王招弟，吳好葉，嚴(yán)莉婭，姜玉瑤，牟滕慧，曾智勇，代振江

(貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

豬圓環(huán)病毒2型 GZ-ZYSY株全基因組的克隆與序列分析

王招弟，吳好葉，嚴(yán)莉婭，姜玉瑤，牟滕慧，曾智勇*，代振江

(貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）是目前嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的疾病之一，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。崔亞蘭等對(duì)2007—2011年收集的4 980份貴州各地區(qū)豬只血清樣品進(jìn)行PCV2抗體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)陽性率為43.45%，且呈逐年上升趨勢(shì)，對(duì)2011年收集的133份豬組織樣品進(jìn)行了PCV2病原核酸檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其陽性率高達(dá)77.44%，說明PCV2在貴州省廣泛流行且日益嚴(yán)重[2]。為豐富貴州PCV2全基因組序列庫，了解貴州地區(qū)PCV2遺傳變異情況，本研究從PCV2抗體檢測(cè)為陽性的血清中克隆測(cè)序了一株P(guān)CV2全基因組序列，命名為GZ-ZYSY，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。

1 材料與方法

1.1 血清、質(zhì)粒

血清系貴州遵義綏陽某豬場(chǎng)送檢，PMD19-T Vector購自寶生物工程（大連）有限公司，大腸桿菌感受態(tài)TOP10由中國(guó)獸藥監(jiān)察所惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑

核酸提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ，LA Taq聚合酶，DNA DL2000 Marker等購自寶生物工程（大連）有限公司；E. Z. N. A.TM Gel Extraction Kit (50) 膠回收試劑盒購自美國(guó)Omega公司；普通質(zhì)粒微量提取試劑盒購自TIANGE公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GeneBank公布的PCV2序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增PCV2全基因組序列且攜帶酶切位點(diǎn)的引物，引物序列如表1所示：

表1 本研究中所使用的引物

1.4 PCV2全基因組的擴(kuò)增

用核酸提取試劑盒提取送檢血清的混合核酸，以其為模板，用設(shè)計(jì)的引物對(duì)PCV2全基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系和條件如下：模板8μL，dNTP 8μL，10×LA Buffer 5μL，LA Taq酶1μL，上下游引物各2μL，ddH2O 12μL。條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.5 目的基因的克隆和測(cè)序

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，90 V，40 min，用膠回收試劑盒回收純化目的條帶，將回收產(chǎn)物連接至PMD19-T，轉(zhuǎn)化至TOP10大腸桿菌，涂板培育，挑取陽性菌落，抽提質(zhì)粒，進(jìn)行HindⅢ和BamHⅠ雙酶切與質(zhì)粒PCR鑒定，將鑒定為陽性的質(zhì)粒送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 PCV2全基因組序列的生物信息學(xué)分析

用DNAStar對(duì)擴(kuò)增的PCV2全基因組序列和GeneBank公布的目前市面上流行的主要PCV2疫苗株DBN-SX07-2（HM641752.1）、LG（HM038034.1）、SH（HM038027.1）、ZJ（AY686764.1）進(jìn)行相似性分析。

2 結(jié)果

2.1 PCV2全基因組序列的擴(kuò)增

以從血清中提取的混合核酸為模板，用設(shè)計(jì)的引物對(duì)PCV2全基因組序列進(jìn)行擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，顯示目的條帶為1 800 bp左右，與預(yù)期大小相符。電泳結(jié)果如圖1。

2.2 PCV2全基因組序列相似性分析

根據(jù)2008年歐盟豬圓環(huán)病毒疾病委員會(huì)提出的PCV2分型標(biāo)準(zhǔn)可知[3]，GZ-ZYSY株屬于PCV2a型，將GZZYSY株氨基酸序列與目前市面上流行的主要PCV2疫苗株DBN-SX07-2（HM641752.1）、LG（HM038034.1）、SH（HM038027.1）、ZJ（AY686764.1）進(jìn)行相似性比較，結(jié)果如圖2所示，各疫苗株中與GZ-ZYSY株相似性最高的是DBN-SX07-2（HM641752.1） 疫苗株，相似性為93.2%。多重比對(duì)結(jié)果如圖3所示，GZ-ZYSY株與4株疫苗株的ORF2氨基酸序列相比存在23個(gè)氨基酸的差異。

圖1 PCV2全基因組PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 GY-ZYSY株與疫苗株的氨基酸序列的相似性比較

圖3 GY-ZYSY株與疫苗株ORF2氨基酸序列的多重比對(duì)

3 討論

本文從PCV2抗體陽性的血清中擴(kuò)增獲得了一株P(guān)CV2全基因組序列，序列分析發(fā)現(xiàn)其為PCV2a型，由此推測(cè)是否PCV2a型較PCV2其他基因型更能維持較長(zhǎng)的病毒血癥時(shí)間。氨基酸序列的相似性分析發(fā)現(xiàn)，GZ-ZYSY株與市面上流行的疫苗株中相似性最高的是DBN-SX07-2（HM641752.1）疫苗株，相似性為93.2%，各疫苗株之間的相似性在92%～99.7%之間。氨基酸序列多重比對(duì)發(fā)現(xiàn)GZ-ZYSY株與各疫苗株的ORF2之間存在23個(gè)氨基酸的差異，這些氨基酸差異是否會(huì)導(dǎo)致其與疫苗株之間抗原出現(xiàn)較大差異有待進(jìn)一步研究。本研究豐富了貴州地區(qū)PCV2的基因組序列庫，對(duì)貴州PCV2的防控提供了一定參考。

[1] 李玲，李國(guó)新，周艷君，等. 2008—2011年中國(guó)部分地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型的分子流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2012（2）：1-10.

[2] 崔亞蘭，王開功，張華，等. 2007—2011年貴州省豬圓環(huán)病毒感染的流行病學(xué)調(diào)查[J]. 畜牧與獸醫(yī)，2013，45（3）：70-73.

[3] CORTEY M，OLVERA A，GRAUROMA L， et al. Further comments on porcine circovirus type 2 ( PCV2) genotype definition and nomenclature[J].Vet Microbiol， 2011，149：522-523.

2016-09-14)

省校合作計(jì)劃項(xiàng)目, 黔科合LH字[2014]7670號(hào)

王招娣（1993—），女，在讀學(xué)士，研究方向：動(dòng)物傳染病病原分子生物學(xué)。

曾智勇（1978—），男，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事動(dòng)物傳染病病原分子生物學(xué)研究