張丹，于浩，榮義輝

戊型肝炎病毒ORF3和標(biāo)簽His融合真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)

張丹，于浩，榮義輝

目的體外構(gòu)建HEV ORF3蛋白融合His標(biāo)簽的真核表達(dá)載體及其初步鑒定和蛋白表達(dá)。方法從1例男性31歲戊型肝炎患者血清中分離HEV RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，特異性引物擴(kuò)增HEV ORF3片段，將其定向連接到pcDNA3.1(-）-His真核表達(dá)載體中，經(jīng)抗生素篩選后，酶切及測序鑒定其序列正確性。采用提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，培養(yǎng)96 h后裂解細(xì)胞，采用抗His-Tag抗體進(jìn)行Western blot檢測目的蛋白。結(jié)果從戊型肝炎患者血清中成功分離出I型HEV RNA，經(jīng)抗生素篩選、酶切鑒定和測序確認(rèn)pcDNA3.1(-）-HEF3-His真核表達(dá)載體構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，經(jīng)Western blot檢測顯示15 kDa位置有明顯融合蛋白條帶。結(jié)論成功構(gòu)建了HEV ORF3與His標(biāo)簽融合的真核表達(dá)載體，體外轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后鑒定其工作良好，為后續(xù)HEV ORF3蛋白的研究奠定了基礎(chǔ)。

戊型肝炎病毒；真核表達(dá)；融合蛋白

戊型肝炎是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus, HEV）引起的病毒性肝炎。該病毒主要經(jīng)由腸道傳播，常引起爆發(fā)流行,主要發(fā)生在青壯年，男性高于女性[1]，其發(fā)病重，病死率高。也有報道稱，年齡越大其感染率越高[2]。戊型肝炎所致人群病死率在0.5%～1.5%之間，在孕婦和老年人中高達(dá)20%以上[3]。HEV基因組為線狀單股正鏈RNA，全長約7.2 kb，含3個開發(fā)讀碼框架（Open reading frame，ORF）[4]。HEV ORF3基因片段長369 bp，位于HEV基因組3’端,與基因組ORF1和ORF2基因都有部分重疊。ORF3編碼約14 KDa大小的蛋白。ORF3蛋白的功能尚不清楚，目前認(rèn)為其與宿主細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑、HEV釋放到胞外以及誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)方面起著十分重要的作用[5～11]。我們從1例感染I型HEV的戊型肝炎患者血清中分離出HEV RNA，克隆了ORF3基因cDNA片段，并構(gòu)建了His標(biāo)簽（6個組氨酸的多肽，制備的抗His-Tag抗體可特異性地識別His標(biāo)簽）的真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究HEV ORF3 蛋白的功能和HEV的致病性提供了實驗工具。

1 材料與方法

1.1 病例資料2013年10月在我院就診的戊型肝炎患者，男性，31歲。乏力納差5天，尿黃，低熱伴有皮膚瘙癢，無惡心嘔吐，無一過性陶土樣大便，血清抗HEV-IgG陽性，經(jīng)基因檢測系I型HEV感染。排除其他嗜肝病毒感染。獲得患者血清，置-80℃保存。

1.2 主要試劑和細(xì)胞全血RNA提取試劑盒（德國Qiagen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Invitrogen公司），2×PCR easymix（北京全式金生物公司），pGEM-T easy克隆試劑盒（美國Promega公司），pcDNA3.1（-）-His載體（美國Invitrogen公司），質(zhì)粒提取試劑盒（德國Qiagen公司），轉(zhuǎn)染試劑Xgeme HD （美國Roche公司），抗鼠His-Tag單克隆抗體和Western Blot 套裝（北京康為世紀(jì)生物公司）。DMEM和小牛血清（美國Giboco公司），HepG2細(xì)胞系為本室保存。

