郝旭紅，裴　涌，孫曉楠

?

·實驗論著·

P2X7受體對缺氧誘發(fā)小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡的影響

郝旭紅，裴涌，孫曉楠

Effect of P2X7purinoceptor on hypoxia-induced apoptosis of retinal ganglion cells

Xu-Hong Hao，Yong Pei，Xiao-Nan Sun

Foundation item:Natural Science Foundation of Liaoning(No.2014020184)

Department of Ophthalmology,Shenyang the Fourth Hospital of People, Shenyang 110031, Liaoning Province, China

Correspondence to:Xu-Hong Hao. Department of Ophthalmology, Shenyang the Fourth Hospital of People, Shenyang 110031, Liaoning Province, China.sysyhxh@163.com

Received：2015-11-16Accepted：2016-03-18

Abstract

?AIM: To investigate the effect of P2X7on hypoxia-induced apoptosis of retinal ganglion cells in mice.

?METHODS: According to the different factors, retinal ganglion cells of the mouse were randomly divided into four groups: control group (G1), hypoxia group (G2), hypoxia + agonist (BzATP) group (G3), hypoxia + antagonistic agent (BBG) group (G4). Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method was used to detect the survival rate of cells; the rate of cell apoptosis was determined by Annxin V/PI staining flow cytometry; Western Blot analysis was employed to detect the protein expressrion levels of cleave-caspase-3 and cleave-PARP.

?RESULTS: Compared with control group, the results significantly indicated the survival rate of cells decreased and the rate of apoptosis increased treated with hypoxia. In addition, the protein levels of cleave-caspase-3 and cleave-PARP were remarkably higher than the control group. BzATP markedly augmented the apoptosis induced by hypoxia, and BBG pretreatment observably decreased the hypoxia-induced apoptosis.

?CONCLUSION: P2X7purinoceptor could be activated by hypoxia, and participate in the apoptosis of retinal ganglion cells.

KEYWORDS:?P2X7 purinoceptor；hypoxia；retinal ganglion cells；apoptosis

Citation:Hao XH, Pei Y, Sun XN.Effect of P2X7purinoceptor on hypoxia-induced apoptosis of retinal ganglion cells.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(4):622-624

摘要

關鍵詞：嘌呤受體P2X7；缺氧；視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞；細胞凋亡

引用：郝旭紅，裴涌，孫曉楠.P2X7受體對缺氧誘發(fā)小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡的影響.國際眼科雜志2016;16(4):622-624

0引言

視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cells，RGC)是位于視網(wǎng)膜最終段的神經(jīng)細胞，其軸索為視神經(jīng)纖維。缺血、缺氧導致RGC的凋亡，甚至死亡，是許多視網(wǎng)膜和視神經(jīng)疾病發(fā)展到最后的必經(jīng)之路，如糖尿病視網(wǎng)膜病變、青光眼、視網(wǎng)膜中央動脈阻塞等，因此研究缺氧誘發(fā)的RGC凋亡機制有可能找到治療和預防視網(wǎng)膜和視神經(jīng)疾病新的治療方法，從而避免更多人喪失寶貴的視力。近年來，嘌呤和嘌呤受體作為重要的信號分子備受關注。P2X7屬于核苷酸P2X 受體家族，P2X7受體通道開放，可引起胞外信號的傳導、引起相應的生物學效應，包括炎癥反應、細胞凋亡和增殖等。研究表明，RGC層中有P2X7受體的表達。本實驗通過建立視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞RGC-5缺氧模型，觀察并探討嘌呤受體P2X7對缺氧誘發(fā)RGC凋亡的影響，希望為預防和治療RGC缺血、缺氧誘發(fā)的細胞凋亡提供實驗依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞株RGC-5，購自ATCC。胎牛血清、DMEM 購自Invitrogen公司；BzATP、BBG、四甲基偶氮唑藍(MTT)、堿性磷酸酶標記的抗小鼠IgG購自Sigma公司；cleave-caspase-3、cleave-PARP、β-actin一抗購自Santa Cruz公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自上海貝博生物公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及實驗分組用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素100U/mL)，在37℃、5% CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞株RGC-5，3～4d傳代1次。將細胞隨機分為4組，正常對照組(G1)、缺氧組(G2)、缺氧+激動劑(BzATP)組(G3)、缺氧+拮抗劑(BBG)組(G4)；其中缺氧模式為將培養(yǎng)基更換為經(jīng)缺氧處理(預先用氮氣飽和)無糖、無血清培養(yǎng)基，然后放入37℃、95% N2、5% CO2三氣培養(yǎng)箱中6h，之后更換含糖、含血清培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2孵育箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4h。G3組在缺氧處理的同時給予100μmol/L BzATP；G4組先給予100nmol/L BBG預處理30min后，再給予缺氧處理。

