徐 國(guó)，曾智勇＊，代振江，葉百川

(貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

豬食道口線蟲(chóng)與豬圓環(huán)病毒2型混合感染的診斷

徐 國(guó)，曾智勇＊，代振江，葉百川

(貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

食道口線蟲(chóng)病是由盅口科、食道口屬的線蟲(chóng)寄生于反芻家畜和豬的大腸所引起的一類線蟲(chóng)病，由于某些種類的食道口線蟲(chóng)的幼蟲(chóng)可在寄生部位的腸壁上形成結(jié)節(jié)，故又稱為結(jié)節(jié)蟲(chóng)病[1]。重度感染食道口線蟲(chóng)幼蟲(chóng)可使仔豬發(fā)生持續(xù)性腹瀉，糞便呈暗綠色，含有多量黏液，有時(shí)帶血，嚴(yán)重時(shí)引起死亡；慢性病例患畜則表現(xiàn)為便秘和腹瀉交替發(fā)生，漸進(jìn)性消瘦，最后可因機(jī)體衰竭而死亡。豬圓環(huán)病毒病感染是指由豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus ，PCV) 引起的豬的一種新的傳染病，其主要臨床癥狀特征為母豬繁殖障礙、體質(zhì)下降、消瘦、呼吸困難、貧血、黃疸、生長(zhǎng)發(fā)育不良、腹瀉、內(nèi)臟器官及皮膚的廣泛病理變化，特別是腎、脾臟及全身淋巴結(jié)的高度腫大、出血和壞死[2]。PCV分PCV1和PCV2兩個(gè)血清型，PCV2危害極大。豬圓環(huán)病毒自2000年由郎洪武等[3]在國(guó)內(nèi)首次報(bào)道以來(lái)，全國(guó)各?。ㄊ校┫群笥蠵CV2 感染病例報(bào)道 。豬圓環(huán)病毒病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大危害。

2016年6月貴州省遵義市某種豬場(chǎng)發(fā)生一起豬嚴(yán)重腹瀉導(dǎo)致豬只死亡的病例。筆者通過(guò)豬場(chǎng)工作人員對(duì)豬場(chǎng)飼養(yǎng)情況、免疫程序以及病死豬的臨床癥狀進(jìn)行了解后開(kāi)展了相關(guān)檢測(cè)，報(bào)道如下。

1 材料

1.1 病料

病死豬一頭。

1.2 主要試劑

TakaRa Mini BEST Viral RNA/ DNA Extraction Kit Ver 4.0、Prime Script One Step RTPCR Kit Ver.2.0、DL2000；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 流行病學(xué)調(diào)查與臨床癥狀

通過(guò)豬場(chǎng)工作人員對(duì)豬場(chǎng)飼養(yǎng)情況、免疫程序以及病死豬的臨床癥狀進(jìn)行了解并記錄。

2.2 解剖病變觀察

對(duì)病死豬進(jìn)行剖檢，沿腹白線切開(kāi)，觀察宿主腸道及其他組織器官病理變化，剖解腸道進(jìn)行蟲(chóng)體采集。

2.3 病原核酸檢測(cè)

2.3 .1 病料的處理及核酸的提取

采集送檢病死豬組織混合樣品，碾磨勻漿，反復(fù)凍融3次之后，12 000 r/min離心10 min，取上清，用 TakaRa Mini BEST Viral RNA/ DNA Extraction Kit Ver 4.0試劑盒提取核酸。

2.3.2 引物合成

相關(guān)引物為由本實(shí)驗(yàn)室所保存的參考GenBank中關(guān)于CSFV(豬瘟病毒)、PCV2和PRRSV(豬繁殖與呼吸綜合征病毒)序列設(shè)計(jì)并合成的特異性引物[4]。

2.3.3 病原檢測(cè)

參照一步法RT-PCR試劑盒說(shuō)明 書(shū)， 對(duì)CSFV、PCV2和PRRSV進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)總體系為50 μL ：2×1 Step Buffer 25 μL， 模板7.0 μL，上下游引物各1.0 μL，Prime Script 1 Step Enzyme Mix 2 μ L，Release Free H2O 14 μL；反應(yīng)條件均為：50 ℃ 40 min； 95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

3 結(jié)果

3.1 流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果與臨床癥狀

該豬場(chǎng)存欄生豬300頭左右，已對(duì)CS、PRRS、PR和FMD進(jìn)行了普免，未曾免疫PCV2。據(jù)述，該豬場(chǎng)仔豬少數(shù)4～5 d，多數(shù)斷奶后開(kāi)始腹瀉，糞便呈暗綠色，含有多量豁液，持續(xù)性腹瀉，消瘦，生長(zhǎng)遲緩，抗生素治療無(wú)效，病程長(zhǎng)的發(fā)病10 d后才死亡，吻突兩邊有黑色痂塊。

3.2 解剖病變觀察結(jié)果

解剖后可見(jiàn)脾臟柔軟、邊緣銳薄，肺臟表面塌陷；結(jié)腸可見(jiàn)大量白色米粒大小的結(jié)節(jié)；腸系膜淋巴結(jié)腫大、出血；剖解腸道采集到了結(jié)節(jié)蟲(chóng)蟲(chóng)體；其余臟器未見(jiàn)明顯病理變化（見(jiàn)圖1）。

3.3 病原核酸檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)對(duì)送檢樣品進(jìn)行病原核酸檢測(cè)（見(jiàn)圖2）。電泳結(jié)果顯示，CSFV和PRRSV的檢測(cè)結(jié)果均為陰性；PCV2檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，擴(kuò)增條帶與預(yù)期的1767 bp擴(kuò)增片段相符，表明送檢病死豬存在PCV2感染。

4 小結(jié)

結(jié)合臨床解剖特征及病原檢測(cè)結(jié)果可知，送檢病死豬存在豬食道口線蟲(chóng)和豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）混合感染。臨床腹瀉可能與PCV2引起的多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）和寄生蟲(chóng)感染均有一定關(guān)系，其中與豬結(jié)節(jié)蟲(chóng)的感染關(guān)系更為密切。食道口線蟲(chóng)幼蟲(chóng)在大腸黏膜下形成結(jié)節(jié)所致的危害最大，形成結(jié)節(jié)的幼蟲(chóng)周?chē)l(fā)生局部性炎癥，當(dāng)繼發(fā)細(xì)菌感染時(shí)，則發(fā)生化膿性結(jié)節(jié)性大腸炎。因此，建議一方面要加強(qiáng)豬群的基礎(chǔ)免疫，做好免疫效果及時(shí)監(jiān)測(cè)；另一方面要注重加強(qiáng)豬場(chǎng)養(yǎng)殖環(huán)境衛(wèi)生及消毒和驅(qū)蟲(chóng)。抓好母豬配種前、產(chǎn)仔前、哺乳仔豬和保育豬四個(gè)階段的驅(qū)蟲(chóng)。每個(gè)階段內(nèi)服伊維菌素或阿維菌素，每千克體重0.3 mg（或按廠家產(chǎn)品推薦劑量），連服5～7 d。

圖1 解剖病變結(jié)果

[1] 楊 光 友.動(dòng) 物 寄 生 蟲(chóng) 病 學(xué)[M].3版.成都：四川科學(xué)技術(shù)出版社，2009.1(2013.2年重印)：158.

[2] 陳溥言.獸醫(yī)傳染病學(xué)[M].5版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2006.8(2014.6重印)：231.

[3] 郎洪武，張廣川，吳發(fā)權(quán)，等. 斷奶豬多系統(tǒng)衰弱綜合征血清抗體檢測(cè)[J].中國(guó)獸醫(yī)科技，2000（3）：3-5.

[4] ZENG Z， LIU Z， WANG W， et al. Establishment and application of a multiplex PCR for rapid and simultaneous detection of six viruses in swine[J]. Journal of Virological Methods， 2014， 208：102 106.

2016-09-20）

圖2 病原檢測(cè)結(jié)果

M：DL2000 Maker ；1：CSFV檢測(cè)結(jié)果，陰性；2：PCV2檢測(cè)結(jié)果，陽(yáng)性 ；3：PRRSV檢測(cè)結(jié)果，陰性

省校合作計(jì)劃項(xiàng)目, 黔科合LH字[2014]7670號(hào)

徐國(guó)（1988—），男，在讀碩士，研究方向：動(dòng)物傳染病病原分子生物學(xué)

曾智勇（1978—），男，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事動(dòng)物傳染病病原分子生物學(xué)研究