1.3 HEV RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，提取血清RNA，并以oligd T引物在42℃作用90 min，70℃15 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.4 HEV ORF3目的片段的擴(kuò)增和T-A克隆根據(jù)I型HEV RNA序列設(shè)計引物:正向引物：5’-CGCTCGAGATGGAGATGCCACCATGCGCT-3’（Xho I），反向引物：5’-CGGAATTCTCAACGGCGAAGCCCCAG-3’（EcoR I）。引物由北京天一輝遠(yuǎn)公司合成。在50 μl PCR反應(yīng)體系中加cDNA模板2μl，反應(yīng)條件為：94℃5 min；94℃30 s，55℃15 s，72℃30 s×35個循環(huán)；72℃10 min，4℃保持。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%TAE 瓊脂糖凝膠水平電泳鑒定后，目的片段位置正確且清晰單一，片段長度為369 bp。然后，用膠回收試劑盒回收目的產(chǎn)物片段，目的片段連接入T-easy載體中，熱激轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，加高糖培養(yǎng)基500μl ，37℃震蕩孵育2 h，將菌液均勻涂抹在預(yù)制的有氨芐抗性和IPTG/X-gal的固體培養(yǎng)基平板上，37℃孵育過夜，藍(lán)白斑篩選，挑選白色陽性克隆菌落，菌落經(jīng)PCR鑒定條帶正確后，送測序，鑒定序列。

1.5 pcDNA3.1（-）-HEF3-His表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定挑選T-A克隆測序正確的克隆，提取質(zhì)粒和pcDNA3.1（-）-His，分別用Xho I和EcoR I 雙酶切，分別膠回收目的片段，用T4 DNA連接酶4℃連接過夜，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，加高糖培養(yǎng)基500μl，37℃震蕩孵育2 h，將菌液均勻涂抹在預(yù)制的氨芐抗性的固體培養(yǎng)基平板上，37℃孵育過夜，挑選白色克隆菌落，經(jīng)PCR鑒定條帶正確后，提取質(zhì)粒，經(jīng)XhoI/EcoRI雙酶切鑒定正確后，用T7通用測序引物測序，鑒定載體序列。

1.6 pcDNA3.1（-）-HEF3-His載體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞鑒定提取轉(zhuǎn)染級的pcDNA3.1（-）-HEF3-His載體質(zhì)粒，測定其濃度，與轉(zhuǎn)染試劑Xgeme HD按1：2.5混合于Optim-MEM培養(yǎng)基中，室溫孵育30 min。取HepG2細(xì)胞，提前一天鋪板，按2×105個細(xì)胞/孔接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞生長至60%～80%融合時，每孔加入質(zhì)粒1μg，按比例與轉(zhuǎn)染試劑混合后，緩慢滴加到無血清培養(yǎng)基孵育的HepG2細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃，5%CO2孵育4～5 h，棄去上清，PBS清洗細(xì)胞3次，每孔加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基1 ml，37℃，5%CO2孵育96 h，收取HepG2細(xì)胞，裂解細(xì)胞后提取蛋白，用抗鼠His單克隆抗體行Western bolting檢測細(xì)胞內(nèi)HEV ORF3-His融合蛋白的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 HEV ORF3基因目的片段擴(kuò)增提取血清HEV RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板擴(kuò)增HEV ORF3基因片段，HEV ORF3目的片段大小為393 bp，條帶清晰正確（圖1）。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳鑒定ORF3目的片段

2.2 HEV ORF3基因目的片段克隆與酶切鑒定HEV ORF3 PCR產(chǎn)物目的片段連接入T-easy載體后，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，在固體培養(yǎng)板上藍(lán)白斑篩選（圖2A），挑取5個白色陽性菌落，裂解細(xì)菌后進(jìn)行菌落PCR鑒定克隆目的片段（圖2B），菌落PCR鑒定正確后，搖菌提取對應(yīng)質(zhì)粒，EcoR I/Xho I雙酶切鑒定有4個質(zhì)粒為3300 bp和360 bp兩個單一片段，與預(yù)期結(jié)果相符（圖2C）。

圖2 HEV ORF3 T-A克隆篩選和鑒定結(jié)果A：T-A克隆藍(lán)白斑篩選培養(yǎng)板；B：菌落PCR電泳結(jié)果；C：T-A陽性克隆質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

2.3 pcDNA3.1（-）-HEF3-His載體連接后雙酶切鑒定分別用EcoR I/Xho I雙酶切4個鑒定陽性T-A克隆HEV ORF3質(zhì)粒和pcDNA3.1（-）-His載體質(zhì)粒，分別回收目的DNA片段。然后，將2個片段定向連接后構(gòu)建重組HEV ORF3基因表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)，涂板后挑取單克隆菌落，搖菌提取對應(yīng)質(zhì)粒，EcoR I/Xho I雙酶切后電泳鑒定，5500 kb位置和393 kb位置各有單一條帶（圖3）。4個鑒定載體送測序檢測。