1.2.2 MTT法檢測各組小鼠RGC細胞存活率將細胞以5×103/孔接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h后，按上述各分組處理方法處理細胞后，終止培養(yǎng)，每孔加入MTT 20μL(濃度為5g/L)，繼續(xù)避光培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，小心棄上清，加入200μL DMSO溶解MTT，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定波長為490nm處各孔的吸光度。

1.2.3流式細胞儀檢測各組小鼠RGC細胞凋亡情況收集各組細胞，調(diào)整細胞濃度為1×105/mL，加入試劑盒中結(jié)合緩沖液(Binding Buffer)500μL懸浮細胞。加入5μL的Annexin V-FITC染色液，輕輕混勻，于冰上避光條件孵育15min，然后加入10μL PI染色液后孵育15min，采用流式細胞儀計數(shù)1×104個細胞，結(jié)果使用雙變量流式細胞儀的散點圖表示，同時計算凋亡細胞率。

1.2.4 Western Blot檢測各組小鼠RGC中cleave-PARP和cleave-caspase-3蛋白的表達細胞裂解液裂解細胞，收集細胞，超聲處理，離心，上清液置于-80℃保存?zhèn)溆?。應用BCA方法測定蛋白濃度。凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜并采用特異性抗體進行Western Blot分析，cleave-PARP和cleave-caspase-3(1∶1000)，β-actin(1∶1000)。二抗：堿性磷酸酶標記的抗小鼠IgG(1∶1000)。采用凝膠成像分析系統(tǒng)分析和計算蛋白的灰度值，以目的條帶與內(nèi)參β-actin的平均灰度值的比值表示蛋白水平，進行半定量分析。

統(tǒng)計學分析：應用Graphpad Prism 5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。所有數(shù)據(jù)用平均值±標準誤表示。組間比較采用單因素方差分析。以P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1各組小鼠RGC細胞存活率應用MTT 法檢測RGC-5細胞存活率，各組細胞存活百分率分別為：G1組(100.00±2.13)%、G2組(57.14±3.07)%、G3組(42.16±2.61)%、G4組(74.56±2.98)%。與G1組相比，G2、G3和G4組的 RGC-5細胞存活率顯著降低(P<0.05)；經(jīng)100μmol/L BzATP與缺氧共同處理RGC-5細胞后，與G2組相比，細胞存活率明顯降低(P<0.05)；而100nmol/L BBG預處理細胞后，與G2組相比，細胞RGC-5存活率顯著提高(P<0.05，圖1)。

2.2各組小鼠RGC細胞凋亡情況應用流式細胞儀檢測RGC-5細胞凋亡率，各組細胞凋亡率分別為：G1組(12.25±2.50)%、G2組(48.00±4.55)%、G3組(59.05±2.10)%、G4組(37.5±5.20)%。與正常對照組相比，G2、G3和G4組的 RGC-5細胞均出現(xiàn)明顯的細胞凋亡(P<0.05)；其中缺氧+激動劑組的細胞凋亡率最高，與缺氧組相比，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；缺氧+拮抗劑組的細胞凋亡率，與單純?nèi)毖踅M相比，明顯下降(P<0.05)，但仍高于正常對照組(圖2～3)。

圖1各組小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞RGC-5存活率情況aP<0.05vsG1組；cP<0.05vsG2 組；G1：正常對照組；G2：缺氧組；G3：缺氧+激動劑(BzATP)組；G4：缺氧+拮抗劑(BBG)組。

圖2各組小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞RGC-5凋亡情況G1：正常對照組；G2：缺氧組；G3：缺氧+激動劑(BzATP)組；G4：缺氧+拮抗劑(BBG)組。

圖3各組小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞RGC-5凋亡率aP<0.05vsG1組；cP<0.05vsG2組；G1：正常對照組；G2：缺氧組；G3：缺氧+激動劑(BzATP)組；G4：缺氧+拮抗劑(BBG)組。

