陳曉鳳，黃鳳蘭*，趙 永，姜桐桐，李佳會(huì)，周婷婷，常旭豐，劉佳琪

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028000；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古通遼 028000；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)蓖麻育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古通遼 028000)

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cDNA-AFLP分析不同發(fā)育時(shí)期蓖麻種子脂肪酸差異基因表達(dá)的關(guān)鍵技術(shù)

陳曉鳳1，2，3，黃鳳蘭1，2，3*，趙 永1，2，3，姜桐桐1，2，3，李佳會(huì)1，2，周婷婷1，常旭豐1，劉佳琪1

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028000；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古通遼 028000；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)蓖麻育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古通遼 028000)

摘要在介紹cDNA-AFLP技術(shù)原理與操作步驟的基礎(chǔ)上，分析了應(yīng)用cDNA-AFLP分子標(biāo)記技術(shù)分析蓖麻種子脂肪酸含量差異基因表達(dá)過程中的主要影響因素，以期為后續(xù)利用該標(biāo)記技術(shù)分析不同發(fā)育時(shí)期蓖麻種子脂肪酸含量的差異表達(dá)提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞cDNA-AFLP；蓖麻；差異基因表達(dá)

cDNA-AFLP Analysis of Key Technique on Various Gene Expressions of Different Developmental Time Castor Seed Fatty Acid

CHEN Xiao-feng1,2,3, HUANG Feng-lan1,2,3*, ZHAO Yong1,2,3et al

(1. College of Life Science, Inner Mongolia University for the Nationalities, Tongliao, Inner Mongolia 028000; 2. The Inner Mongolia Autonomous Region University Castor Industry Technology Research Center, Tongliao, Inner Mongolia 028000; 3. Inner Mongolia Key Laboratory of Castor Breeding,Tongliao, Inner Mongolia 028000)

AbstractBased on introducing principle and operation steps of cDNA-AFLP technology, the key influencing factors of using cDNA-AFLP molecular marker technology in gene expression research process of different fatty acid content in castor seed were analyzed, so as to provide technical support for subsequent researches on using this molecular maker technology in anslysis of different fatty acid content in different developmental time castor seed.

Key wordscDNA-AFLP; Castor; Differential gene expression

蓖麻(Ricinusconununis)為大戟科蓖麻屬雙子葉植物，是一種重要的油料作物[1]，其適應(yīng)范圍廣，綜合利用價(jià)值高，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、機(jī)械、航空航天等行業(yè)。蓖麻種子脂肪酸含量較高，種仁中油脂含量高達(dá)60%～70%，提高種子含油率具有重要的實(shí)踐意義[2-6]。

cDNA-AFLP技術(shù)是基于AFLP技術(shù)建立起來的，與RT-PCR技術(shù)結(jié)合后用于分析mRNA表達(dá)情況，具有靈敏性高、假陽性率低等優(yōu)點(diǎn)，可顯著標(biāo)注基因差異表達(dá)，最大限度地提供基因編碼區(qū)不同性狀的差異信息。因此，掌握該技術(shù)的原理和實(shí)際操作過程中的關(guān)鍵步驟，有助于研究蓖麻種子脂肪酸含量的差異表達(dá)。筆者介紹了應(yīng)用cDNA-AFLP分子標(biāo)記技術(shù)分析蓖麻種子脂肪酸差異基因表達(dá)研究過程中的主要影響因素，以期為后續(xù)利用該標(biāo)記技術(shù)分析不同發(fā)育時(shí)期蓖麻種子脂肪酸含量的差異表達(dá)提供技術(shù)支持。

1cDNA-AFLP技術(shù)原理與操作步驟

AFLP標(biāo)記技術(shù)是一種限制性選擇PCR擴(kuò)增基因片段的方法，即建立mRNA差異顯示技術(shù)。高等生物成熟時(shí)，mRNA具有特異的polyA結(jié)構(gòu)特征，分離、純化mRNA后與專一的錨定引物反轉(zhuǎn)錄cDNA，再結(jié)合AFLP技術(shù)對(duì)其進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，以達(dá)到差異基因的分離[7]。mRNA差異顯示技術(shù)不僅保留了AFLP技術(shù)的諸多優(yōu)點(diǎn)，且具有重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高、效率更加顯著等優(yōu)點(diǎn)，可對(duì)生物體轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行更加全面、系統(tǒng)的分析，能反映基因間表達(dá)量的差異[8]。根據(jù)起始材料的不同分為DNA-AFLP、cDNA-AFLP。cDNA-AFLP技術(shù)已成功用于分析特異表達(dá)基因雜種優(yōu)勢(shì)遺傳機(jī)理的研究、表達(dá)基因的遺傳連鎖作圖、基因功能標(biāo)記分析、基因表達(dá)特性研究等方面[9-10]。