圖3 重組表達(dá)載體的酶切鑒定

2.4 pcDNA3.1（-）-HEF3-His載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞HEV ORF3-His融合蛋白的表達(dá)將酶切和測序鑒定正確的4個相同來源的pcDNA3.1（-）-HEF3-His重組表達(dá)載體，搖菌提取轉(zhuǎn)染級質(zhì)粒，紫外分光光度計測定質(zhì)粒濃度，質(zhì)粒按比例轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，37℃，5%CO2孵育96 h，收集細(xì)胞，裂解提取蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，先后滴加抗鼠His-Tag單克隆抗體和兔抗鼠IgG，采用Western blot法檢測獲得的4個相同來源的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示內(nèi)參β-actin在42 KDa位置、ORF3-His融合蛋白在15 KDa位置呈現(xiàn)為單一清晰條帶（圖4）。

圖4 重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞蛋白表達(dá)鑒定

3 討論

HEV 屬于戊型肝炎病毒科，戊型肝炎病毒屬。目前，至少發(fā)現(xiàn)了4 個主要基因型，其中基因Ⅰ型在亞洲、非洲和中東地區(qū)的人群流行，基因Ⅱ型只在墨西哥和非洲少數(shù)地方的人群流行，基因Ⅲ型和Ⅳ型為人畜共患病原體，基因Ⅲ型在全球的人群和豬群中流行，基因Ⅳ型主要在東南亞國家的人群和豬群間流行。我國主要流行株為基因Ⅳ型HEV，也有I型和III型HEV感染的報道。據(jù)WHO 在 2011 年估計，全球每年新發(fā)戊型肝炎約3400 萬例，其中死亡30萬例[12]。HEV引起的急性肝炎多為自限性疾病，但致死率為1%～2%，孕婦高達(dá)10%～20%[13]。最近的研究顯示，在發(fā)達(dá)國家戊型肝炎的發(fā)病率也呈上升趨勢[14]。

I型HEV ORF3 由369 bp核苷酸組成，編碼含有123個氨基酸的磷蛋白，編碼蛋白分子量約13.5 KDa。目前分離到的HEV ORF3蛋白中104～113位氨基酸序列（RPSAPPLPHV）高度保守[15]，均含有富含脯氨酸的PPLP 基序。通過體外實驗和酵母雙雜交實驗發(fā)現(xiàn)，HEV ORF3蛋白能與多種信號蛋白結(jié)合，而且HEV ORF3蛋白主要是通過其PPLP 基序與信號蛋白的SH3 結(jié)構(gòu)域發(fā)生相互作用[16]。人乳頭瘤病毒、人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒等引起慢性感染的病毒，均可通過其編碼蛋白上的PPLP 基序，與宿主細(xì)胞內(nèi)信號分子結(jié)合，引起細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)紊亂，從而有利于病毒在人體內(nèi)的復(fù)制、免疫逃避以及病毒感染慢性化[17,18]。PPLP基序可與SH3 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，激活MAPK/ERK細(xì)胞信號通路，影響多種基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)胞增殖與分化，避免細(xì)胞凋亡[19,20]。但當(dāng)感染HEV細(xì)胞先表達(dá)的ORF3蛋白與延后表達(dá)的非糖基化ORF2蛋白結(jié)合后形成復(fù)合物，該復(fù)合物會促進(jìn)細(xì)胞裂解，將成熟的HEV顆粒釋放[21]。ORF3蛋白可以促進(jìn)感染細(xì)胞向胞外分泌一種AMBP（α1-macroglobulin/bikunin precursor）多肽，該多肽可以抑制中性粒細(xì)胞的趨化作用和抗原誘導(dǎo)的T細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而抑制宿主免疫系統(tǒng)對HEV的清除作用[22]。HEV ORF3蛋白的確切功能以及與戊型肝炎發(fā)病機(jī)制的關(guān)系有待進(jìn)一步闡明。

