王蕾，李校天，張利，張九娜

·實(shí)驗(yàn)性肝炎·

活性維生素D3聯(lián)合LY294002體外抑制大鼠肝星狀細(xì)胞增殖作用研究*

王蕾，李校天，張利，張九娜

目的探究維生素D的活性形式—1，25-(OH）2D3聯(lián)合磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt）信號通路的特異抑制劑LY294002對體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞的抑制作用。方法將HSC-T6細(xì)胞分為正常對照、DMSO組、1,25-(OH）2D3、LY294002組和1,25-(OH）2D3+ LY294002 聯(lián)合組，采用MTT法檢測細(xì)胞增殖；在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化；使用流式細(xì)胞術(shù)檢測HSC-T6細(xì)胞凋亡；采用Western blotting法檢測Phospho-Akt（Ser473）、AKT（PAN）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3蛋白表達(dá)。結(jié)果體外干預(yù)肝星狀細(xì)胞48 h后，兩藥聯(lián)合干預(yù)組細(xì)胞抑制率為87.5%，顯著高于1，25-（OH）2D3組的50.3%或LY294002組的40.3%（P＜0.05）；聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率為92.12%，顯著高于1，25-(OH）2D3組的71.0%或LY294002組的34.0%（P＜0.05）；在顯微鏡下觀察，兩藥處理組細(xì)胞形狀由星形變?yōu)椴灰?guī)則形,凋亡數(shù)量增多,表現(xiàn)為正?；罴?xì)胞數(shù)目明顯減少,胞間隙增寬,細(xì)胞體積縮小,胞漿濃縮,胞核固縮,可見空泡及細(xì)胞碎片，有的細(xì)胞出現(xiàn)數(shù)量不等的凋亡小體；與單藥干預(yù)組比，聯(lián)合組細(xì)胞Bax/Bcl-2比值上升明顯（P＜0.05），活化的凋亡蛋白caspase-3表達(dá)顯著增加（P＜0.05）。結(jié)論1，25-（OH）2D3可協(xié)同LY294002 共同誘導(dǎo)HSC-T6 細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)其抗肝纖維化的效果。

大鼠星狀細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；LY294002；1，25-（OH）2D3；磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶

磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B （PI3K/Akt）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路普遍存在于各類細(xì)胞中，在細(xì)胞存活與分化、生長、運(yùn)動和凋亡等多種生理及病理過程中起重要作用[1,2]，參與腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及自身免疫性疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展[3～5]。也有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號通路在肝臟細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的產(chǎn)生和降解中起到重要作用，證實(shí)該通路參與調(diào)控肝纖維化過程[6,7]。作為第一個化學(xué)合成的小分子抑制劑，LY294002可與PI3K家族成員形成可逆性結(jié)合，從而特異性阻斷PI3K/Akt信號通路，促進(jìn)多種細(xì)胞凋亡，但其針對肝纖維化的作用研究較少。1,25-二羥基維生素D3（1,25-(OH）2D3）作為維生素D的生物活性形式可發(fā)揮類固醇激素樣作用，調(diào)控上百種不同基因的表達(dá), 在許多正?；虍惓＜?xì)胞的增殖、分化和凋亡過程中扮演著重要角色[8]。有體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)活性維生素D參與了肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，并通過不同的作用機(jī)制表現(xiàn)出一定的抗纖維化作用[9～11]，但其具體作用機(jī)理尚未完全明確。有學(xué)者通過聯(lián)合應(yīng)用LY294002和1,25-(OH）2D3發(fā)現(xiàn)它們可明顯提高腎系膜細(xì)胞的凋亡率，從而達(dá)到抗腎臟纖維化的效果[12]，但兩者聯(lián)合應(yīng)用后對肝星狀細(xì)胞生長的影響尚未見報道。為此，本實(shí)驗(yàn)研究了PI3K/Akt信號通路抑制劑（LY294002）聯(lián)合1,25-(OH）2D3對大鼠肝星狀細(xì)胞增殖抑制的影響，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，為應(yīng)用其抗肝纖維化的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥品、試劑與儀器大鼠肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cell, HSC-T6）由河北省消化疾病研究所提供。1,25-(OH）2D3、DMSO、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）均為美國Sigma公司生產(chǎn)；LY294002、蛋白裂解液購自南京碧云天公司；兔抗人Phospho-Akt(Ser473）、AKT(PAN）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(H+L）、抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3多克隆抗體、抗GAPDH、AnnexinV-PI凋亡試劑盒均購自美國Biovision公司；小牛血清、DMEM 培養(yǎng)基均購自美國Hyclone公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。主要儀器: 恒溫CO2培養(yǎng)箱產(chǎn)自美國Thermo Forma 公司，超凈工作臺產(chǎn)自蘇州安泰公司，倒置顯微鏡、熒光顯微鏡均產(chǎn)自日本Olympus 公司,流式細(xì)胞儀產(chǎn)自美國Beton Dickinson公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組取HSC-T6細(xì)胞，以2×105/ ml接種到含10%小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，約6～8 h貼壁,每24～48 h換液，過3～4 d，當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到80%～90% 融合成片的單層細(xì)胞時，棄去培養(yǎng)基，以無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次，以含0.25%胰酶的消化液消化，將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞按1：3或1：4 傳代接種。將細(xì)胞分為以下5組：①正常對照(N）組，以含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；②DMSO(D）組，含10%FBS的DMEM以及終濃度為0.1% DMSO；③1,25-(OH）2D3(C）組，終濃度分別為2.5×10-8mol/L、2.5×10-7mol/L、2.5 ×10-6mol/L; ④LY294002（LY）組，5×10-6mol/L;⑤1,25-(OH）2D3+LY294002 (C+LY）組，2.5×10-8mol/L、2.5×10-7mol/L、2.5×10-6mol/L的1,25-(OH）2D3+5×10-6mol/L LY294002 。根據(jù)我們前期工作和相關(guān)文獻(xiàn)報道確定各組加藥濃度[11,13]，在含5% CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.3細(xì)胞增殖抑制率測定采用MTT 法，收集處于對數(shù)生長期的HSC-T6細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度約為5×103/孔，接種于96 孔板，將僅含培養(yǎng)基的任一孔作為空白對照，培養(yǎng)細(xì)胞過夜，待貼壁后按上述各分組及藥物濃度進(jìn)行干預(yù)。在含5% CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，終止實(shí)驗(yàn)。每組各設(shè)6個復(fù)孔，每孔加入0.5 g/L MTT 20μl( 5 g/L），暗處反應(yīng)4 h，吸出孔內(nèi)剩余培養(yǎng)液，再于每孔加入DMSO150μl，充分混勻約10 min。使用酶標(biāo)儀于波長492 nm 處，測定各孔吸光度( A）值，并按公式計算兩種藥物干預(yù)對各組細(xì)胞增殖抑制率，即抑制率(%）=｛1-(實(shí)驗(yàn)組A值-試劑對照組A值）/(細(xì)胞對照組A值-空白對照組A值）｝×100%

1.4細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察將對數(shù)生長期的細(xì)胞按所需濃度接種,待細(xì)胞完全貼壁后加藥處理, 分組同1.2，孵育培養(yǎng)48 h后，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞變化，并隨機(jī)拍照。

1.5細(xì)胞凋亡率檢測用含0.25%胰酶的消化液消化并收集各組經(jīng)48 h干預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞，細(xì)胞約為2.5×105/ml，移至離心管，1000 r/m離心5 min，棄上清液，用PBS洗滌3次，吸取細(xì)胞懸液100 μL至1.5 mL EP管中。按照Annexin V-FITC-PI試劑盒說明書進(jìn)行操作，每管加入PI 5 μL、熒光素標(biāo)記的Annexin V-FITC 5 μl，混勻，室溫下避光孵育15 min，加入Binding Buffer 500 μL，上流式細(xì)胞儀，檢測細(xì)胞凋亡率，重復(fù)檢測3次，結(jié)果取平均值。

1.6 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)檢測采用Western blotting法，收集1×107個細(xì)胞，應(yīng)用RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白，用BCA法計算樣品蛋白濃度。取蛋白40 μg，按分組順序依次上樣,應(yīng)用不連續(xù)SDS-PAGE法進(jìn)行蛋白電泳，將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜上，靜置2.5 h，按照0.1 ml/cm2膜加入相應(yīng)濃度一抗(1:1000）封口，于4℃冰箱孵育過夜，洗膜后再以二抗（1:2000）封閉，并在暗室中用化學(xué)發(fā)光法（ECL）曝光膠片,沖洗顯色后，采集顯影條圖像，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行灰度定量分析，以GAPDH作為內(nèi)參，計算目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度比值，并作為最終結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。計量資料以(±s）表示, 組間差異采用單因素One way-ANOVA方差分析，計數(shù)資料用“率”表示,采用x2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物對大鼠肝星狀細(xì)胞增殖抑制率的影響如表1所示，經(jīng)過不同藥物干預(yù)處理的T6細(xì)胞48 h后，與正常對照組比較，細(xì)胞生長受到明顯抑制。當(dāng)與LY294002聯(lián)用時，細(xì)胞的存活率(%）隨1，25-(OH）2D3濃度的增加而降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性，說明1，25-(OH）2D3與LY294002聯(lián)用的細(xì)胞毒作用大于單獨(dú)用藥組。

