fā)性風(fēng)味成分中，烴類物質(zhì)包括烷烴、烯烴和芳香烴。烷烴香氣閾值較高[14]，對(duì)紫甘藍(lán)色素的異味形成作用不大；醛類物質(zhì)對(duì)紫甘藍(lán)色素的異味貢獻(xiàn)也不大[15]。烯烴和芳香烴與飽和烴相比閾值較低，且具有特殊氣味，如萘具有樟腦球的風(fēng)味，對(duì)紫甘藍(lán)色素異味的形成有一定作用。含硫化合物大多有強(qiáng)烈的氣味，嗅感閾值很低，對(duì)紫甘藍(lán)色素異味形成的貢獻(xiàn)較大，如二甲基三硫醚呈甘藍(lán)氣味，二甲基四硫醚具有豬肉的揮發(fā)性香氣[16]，烯丙基異硫氰酸酯有強(qiáng)烈的催淚性和辛辣味[17]，是十字花科蔬菜及其加工過程中的特征風(fēng)味物質(zhì)，也是紫甘藍(lán)色素核心的異味物質(zhì)。

經(jīng)HPCD最佳工藝處理后，紫甘藍(lán)色素中揮發(fā)性成分有7種，其中醛類3種、烴類2種、含硫化合物2種，主要成分為癸醛(1.69%)、壬醛(1.53%)、烯丙基異硫氰酸酯(1.06%)。與HPCD處理前相比，對(duì)紫甘藍(lán)色素異味形成有一定作用的物質(zhì)得到不同程度的脫除，如烯丙基異硫氰酸酯由3.15%減少到1.06%，烯丙基硫氰酸酯由2.69%減少到0.42%，萘由1.46%減少到0.29%，2-甲基-萘由1.12%減少到0.68%，而2,6-二甲基-萘、1,7-二甲基-萘、1-甲基-環(huán)己烯、二甲基三硫醚及二甲基四硫化合物則被完全脫除。由此可以看出，在最佳工藝條件下，HPCD對(duì)紫甘藍(lán)色素異味物質(zhì)的脫除效果較好，且脫除的揮發(fā)性成分種類和含量較多。

4 結(jié) 論

在不同壓強(qiáng)、溫度、處理時(shí)間和卸壓時(shí)間下，HPCD脫除AITC的效果表明，溫度對(duì)HPCD脫除AITC效果的影響最大，其次是處理時(shí)間、卸壓時(shí)間，而壓強(qiáng)對(duì)HPCD脫除AITC效果的影響不顯著；HPCD脫除AITC的最佳工藝組合為A3B3C2，即溫度50 ℃、處理時(shí)間60 min、卸壓時(shí)間2 min。

紫甘藍(lán)色素經(jīng)HPCD處理后，風(fēng)味物質(zhì)種類由17種變?yōu)?種，對(duì)紫甘藍(lán)色素異味形成有一定作用的物質(zhì)得到不同程度的脫除，如烯丙基異硫氰酸酯由3.15%減少到1.06%，烯丙基硫氰酸酯由2.69%減少到0.42%，萘由1.46%減少到0.29%，2-甲基-萘由1.12%減少到0.68%，而2,6-二甲基-萘、1,7-二甲基-萘、1-甲基-環(huán)己烯、二甲基三硫醚及二甲基四硫化合物則被完全脫除。由此可看出，在最佳工藝條件下，HPCD對(duì)紫甘藍(lán)色素異味物質(zhì)的脫除效果較好。

[1] SONG L J,MORRISON J J,BOTTING N P,et al.Analysis of glucosinolates,isothiocyanates,and amine degradation products in vegetable extracts and blood plasma by LC-MS/MS [J].Anal Biochem,2005,347(2):234-243.

[2] HANSCHEN F S,LAMY E,SCHREINER M,et al.Reactivity and stability of glucosinolates and their breakdown products in foods [J].Angew Chem Int Edit,2014,54(43):11430-11450.

[3] FAHEY J W,ZALCMANN A T,TALALAY P.The chemical diversity and distribution of glucosinolates and isothiocyanates among plants [J].Phytochemistry,2001,56(1):5-51.

[4] KO J A,KIM W Y,PARK H J.Effects of microencapsulated Allyl isothiocyanate (AITC) on the extension of the shelf-life of Kimchi [J].Int J Food Microbiol,2012,153(1):92-98.

[5] BONES A M,RPSSITER J T.The enzymic and chemically induced decomposition of glucosinolates [J].Phytochemistry,2006,67(11):1053-1067.

[7] 劉 野,趙曉燕,鄒 磊,等.高壓二氧化碳對(duì)鮮榨西瓜汁殺菌效果和風(fēng)味的影響 [J].食品科學(xué),2012,33(3):82-88.

LIU Y,ZHAO X Y,ZOU L,et al.Effects of high pressure carbon dioxide on microbiological and flavor profiles of fresh watermelon juice [J].Food Science,2012,33(3):82-88.

[8] DAMAR S,BALABAN M O.Review of dense phase CO2technology:Microbial and enzyme inactivation,and effects on food quality [J].J Food Sci,2006 (71):1-11.

[9] 廖小軍,桂芬琦,胡小松,等.高密度CO2殺菌裝置:200520132590.X [P].2006-12-06.

LIAO X J,GUI F Q,HU X S,et al.High-density CO2sterilize:200520132590.X [P].2006-12-06.

[10] PECHACEK R,VELISEK J,HRABCOVA H.Decomposition products of allyl isothiocyanate in aqueous solutions [J].J Agric Food Chem,1997,45(12):4584-4588.

[11] 陳 元,楊基礎(chǔ).超臨界CO2萃取亞麻籽油的研究 [J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2001,13(3):14-19.

CHEN Y,YANG J C.Studies on the supercritical carbon dioxide extraction of linseed oil [J].Natural Product Research and Development,2001,13(3):14-19.

[12] 胡國(guó)偉,易俊杰,楊瑛潔,等.高壓二氧化碳對(duì)烯丙基異硫氰酸酯脫除影響的研究 [J].高壓物理學(xué)報(bào),2012,26(4):409-414.

HU G W,YI J J,YANG Y J,et al.Research on removing allyl isothiocyanates using high pressure carbon dioxide [J].Chinese Journal of High Pressure Physics,2012,26(4):409-414.

[13] 張清風(fēng),姜子濤,張久章,等.紫外分光光度法測(cè)定辣根及芥末制品中異硫氰酸酯含量的研究 [J].中國(guó)調(diào)味品,2005(6):15-20.

ZHANG Q F,JIANG Z T,ZHANG J Z,et al.Ultraviolet spectrophotometric determination of isothiocyanates in horseradish,mustard and the related products [J].China Condiment,2005(6):15-20.

[14] 劉登勇,周光宏,徐幸蓮.確定食品關(guān)鍵風(fēng)味化合物的一種新方法:“ROAV”法 [J].食品科學(xué),2008,29(7):370-374.

LIU D Y,ZHOU G H,XU X L.“ROAV” Method:a new method for determining key odor compounds of Rugao ham [J].Food Science,2008,29(7):370-374.

[15] 賀云川,李 敏.同時(shí)蒸餾萃取-氣質(zhì)聯(lián)機(jī)分析壇裝風(fēng)脫水榨菜揮發(fā)性成分 [J].中國(guó)調(diào)味品,2010,35(10):116-119.

HE Y C,LI M.Altar wind dehydration of volatile components in pickle by distillation extraction and temperament on-line analysis at the same time [J].China Condiment,2010,35(10):116-119.

[16] 宋煥祿.食品風(fēng)味化學(xué) [M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2008:40,99.

SONG H L.Food flavor chemistry [M].Beijing:Chemical Industry Press,2008:40,99.

[17] 孫寶國(guó),何 堅(jiān).香料化學(xué)與工藝學(xué) [M].第2版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2004:120,429.

SUN B G,HE J.Spices chemistry and technology [M].2nd ed.Beijing:Chemical Industry Press,2004:120,429.