cDNA-AFLP技術(shù)第一步是獲得高質(zhì)量的試驗(yàn)材料，第二步是利用雙高頻限制性內(nèi)切酶酶切基因組或RNA，第三步是酶切產(chǎn)物與人工合成特定序列的雙鏈接頭連接，第四步是以加錨2～3個(gè)特異選擇性堿基的引物對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行選擇性PCR擴(kuò)增，最后一步是電泳分離差異表達(dá)基因。在整個(gè)研究過程中，所加錨的堿基種類、數(shù)目或順序決定了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，僅有接頭側(cè)翼堿基與所加錨的幾個(gè)選擇性堿基相匹配的基因片段，才符合被擴(kuò)增要求，根據(jù)該特點(diǎn)可設(shè)計(jì)特異性引物，能最大程度地滿足試驗(yàn)要求(圖1)。

圖1　cDNA-AFLP技術(shù)流程Fig.1　The technical process of cDNA-AFLP

2cDNA-AFLP技術(shù)分析不同發(fā)育時(shí)期蓖麻種子脂肪酸差異基因表達(dá)的操作要點(diǎn)

2.1蓖麻種子總RNA的提取高質(zhì)量總RNA的提取以及其完整性，是該試驗(yàn)的關(guān)鍵性問題之一。實(shí)驗(yàn)室常用的提取方法有CTAB法和TRIZOL法。但這2種方法在提取過程中常導(dǎo)致RNA中出現(xiàn)雜質(zhì)而降低純度。不同發(fā)育時(shí)期蓖麻種子脂肪酸差異基因表達(dá)研究中使用北京莊盟公司生產(chǎn)的植物總RNA提取試劑盒，是廣譜型RNA提取試劑盒，該試劑盒克服了上述缺點(diǎn)，具有成本較低、操作快速、提取時(shí)分層及顏色對(duì)比明顯的特點(diǎn)，且不易受多糖、酚類等物質(zhì)的影響，保證了RNA的完整性及純度(圖2)。

圖2　植物總RNA提取試劑盒提取蓖麻種子總RNAFig.2　Total RNA of castor seed extracted by plant total RNA extraction kit

2.2cDNA合成質(zhì)量與雙酶切對(duì)擴(kuò)增效果的影響cDNA合成過程中，由于多糖、酚、酮類化合物的存在，或是頻繁過度的高速離心等操作過程都會(huì)導(dǎo)致一些遺傳序列信息的丟失；也有可能是轉(zhuǎn)錄過程中并不是全部的表達(dá)信息進(jìn)行翻譯，造成部分低豐度基因的損失。該研究雙鏈cDNA的合成采用的是TaKaRa的合成體系，可獲得高質(zhì)量、高濃度的片段，降低了因基因丟失對(duì)下一步試驗(yàn)的影響。

cDNA-AFLP技術(shù)中，雙內(nèi)切酶組合的選擇至關(guān)重要，一般采用雙酶切組合，且其組合應(yīng)最大限度地覆蓋基因池，酶切時(shí)間要適中，連接酶要高效，產(chǎn)物片段能夠順利地與接頭進(jìn)行連接，避免酶切片段間自連而產(chǎn)生假象，保證酶切完全、徹底(圖3)。

圖3　cDNA酶切結(jié)果Fig.3　The result of restriction enzyme digestion of cDNA

2.3cDNA-AFLP技術(shù)兩步PCR擴(kuò)增擴(kuò)增引物的選擇是PCR成功的關(guān)鍵，也是cDNA-AFLP技術(shù)整個(gè)試驗(yàn)過程成敗的關(guān)鍵因素之一，引物長(zhǎng)度在15～20 bp大小為宜，引物3′端選擇性堿基數(shù)目、種類決定擴(kuò)增的特異性。而選擇性堿基的G、C含量對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)目也有影響，G+C含量在40%～60%為宜，尤其引物內(nèi)部在3′端最好不產(chǎn)生二級(jí)結(jié)構(gòu)。