表1 各組細(xì)胞（n=5）增殖抑制率比較

2.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化在倒置相差顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)與空白對照組比,各干預(yù)組細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的形態(tài)改變。當(dāng)LY294002(5×10-5mol/L）聯(lián)合最大濃度（2.5×10-6mol/L）的1，25-(OH）2D3作用于T6細(xì)胞48h后,細(xì)胞密度降低，并出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)。與LY294002組和1，25-(OH）2D3單獨(dú)作用組比，細(xì)胞形態(tài)改變較明顯，可見細(xì)胞形狀由星形變?yōu)椴灰?guī)則形,凋亡數(shù)量增多,表現(xiàn)為正?；罴?xì)胞數(shù)目明顯減少,胞間隙增寬,細(xì)胞體積縮小,胞漿濃縮,胞核固縮,可見空泡及細(xì)胞碎片，有的細(xì)胞出現(xiàn)數(shù)量不等的凋亡小體（圖1）。

圖1 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化（200×）A：空白對照組；B:1,25-（OH）2D3組；C:LY294002組；D:聯(lián)合組

2.3 各組T6細(xì)胞凋亡率比較按照實(shí)驗(yàn)分組處理HSC-T6細(xì)胞48 h后，1，25-（OH）2D3和LY294002組細(xì)胞凋亡率較前增高顯著，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；兩藥聯(lián)用較單獨(dú)應(yīng)用LY294002組細(xì)胞凋亡率明顯增高，說明1，25-（OH）2D3與LY294002共用可協(xié)同誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞凋亡（表2）。

表2各組HSC-T6細(xì)胞凋亡率比較

2.4 各組HSC-T6細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化經(jīng)Western blotting法檢測，經(jīng)1，25-(OH）2D3和LY294002干預(yù)48 h后，與空白對照組比，HSC-T6細(xì)胞磷酸化的Ser473和磷酸化的Akt蛋白表達(dá)均出現(xiàn)不同程度的降低，聯(lián)合用藥組降低最明顯，但各組總Akt 和Ser473蛋白水平則無明顯變化，提示兩藥聯(lián)合作用強(qiáng)有力地抑制了Akt在Ser473位點(diǎn)的磷酸化，而沒有影響到總Akt蛋白的表達(dá)。兩者聯(lián)合應(yīng)用可能通過下調(diào)PI3K/Akt信號通路達(dá)到對HSC的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用。同時，為了解兩種藥物導(dǎo)致HSC凋亡是否與凋亡調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)有關(guān)，我們進(jìn)一步應(yīng)用Western blotting法測定了Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各干預(yù)組促凋亡蛋白Bax條帶與空白對照組比較，表現(xiàn)出不同程度的上調(diào)，以聯(lián)合用藥組為著，而抗凋亡蛋白Bc1-2與對照組比較則出現(xiàn)降低趨勢，聯(lián)合用藥組降低最明顯，Bax/Bcl-2比值上升。兩者聯(lián)合應(yīng)用還明顯增加caspase-3蛋白表達(dá)活性。這些結(jié)果提示，聯(lián)合用藥可能通過下調(diào)Bcl-2，上調(diào)Bax和caspase-3活性，誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞的凋亡（圖2）。

圖2 各組細(xì)胞Akt和p-Akt蛋白表達(dá)的變化A：空白對照組；B：LY294002；C：1，25-（OH）2D3；D：聯(lián)合組

3 討論

HSC的激活和增殖能促進(jìn)肝纖維化發(fā)生，肝纖維化程度隨著肝星狀細(xì)胞數(shù)量減少可得到明顯改善[14]，抑制HSC的增殖或誘導(dǎo)其凋亡可減輕甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化。HSC的激活、增殖和凋亡機(jī)制非常復(fù)雜，涉及許多細(xì)胞因子、調(diào)節(jié)蛋白及各種信號通路，所以找到并切斷肝星狀細(xì)胞增殖活化關(guān)鍵通路就成為抗纖維化的關(guān)鍵。近年來的多項研究表明，PI3K/Akt通路在HSC 增殖和凋亡中扮演重要角色[15]。在細(xì)胞調(diào)節(jié)過程中，細(xì)胞凋亡的增加與Bax/Bcl-2比值升高有關(guān)，凋亡的下降與caspase-3的減少有關(guān)[16]。LY294002作為此通路的特異性抑制劑，通過阻斷蛋白激酶Akt的磷酸化，從而增加細(xì)胞凋亡率。通常，在抗腫瘤治療過程中與放化療聯(lián)合應(yīng)用,發(fā)揮增敏及協(xié)同作用,減少毒性作用,發(fā)揮抗細(xì)胞增殖效應(yīng)，但已有學(xué)者研究證實(shí)應(yīng)用促HSC 凋亡的藥物聯(lián)合PI3K/Akt抑制劑，將有效地抑制HSC增殖，促進(jìn)HSC 的凋亡，減少ECM 的分泌[17～19]。