2.3各組小鼠RGC中cleave-PARP和cleave-caspase-3蛋白的表達Western Blot檢測視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)RGC-5細胞內(nèi)cleaved-PARP和cleaved-caspase-3蛋白表達，各組cleaved-PARP/β-actin相對灰度值分別為：G1組0.20±0.03，G2組0.62±0.03，G3組0.78±0.02，G4組0.46±0.05；各組cleaved-caspase-3/β-actin相對灰度值分別為：G1組0.21±0.03，G2組0.49±0.04，G3組0.66±0.04，G4組0.36±0.06。與G1組相比，G2、G3和G4組的cleaved-PARP和cleaved-caspase-3蛋白表達均顯著升高(P<0.05)；其中G3組cleaved-PARP和cleaved-caspase-3蛋白表達最多，而G4組在P2X7拮抗劑的作用下，使cleaved-PARP和cleaved-caspase-3蛋白表達明顯低于G2組(P<0.05)，但仍高于G1組(圖4～6)。

圖4各組小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞RGC-5中cleaved-PARP和cleaved-caspase-3蛋白表達G1：正常對照組；G2：缺氧組；G3：缺氧+激動劑(BzATP)組；G4：缺氧+拮抗劑(BBG)組。

圖5各組小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞RGC-5中cleaved-PARP蛋白表達aP<0.05vsG1組；cP<0.05vsG2組。

圖6各組小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞RGC-5中cleaved-caspase-3蛋白表達aP<0.05vsG1組；cP<0.05vsG2組。

3討論

嘌呤受體(purinoceptor，P受體)分為P1和P2兩類。其中P2受體主要由核苷酸激活， 包括P2X 和P2Y兩大家族。P2X 家族屬配體門控離子通道，包括7種亞型，即P2X1-7。其中P2X7受體與其它P2X受體亞型顯著不同，在低濃度激動劑刺激下可以引起非選擇性單價和多價陽離子通道開放，允許K+、Na+、Ca2+等陽離子跨膜流動，而Ca2+大量內(nèi)流可引發(fā)細胞的凋亡；在重復或者長時間P2X7激活時，P2X7受體通道逐漸擴大，可增至3nm孔洞，對各種陽離子包括分子質(zhì)量達900Da 的有機陽離子通透，從而導致細胞凋亡[1]，因此P2X7是一種重要的凋亡受體。P2X7受體在體內(nèi)的分布極為廣泛，視網(wǎng)膜內(nèi)、外層神經(jīng)元有多種類型P2X受體表達，其中P2X7受體主要分布在RGCs層[2-3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)P2X7受體與視網(wǎng)膜的功能密切相關，例如在玻璃體視網(wǎng)膜病變中，P2X7受體的表達增加；受體的激活可引起視網(wǎng)膜周細胞收縮等[4-5]。ATP是P2X7受體的天然激動劑，但與P2X7受體親和力比較低。2’-3’-O-(4-benzoylbenzoyl)-ATP(BzATP)是P2X7受體最強的激動劑，與P2X7受體的親和力是ATP的10～100倍[6]；P2X7受體拮抗劑包括Brilliant Blue G (BBG)、oxidized ATP (oxATP)、A-438079等，其中BBG在nmol/L濃度水平即選擇性拮抗P2X7受體[7-8]。RGC是視網(wǎng)膜最終端的神經(jīng)元，在視覺信息的整合和傳遞中至關重要。缺血、缺氧會導致RGC損傷、變性和凋亡，最終引起視覺功能喪失[9-10]，是許多視網(wǎng)膜和視神經(jīng)疾病發(fā)展到最后的必經(jīng)之路，如糖尿病視網(wǎng)膜病變、青光眼、視網(wǎng)膜中央動脈阻塞等，因此研究缺氧誘發(fā)的RGC細胞凋亡機制有可能找到治療預防視網(wǎng)膜和視神經(jīng)疾病新的治療方法，從而避免更多人喪失寶貴的視力。基于上述，我們觀察了嘌呤受體P2X7對缺氧誘發(fā)RGC凋亡中的影響，首先，缺氧處理視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞株RGC-5，MTT檢測細胞存活率、流式細胞儀檢測細胞的凋亡率及Western Blot檢測細胞內(nèi)cleaved-PARP和cleaved-caspase-3蛋白表達，其中caspase-3為caspase家族重要成員，是細胞凋亡蛋白級聯(lián)反應的必經(jīng)之路，而PARP是caspase-3主要底物，兩者在細胞凋亡中起到重要作用。實驗結(jié)果顯示，與正常對照組相比，缺氧可以使RGC-5細胞的存活率明顯降低，凋亡率顯著升高，cleaved-PARP和cleaved-caspase-3蛋白表達均顯著升高(P<0.05)，這些結(jié)果表明，缺氧可以誘發(fā)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞RGC-5發(fā)生凋亡。為了進一步檢測P2X7受體是否參與缺氧導致的RGC-5細胞凋亡，分別用受體的激動劑BzATP和拮抗劑BBG處理細胞，實驗結(jié)果表明，P2X7受體激動劑BzATP能明顯加重缺氧誘發(fā)的細胞凋亡，而BBG預處理可以顯著拮抗缺氧所致的細胞凋亡。這些實驗結(jié)果證明缺氧能激活RGC嘌呤受體P2X7，并參與RGC的凋亡。但P2X7受體通過何種機制參與RGC的凋亡尚需進行下一步實驗深入探討。