目前，雖然已有許多來源于人或猴的肝、腎和肺細(xì)胞等細(xì)胞系均能支持HEV體外復(fù)制，但這些細(xì)胞系有尚未解決的缺陷：（1）不能產(chǎn)生高滴度的HEV顆粒；（2）現(xiàn)有的傳代細(xì)胞中多次傳代后HEV丟失或細(xì)胞產(chǎn)生變化。因此，目前還尚未發(fā)現(xiàn)能在體外持續(xù)支持HEV 復(fù)制的永生傳代細(xì)胞系[23]。HEV分子生物學(xué)特性的進(jìn)一步研究變得十分有意義。

His標(biāo)簽是蛋白質(zhì)重組技術(shù)中經(jīng)常用到的一種標(biāo)簽，其序列為6個相連的組氨酸，具有分子量小，融合后基本不改變蛋白質(zhì)的生物結(jié)構(gòu)和溶解性。ORF3蛋白是僅有123個氨基酸的磷脂蛋白，其生物結(jié)構(gòu)對其功能的影響變得十分重要。因此，我們選擇了蛋白質(zhì)重組技術(shù)中最小的蛋白標(biāo)簽His作為其標(biāo)記物。本實驗將I型HEV ORF3 基因插入帶His標(biāo)簽的真核表達(dá)載體中，使其位于His的C 端，兩個基因共用一個終止密碼子，利用檢測融合蛋白的表達(dá)反映HEV ORF3蛋白的表達(dá)。pcDNA3.1（-）-HEF3-His重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定和直接測序均提示含有目的基因ORF3序列，證實載體構(gòu)建成功。將該載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HepG2 細(xì)胞，經(jīng)Western blot法檢測結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞能夠表達(dá)ORF3-His融合蛋白，可觀察到表達(dá)15 kDa 左右的產(chǎn)物，與預(yù)期結(jié)果相符。

成功構(gòu)建中國人群I型HEV pcDNA3.1（-）-HEF3-His真核表達(dá)載體，為后續(xù)研究HEV ORF3蛋白干擾細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和避免受感染細(xì)胞的凋亡提供了研究工具，為進(jìn)一步研究釋放HEV顆粒的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

[1] Takahashi M，Tamura K，Hoshino Y，et al. A nationwide survey of hepatitis E virus infection in the general population of Japan.J Med Virol，2010，82（2）：271-281.

[2] Villalba MC，Guan M，Perez A，et al. Seroprevalence of antibodies to hepatitis E virus in two large communities in Havana，Cuba. Trans R Soc Trop Med Hyg，2010，104（12）：772-776.

[3] Bachlein C，Grummer B. Hepatitis E--a new zoonotic disease in Germany Berl Munch Tierarztl Wochenschr，2010，123（5-6）：198-204.

[4] Tam AW，Smith MM，Guerra ME，et al. Hepatitis E virus（HEV）: molecular cloning and sequencing of the full-length viralgenome.Viro logy，1991，185（1）:120- 131.

[5] Chandra V，Kar-roy A，Kumari S，et al. The hepatitis E virus ORF3 protein modulates epidermal growth factor receptor trafficking，STAT3 translocation，and the acute- phase response. J Virol，2008，82（14）:7100-7110.

[6] Moin SM，Panteva M，Jameel S. The hepatitis E virus Orf3 protein protects cells from mitochondrial depolarization and death.J Biol Chem，2007，282 （29）:21124-21133.

[7] Tyagi S，Sur j it M，L al SK. The 41-amino-acid C-terminal region of the hepatitis E virus ORF3 protein interacts with bikunin，a kunitz-type serine protease inhibi tor.J Virol，2005，79（18）: 12081-12087.

[8] Tyagi S，Sur j it M，Roy AK，et al. The ORF3 protein of hepatitis E virus interacts with liver- specific alpha1- microglobulin and its precursor alpha1- microglobulin/bikunin precursor（AMBP）and expedites their export from the hepatocyte.J Biol Chem，2004，279（28）:29308-29319.

[9] Kar-roy A，Korkaya H，Oberoi R，et al. The hepatitis E virus open reading frame 3 protein activates ERK through binding and inhibition of the MAPK phosphatase. J Biol Chem，2004，279（27）:28345-28357.

[10] Tyagi S，Korkaya H，Z afrullah M，et al. The phosphorylated form of the ORF3 protein of hepatitis E virus interactswith its nonglycosylated form of the ma j or capsid protein，ORF2. J Biol Chem，2002，277（25）:22759-22767.

[11] Kumar S，Subhadra S，Singh B，et al．Hepatitis E virus:the current scenari.Int J Infect Dis，2013，17（4）:228-233．

[12] WHO. Viral hepatitis in the WHO south-east Asia region. India:regional office for south-east Asia，2011.

[13] Emerson S U，Purcell RH. Hepatitis E virus. Rev Med Virol，2003，13（3）:145-154.

[14] Dalton H R，Bendall R，Lj az S，et al. Hepatitis E: an emerging infection in developed coun tries.Lancet Infect Dis，2008，8（11）: 698-709.

[15] Nagashima S，Takahashi M，Jirintai H，et al.A PSAP motif in the ORF3 protein of hepatitis E virus is necessary for virion release from infected cells.J Gen Virol，2011，92（2）:269-278.

[16] Kumar S，Subhadra S，Singh B，et al. Hepatitis E virus:the current scenario.Int J Infect Dis，2013，17（4）:228-233.

[17] Shih W L，Kuo M L，Chuang SE，et al.Hepatitis B virus X protein activates a survival signaling by linking SR C to phosphatidylinositol 3-kinase.J Biol Chem，2003，278（34）: 31807-31813.

[18] Georgopoulou U，Caravokiri K，Mavromara P.Suppression of the ERK1/2 signaling pathway from HCV NS5A protein e x pressed by herpes simpl ex recombinant viruses．Arch Virol，2003，148（2）:237-251．

[19] Kar-roy A，Korkaya H，Oberoi R，et al. The hepatitis E virus open reading frame 3 protein activates ERK through binding and inhibition of the MAPK phosphatase.J Biol Chem，2004，279（27）:28345-28357.

[20] Korkaya H，Jameel S，Gupta D，et al. The ORF3 protein of hepatitis E virus binds to Src homology 3 domains and activates MAPK.J Biol Chem，2001，276（45）:42389- 42400.

[21] Panteva M，Korkaya H，Jameel S. Hepatitis viruses and the MAPK pathway:is this a survival strategy.Viru s Res，2003，92（2）:131-140.

[22] Tyagi S，Sur j it M，Roy AK，et al. The ORF3 protein of hepatitis E virus interacts with liver-specific alpha1- microglobulin and its precursor alpha1-microglobulin/bikunin precursor（AMBP）and expedites their export from the hepatocyte.J Biol Chem，2004，279（28）:29308-29319.

[23] Panda SK，Ansari IH，Durgapal H，et al. The in vitrosynthesized RNA from a cDNA clone of hepatitis E virus is infectious.J Virol，2000，74（5）:2430-2437.

（收稿：2015-07-30）

（本文編輯：陳從新）

Hepatitis E virus ORF3 and His tag fusion eukaryotic expression vector construction and expression in vitro

Zhang Dan，Yu Hao，Rong Yihui.Infectious
Disease Hospital，Panjin 124000，Liaoning Province

Objective To construct the eukaryotic expre ssion vector，to id entify and to investigate its expression of HEV ORF3 fusion protein His label.Methods HEV RNA was isolated from the serum of a male patient with hepatitis E，and the HEV ORF3 cDNA was synthesized by reverse transcription and specific primers，then directionally ligated into pcDNA3.1（-）his in the eukaryotic expression vector，and the sequence of the enzyme digestion and sequencing was detected.The vector plasmid was transfected into HepG2 cells，which was used to detect the target protein 4 days later，and the target protein was detected by Western blot with anti-His.Results The HEV RNA type I were successfully isolated；after antibiotic screening and enzyme digestion，the pcDNA3.1（-）-HEF3-His eukaryotic expression vector was successfully constructed.The vector was transfected into HepG2 cells，and after 96 h incubation，an 15 kDa protein was demonstrated suggesting the fusion protein existed.Conclusion The eukaryotic expression vector of HEV ORF3 and His tag fusion are successfully constructed，and transfected into HepG2 cells，which might lay a foundation for further study of HEV ORF3 protein.

Hepatitis E virus；Eukaryotic expression；Fusion protein

124000遼寧省盤錦市傳染病醫(yī)院（張丹）；盤錦市中醫(yī)院（于浩）；解放軍第302醫(yī)院肝衰竭診療與研究中心（榮義輝）第一作者：張丹，女，42歲，大學(xué)本科。E-mail：zhangdanwz_1973@sina.com

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.02.010