本科研組前期研究證實(shí)一定濃度的1，25-(OH）2D3 可通過調(diào)控HSC細(xì)胞周期使HSC停滯在G0/G1期，并誘導(dǎo)凋亡蛋白的表達(dá)，從而誘發(fā)大鼠肝星狀細(xì)胞的凋亡。此次實(shí)驗(yàn)也表明，當(dāng)PI3K/Akt信號通路被其特異抑制劑LY294002阻斷時，較大劑量的活性維生素D的干預(yù)明顯增強(qiáng)了LY294002誘導(dǎo)活化的HSC 凋亡作用，引起抗凋亡蛋白Bcl-2顯著降低，凋亡蛋白caspase3活性增加。兩者共同誘導(dǎo)HSC凋亡機(jī)制之一可能由Bcl-2/Bax通徑經(jīng)過caspases來實(shí)現(xiàn)。與此同時LY294002 對HSC 增殖的抑制作用仍持續(xù)存在，故我們推測當(dāng)PI3K/Akt信號通路被阻斷后，活性維生素D促HSC凋亡的作用被激活，同時增強(qiáng)了LY294002作用的敏感性，活性維生素D協(xié)同LY294002對HSC 的增殖抑制作用，并共同延緩肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展，但其具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。因此，我們認(rèn)為維生素D抗纖維化治療的開展，不僅是活性維生素D單一作用的結(jié)果，可能是通過參與調(diào)控PI3K /Akt 信號通路，為今后維生素D抗肝纖維化治療指出了新方向。

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（收稿：2015-09-02）

（本文編輯：陳從新）

Inhibitory and apoptotic effect of LY 294002in combination with 1，25-dihydroxyvitamin D3 on HSC T6 cells in vitro

Wang Lei，Li Xiaotian，Zhang Li,et al.Chengde Medical College,
Department of Gastroenterology，Affiliated Hospital,Hebei Engineering University，Handan 056000,Hebei Province,China

Objective To invastigate the anti-proliferating and apoptotic effect of LY294002 and 1，25-dihydroxyvitamin D3（1，25-（OH）2D3）on hepatic stellate（HSC-T6）cells in vitro.Methods The HSC-T6 cells were divided into five groups,e.g.control,DMSO,1,25-（OH）2D3,LY294002 and 1,25-（OH）2D3 plus LY294002. The inhibitory effects were detected by MTT assay;The cell morphology was observed under microscopy;The apoptosis was detected by FCM,and the expression of Ser473,AKT and caspase-3 protein were assayed by Western blotting.Results The inhibitory rate in 1,25-（OH）2D3 plus LY294002 group was 87.5%，much higher than 50.3%in 1，25-（OH）2D3 or 40.3%in LY294002 group（P<0.05）after 48 h intervention；the apoptotic rate in 1,25-（OH）2D3 plus LY294002 group was 92.12%，much higher than 71.0%in 1，25-(OH）2D3 or 34.0%in LY294002-intervented group（P<0.05）；the ratio of Bax/Bcl-2 increased(P<0.05），and the expression of caspase-3 also increased obviously in 1,25-（OH）2D3 plus LY294002 group(P<0.05）.Conclusion LY294002 has an antifibrotic effect with the assistance of 1，25-（OH）2D3 on T6 cells in vitro.

T6 cells;LY294002;1，25-dihydroxyvitamin D3;Cell apoptosis；PI3 K/Akt signal pathway

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.02.006

河北省衛(wèi)生廳重點(diǎn)科技研究計劃項目（編號：20150490）

056000 河北省邯鄲市承德醫(yī)學(xué)院研究生院（王蕾）；河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院（李校天，張利，張九娜）第一作者：王蕾，女，26歲，碩士研究生。研究方向：慢性肝病的防治研究。E-mail: wangleiguantao@163.com

李校天，E-mail:xtianli@sina.com