參考文獻

2 Wheeler-Schilling TH, Marquordt K, Kohler K,etal. Identification of purinergic receptors in retinal ganglion cells.BiomedBrainResMolBrainRes2001；92(1-2):177-180

3 Mitchell CH,Lu W,Hu H,etal. The P2X7 receptor in retinal ganglion cells: A neuronal model of pressure-induced damage and protection by a shifting purinergic balance.PurinergicSignal2009；5(2):241-249

4 Bringmann A, Pannicke T, Moll V,etal. Upregulation of P2X(7) receptor currents in Müller glial cells during proliferative vitreoretinopathy.InvestOphthalmolVisSci2001；42(3):860-867

5 Kawamura H, Sugiyama T, Wu DM,etal. ATP: a vasoactive signal in the pericyte - containing microvasculature of the rat retina.JPhysiol2003；551(Pt 3):787-799

6 Young MT, Pelegrin P, Surprenant A. Amino acid residues in the P2X7 receptor that mediate differential sensitivity to ATP and BzATP.MolPharmacol2007；71(1): 92-100

7 Donnelly-Roberts DL, Jarvis MF. Discovery of P2X7 receptor-selective antagonists offers new insights into P2X7 receptor function and indicates a role in chronic pain states.BrJPharmacol2007；151(5):571-579

8 Michel AD, Chambers LJ, Clay WC,etal. Direct labelling of the human P2X7 receptor and identification of positive and negative cooperativity of binding.BrJPharmacol2007；151(1):103-114

9 Cao Y, Li X, Wang CJ,etal. Role of NF-E2-related factor 2 in neuroprotective effect of l-carnitine against high glucose-induced oxidative stress in the retinal ganglion cells.BiomedPharmacother2015；69:345-348

10 Chen YJ, Huang YS, Chen JT,etal. Protective effects of glucosamine on oxidative-stress and ischemia/reperfusion-induced retinal injury.InvestOphthalmolVisSci2015；56(3):1506-1516

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.4.08

收稿日期：2015-11-16 修回日期： 2016-03-18

通訊作者：郝旭紅.sysyhxh@163.com

作者簡介：郝旭紅，主任醫(yī)師，碩士研究生導師，病房副主任，研究方向：眼底病、青光眼、神經(jīng)眼科。

基金項目：遼寧省自然科學基金(No.2014020184)
作者單位：(110031)中國遼寧省沈陽市第四人民醫(yī)院眼科

目的：探討嘌呤受體P2X7對缺氧誘發(fā)小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡的影響。

方法：以小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞株RGC-5為研究對象，按照不同處理因素將細胞隨機分為4組：正常對照組(G1)、缺氧組(G2)、缺氧+激動劑(BzATP)組(G3)、缺氧+拮抗劑(BBG)組(G4)；采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測細胞的存活率；用Annxin V/PI染色流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率；Western Blot檢測細胞內(nèi)cleave-caspase-3和cleave-PARP蛋白的表達。

結(jié)果：與正常對照組相比，RGC-5細胞經(jīng)缺氧處理后，細胞存活率明顯降低；凋亡率顯著升高；細胞內(nèi)cleave-caspase-3和cleave-PARP蛋白表達增加；P2X7受體激動劑BzATP能明顯加重缺氧誘發(fā)的細胞凋亡，而BBG預處理可以顯著拮抗缺氧所致的細胞凋亡。

結(jié)論：缺氧能激活視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞嘌呤受體P2X7，并參與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡。