丁寧，張明香

人HNF4α基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定*

丁寧，張明香

目的體外構(gòu)建人肝細(xì)胞核因子4α（HNF4α）基因真核表達(dá)載體，并初步鑒定其在HepG2細(xì)胞的表達(dá)。方法從肝癌手術(shù)患者獲得肝組織，分離得到肝組織總RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，經(jīng)特異性引物擴(kuò)增HNF4α基因片段，將其定向連接到pcDNA3.1(+）真核表達(dá)載體，經(jīng)抗生素篩選后，酶切及測(cè)序鑒定其序列正確。提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，48 h后裂解細(xì)胞，應(yīng)用抗HNF4α行Western blot檢測(cè)目的蛋白。結(jié)果從臨床肝癌患者肝組織中成功分離得到總RNA，擴(kuò)增出HNF4α基因，經(jīng)篩選、酶切鑒定和測(cè)序，確認(rèn)pcDNA3.1-4α真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。在轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞48 h后，檢測(cè)顯示53 kDa位置有明顯融合蛋白條帶。結(jié)論我們成功構(gòu)建了HNF4α基因真核表達(dá)載體，體外轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞成功表達(dá)HNF4α蛋白，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

HepG2細(xì)胞；肝細(xì)胞核因子4α; 真核表達(dá); 細(xì)胞因子

肝細(xì)胞核因子4α（Hepatocyte nuclear factor 4α,HNF4α）是核激素受體超家族HNF4 的成員之一，高表達(dá)于肝臟組織，在胰腺、腎臟和小腸等組織內(nèi)亦有少量的表達(dá)。在成人肝臟，其可與約12%基因的啟動(dòng)子結(jié)合[1]。HNF4α處于轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的上游，以同源二聚體的形式與DNA 結(jié)合，可與四十多種靶基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子相互作用，進(jìn)而調(diào)控與肝細(xì)胞功能相關(guān)基因的表達(dá)，參與糖、脂和膽固醇的代謝，具有解毒作用，通過調(diào)節(jié)膽汁酸代謝和蛋白質(zhì)合成等途徑，也具有激活編碼細(xì)胞外粘附分子、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞骨架蛋白基因表達(dá)的功能[2～4]。在胚胎發(fā)育過程中，最先在胚泡的原始內(nèi)胚層中發(fā)現(xiàn)HNF4αmRNA的存在，其表達(dá)水平隨著肝細(xì)胞分化成熟而逐漸增高[5]。本研究構(gòu)建了人HNF4α基因的真核表達(dá)載體，通過轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞鑒定載體正常表達(dá)，為進(jìn)一步研究提供了良好的研究對(duì)象。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和試劑HepG2細(xì)胞為本科保存。PCReasyMIx （全式金生物有限公司，北京），DNA膠回收試劑盒（Qiagen，德國），T-A克隆試劑盒（Promega，美國），RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen，美國），EcoR I/BamH I核酸內(nèi)切酶（NEB公司，美國），pcDNA3.1(+）真核表達(dá)載體（Invitrogen，美國），DMEM和胎牛血清（Gibico，美國），轉(zhuǎn)染試劑X-geme HD（Roche，美國），Western blot套裝（康為世紀(jì)，北京），抗HNF4a單克隆抗體（Santa Cruz，美國），β-actin（康為世紀(jì)，北京），HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG（中杉金橋，北京），引物序列由上海生工生物公司合成。

1.2 HNF4α基因的引物設(shè)計(jì)及cDNA獲取自NCBI獲得HNF4αcDNA（GenBank Number：NM_000545）提交序列，按照序列信息合成HNF4α擴(kuò)增引物。上游引物4αF：5'-AGGATCCATGCGACTCTCCAAAACCCTCG-3'(BamH I）；下游引物4αR：5'-AGAATTCCCTAGATAACTTCCTGCTTGGTG-3'(EcoR I）。從我院肝膽外科2例男性（41歲和58歲）原發(fā)性肝癌患者手術(shù)獲得的癌旁新鮮肝組織，立即加入液氮，在研缽內(nèi)研碎。嚴(yán)格按照Qiagen組織RNA提取試劑盒說明書提取總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書以oligdT引物在42℃作用90 min，70℃15 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR擴(kuò)增體系：2×PCR Mix 25μl, 4αF 0.5μl,4αR 0.5μl,cDNA產(chǎn)物5μl,加ddH2O補(bǔ)足至50μl。PCR擴(kuò)增條件：94℃3 min,94℃15 s,55℃20 s,72℃40 s×35循環(huán)；72℃10 min,4℃保存。將全部PCR產(chǎn)物加入1%TAE瓊脂糖凝膠中，110 v，25 min，電泳鑒定，對(duì)約1500 bp位置的陽性條帶進(jìn)行切膠，按照試劑盒說明，回收目的PCR產(chǎn)物片段，以溴乙錠（EB）30μl重溶產(chǎn)物DNA，置于-20℃保存。

1.3 HNF4αcDNA克隆首先進(jìn)行連接實(shí)驗(yàn)，即應(yīng)用連接體系:T4 DNA連接酶Buffer 1μl，pGEMT Easy載體（50 ng）1μl，膠回收DNA 3μl，T4 DNA連接酶（3 U/μl）1μl，加ddH2O補(bǔ)足至10μl，輕柔混勻，短暫離心，置于4℃過夜；轉(zhuǎn)化：將自-70℃冰箱中取出的JM109感受態(tài)細(xì)胞置于冰上5 min，待菌液完全融化后，輕柔吹打混合，取感受態(tài)細(xì)胞50 μl，加入到連接體系的EP管中，靜置于冰上20 min，在42℃水浴中熱擊1 min，確保轉(zhuǎn)化EP管不震動(dòng)。隨后，迅速將EP管移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻2 min。在每管連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞中加入平衡至室溫的SOC培養(yǎng)基500μl。將轉(zhuǎn)化管在恒溫振蕩器中振蕩培養(yǎng)，37℃，180 r/m搖菌1 h。按照300μl轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基/板的比例將培養(yǎng)基均勻涂布于含有XGal/（異丙基-β-d-硫代半乳糖苷，IPTG）/氨芐青霉素的固體平板培養(yǎng)皿表面。將培養(yǎng)皿置于37℃過夜。次日，挑取單克隆白色菌斑進(jìn)行鑒定；菌落PCR鑒定：將雙蒸水10μl加入PCR反應(yīng)管中，采用無菌牙簽挑取白色單克隆菌落，在上述反應(yīng)管中沖涮數(shù)次，再接種于新的復(fù)制板上，將PCR管置于PCR儀中95℃作用10 min，再冰浴3 min，裂菌。將復(fù)制板置于37℃孵箱中過夜培養(yǎng)。以裂解菌液產(chǎn)物為模板，PCR反應(yīng)條件和體系同前，進(jìn)行目的片段擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%TAE瓊脂糖凝膠電泳鑒定，發(fā)現(xiàn)目的片段，則為陽性克隆。取陽性克隆菌液送測(cè)序鑒定。

1.4 pcDNA3.1-4α真核表達(dá)載體的構(gòu)建將測(cè)序正確的HNF4αcDNA克隆菌液和轉(zhuǎn)化了pcDNA3.1（+）空質(zhì)粒的菌液，在37℃，220 r/m搖菌、過夜。按照試劑盒提取質(zhì)粒，分別以EcoR I/BamH I雙酶切質(zhì)粒，酶切體系為：NEB Buffer 3.1 3μl，EcoR I 1μl，BamH I 1μl，HNF4αcDNA質(zhì)粒/pcDNA3.1（+）空質(zhì)粒5μl，加ddH2O補(bǔ)足至30μl，37℃孵育過夜。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%TAE瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，膠回收5.3 kb和1.5 kb目的片段。取洗脫液15μl，分別溶解回收目的片段。連接體系為:T4 DNA連接酶Buffer 1μl，酶切pcDNA3.1（+）空質(zhì)粒產(chǎn)物1 μl，酶切HNF4αcDNA產(chǎn)物3μl，T4 DNA連接酶（3 U/μl）1μl，加ddH2O補(bǔ)足至10μl，置于4℃過夜。轉(zhuǎn)化和菌落PCR實(shí)驗(yàn)條件與1.3條件相同。取陽性克隆，送測(cè)序、鑒定。

1.5 pcDNA3.1-4α載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞提取轉(zhuǎn)染級(jí)的pcDNA3.1-4α載體質(zhì)粒，并測(cè)定其濃度。取HepG2細(xì)胞鋪板，按3×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。1 d后，按載體質(zhì)粒1μg/孔轉(zhuǎn)染細(xì)胞，取pcDNA3.1-4α與轉(zhuǎn)染試劑X-geme HD按1：2.5混合于Optim-MEM培養(yǎng)基，室溫孵育30 min，緩慢滴加轉(zhuǎn)染混合物至無血清培養(yǎng)基孵育的HepG2細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃，5%CO2孵育4～5 h，棄去上清，以PBS清洗細(xì)胞2遍，加入含2%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基1 ml，37℃，5%CO2孵育48 h，留取HepG2細(xì)胞。

1.6 pcDNA3.1-4α載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞HNF4α蛋白表達(dá)檢測(cè)在細(xì)胞裂解液中按100：1加入蛋白酶抑制劑，在6孔板，每孔加入細(xì)胞裂解液100 μL，冰上充分裂解細(xì)胞，1000 g離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移到新的EP管中。將裂解的蛋白按5：1加入PAGE膠上樣緩沖液，混勻，置于沸水中10 min，室溫冷卻后，在預(yù)制的10% SDS-PAGE膠上樣，35 mA電流，作用2～3 h，按海綿-濾紙-膠-膜-濾紙-海綿的順序疊放夾好，其間不留氣泡，置于轉(zhuǎn)膜槽中，200 mA電流轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂牛奶封閉膜，加入抗HNF4α（1：200），β-actin （1：3000），4℃過夜。次日，洗滌膜3～5次，加入HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG，室溫孵育2～4 h，洗滌膜3～5次，置ECL發(fā)光試劑盒顯影、拍照，觀察蛋白條帶。

2 結(jié)果

2.1 HNF4α基因cDNA擴(kuò)增結(jié)果自2例肝癌患者癌旁肝組織提取總RNA，應(yīng)用特異性引物擴(kuò)增出HNF4αcDNA 1.5 kb 產(chǎn)物，經(jīng)1%TAE電泳鑒定，條帶清晰單一（圖1）。

圖1 癌旁肝組織HNF4αcDNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定A1，A2：患者1；B1，B2：患者2

2.2 HNF4α基因cDNA 克隆情況將PCR產(chǎn)物自膠回收目的片段，經(jīng)藍(lán)白斑（圖2A）篩選，挑取白色陽性克隆菌落，行PCR鑒定（圖2B）后，菌液送測(cè)序鑒定。

圖2 目的片段克隆及鑒定A ：藍(lán)白斑篩選；B：PCR鑒定HNF4α基因cDNA菌落A1～A4：患者1；B1～B4：患者2

2.3 pcDNA3.1-4α真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定HNF4αcDNA 克隆質(zhì)粒與pcDNA3.1（+）空載體質(zhì)粒經(jīng)EcoRI/BamHI雙酶切（圖3A），膠回收1.5 kb的目的片段，將回收的pcDNA3.1（+）載體與HNF4αcDNA片段通過T4DNA連接酶連接過夜，轉(zhuǎn)化，涂板，挑菌落，提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoRI/BamHI雙酶切鑒定（圖3B），在5.3 kb和1.5 kb各有單一條帶。送條帶正確的質(zhì)粒測(cè)序。

圖3 pcDNA3.1-4α真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定A：EcoRI/BamHI雙酶切HNF4αcDNA 克隆質(zhì)粒電泳鑒定；B：EcoRI/BamHI雙酶切pcDNA3.1-4α載體質(zhì)粒電泳鑒定A1～A3：患者1；B1，B4：患者2

2.4 pcDNA3.1-4α載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞HNF4α蛋白表達(dá)情況取鑒定正確的pcDNA3.1-4α重組表達(dá)載體，提取轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞，裂解提取蛋白，經(jīng)Western blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在15 KDa位置有一單一清晰的HNF4α蛋白條帶表達(dá)（圖4）。

圖4 Western blot檢測(cè)pcDNA3.1-4α載體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞HNF4α蛋白表達(dá)1～3：患者1；4：患者2

3 討論

肝臟合成白蛋白和載脂蛋白等一系列血漿蛋白，合成和儲(chǔ)存糖原，調(diào)節(jié)膽固醇的合成和運(yùn)輸以及解毒功能，負(fù)責(zé)代謝調(diào)控等[6]。然而，肝臟疾病不僅種類繁多，而且具有較高的發(fā)病率和死亡率，如肝硬化、肝癌、病毒性肝炎、急性肝功能衰竭，成為當(dāng)今社會(huì)威脅人類健康的主要疾病之一[7,8]。目前，肝細(xì)胞移植為肝臟疾病的治療開辟了一條新的途徑，可用于治療代謝性肝病和急、慢性肝衰竭等[9～11]。然而，肝細(xì)胞的來源短缺成為這些應(yīng)用與研究推進(jìn)的一大挑戰(zhàn)。

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是一類起始于發(fā)育早期中胚層的成體干細(xì)胞，具有自我更新、多向分化和免疫調(diào)控的能力，在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景[12,13]。MSCs在體內(nèi)及體外都能夠跨胚層分化為肝細(xì)胞，為解決肝細(xì)胞來源問題帶來了新的希望。近年來，肝細(xì)胞核因子被認(rèn)為在肝臟發(fā)育和分化中起重要作用。維持肝細(xì)胞分化和控制肝臟特異性基因的表達(dá)在很大程度上歸因于肝細(xì)胞核因子。研究顯示，HNF4α在維持肝細(xì)胞形態(tài)、功能發(fā)揮和分化過程中必不可少[14,15]。Nagy et al[16]發(fā)現(xiàn)在成熟肝臟中，HNF4α在卵圓細(xì)胞分化為肝細(xì)胞時(shí)即開始表達(dá)，據(jù)此認(rèn)為其在卵圓細(xì)胞向肝細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要作用。體外實(shí)驗(yàn)顯示應(yīng)用RNAi干擾HNF4α表達(dá)后肝細(xì)胞分化被抑制，在肝細(xì)胞中過表達(dá)HNF4α可使肝細(xì)胞分化相關(guān)基因恢復(fù)表達(dá)，肝功能恢復(fù)正常[17,18]。此外，國外一些研究表明，上調(diào)HNF4α表達(dá)可以促進(jìn)多能干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為肝細(xì)胞[19,20]。

本文從肝組織中提取總RNA，經(jīng)特異性引物擴(kuò)增HNF4α基因cDNA，克隆成功，預(yù)留EcoRI/BamHI雙酶切cDNA克隆質(zhì)粒后，將目的片段定向連接入pcDNA3.1(+）真核表達(dá)載體中，載體鑒定正確后，提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞，經(jīng)Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)有HNF4α蛋白的表達(dá)，說明HNF4α真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。成功構(gòu)建HNF4α真核表達(dá)載體為后續(xù)轉(zhuǎn)染臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUC-MSCs）,使其誘導(dǎo)分化為肝樣細(xì)胞研究奠定了基礎(chǔ)。

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（收稿：2015-09-21）

（本文編輯：陳從新）

Construction and identification of eukaryotic expression vector of human hepatocyte nuclear factor 4α geneinvitro

Ding Ning,Zhang Mingxiang.
Department of Liver Diseases,Sixth People’s Hospital,Shenyang 110066,Liaoning Province,China

Objective To construct eukaryotic expression vector of human hepatocyte nuclear factor(HNF）-4αgene and identify its expression in vitro.Methods The total RNA was isolated from the liver tissues of two patients with hepatocellular carcinoma(HCC）who had underwent surgical operation,and HNF4αcDNA was synthesized by reverse transcription and amplified with the existence of specific primers.Then,the HNF4α fragment was directionally linked to pcDNA3.1 positive-eukaryotic expression vector.After antibiotic screening,the sequence analysis was conducted.The vector was transfected into HepG2 cells,and the expression of target protein after 48-hour incubation was detected by Western blot.Results Enzyme digestion and sequencing illustrated that pcDNA3.1-4αpositive-eukaryotic expression vector was successfully constructed,and the results of Western blot revealed that obvious band of fusion protein was present at 53 kDa position.Conclusion The eukaryotic expression vector of HNF4αgene is successfully constructed,and it works well in HepG2 cells in vitro,which is good for further study of HNF4αprotein.

HepG2 cells;Hepatocyte nuclear factor-4α;Eukaryotic expression;Cytokines

國家傳染病重大專項(xiàng)分課題：慢性病毒性肝炎

中西醫(yī)結(jié)合治療方案優(yōu)化研究（2012ZX1005004-001）

110006 沈陽市第六人民醫(yī)院

，丁寧，女，39歲，副主任醫(yī)師，主要從事慢性肝炎、肝硬化，肝衰竭等疾病的治療研究E-Mail：dingningwz_1976@sina.com

，張明香，E-Mail：zmx6511@126.com

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.02.008