在PCR擴(kuò)增體系和程序中，模板濃度對(duì)體系穩(wěn)定性影響較大，合適的稀釋倍數(shù)是擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。稀釋倍數(shù)較小，引物或dNTP會(huì)很快被耗盡，遺傳信息不能夠得到完全復(fù)制，影響其完整性，且在電泳時(shí)會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象；稀釋倍數(shù)過大，低濃度的模板會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增效果不明顯甚至難以檢測(cè)到，電泳中未見條帶或者條帶模糊不清，從而造成遺傳信息丟失，不利于后續(xù)試驗(yàn)對(duì)基因差異的檢測(cè)、分離。

2.4cDNA-AFLP反應(yīng)體系、反應(yīng)程序的優(yōu)化分別對(duì)種子總RNA的提取、雙酶切時(shí)間、預(yù)擴(kuò)增、選擇性擴(kuò)增及聚丙烯酰胺凝膠電泳條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了適于分析蓖麻種子中脂肪酸含量差異基因表達(dá)的cDNA-AFLP技術(shù)體系。第一，RNA的提取必須在無菌環(huán)境即超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，操作人員須佩戴口罩，防止口腔內(nèi)各種酶干擾提取過程，操作過程中盡可能減少人員流動(dòng)；第二，因該研究對(duì)雙酶切的要求是同時(shí)具有2個(gè)必要的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，因此對(duì)于酶的選擇至關(guān)重要，MseI/EcoRI的酶切組合均是高頻限制性的，可最大可能地覆蓋基因片段，產(chǎn)生更廣的酶切結(jié)果，有利于后續(xù)擴(kuò)增得到更多更特異性的基因；第三，預(yù)擴(kuò)增、選擇性擴(kuò)增是得到差異片段的中間環(huán)節(jié)，因此，最合適的體系與程序相結(jié)合很關(guān)鍵，利用五五均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化，得到最佳的反應(yīng)程序與體系；第四，分離差異基因的最后一步是聚丙烯酰胺凝膠電泳，該步驟耗時(shí)較長(zhǎng)，整個(gè)試驗(yàn)過程的費(fèi)用較高，因此要注意凝膠時(shí)間、電壓大小和時(shí)間長(zhǎng)短、銀染程度等因素。

圖4　cDNA-AFLP分析蓖麻種子脂肪酸差異表達(dá)基因的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果Fig.4　cDNA-AFLP analysis of polyacrylamdide gel of various gene expressions of castor seed fatty acid

2.5聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳過程中，膠體的凝聚程度，電泳的電壓大小、時(shí)間長(zhǎng)短，染液的濃度，固定、銀染、顯影的時(shí)間以及顯色程度等都能夠影響差異基因的篩選。親和硅烷和剝離硅烷的滴加量要適當(dāng)，當(dāng)聚丙烯酰胺凝膠凝聚不完全或凝聚過久，會(huì)在剝離膠板時(shí)出現(xiàn)破碎等現(xiàn)象；電壓過高會(huì)使條帶不明亮、基因信息跑出膠板導(dǎo)致丟失，電壓過低則會(huì)導(dǎo)致電泳時(shí)間過長(zhǎng)從而分離效果不明顯，所需基因信息降解以致于不能得到完全分離；銀染全過

程必須使用ddH2O，否則混雜的其他離子會(huì)嚴(yán)重影響銀離子染色及顯色效果；顯色液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，顯色時(shí)必須加甲醛且不能提前加。cDNA-AFLP分析蓖麻種子脂肪酸差異表達(dá)基因的聚丙烯酰胺凝膠電泳效果見圖4。

3展望

cDNA- AFLP技術(shù)反應(yīng)條件雖然嚴(yán)謹(jǐn)，但卻能集中顯示基因組表達(dá)序列的多態(tài)性差異，對(duì)mRNA的轉(zhuǎn)錄均等擴(kuò)增，可有效地找到目的基因。研究轉(zhuǎn)錄水平基因表達(dá)的目的之一是分離該基因并進(jìn)一步研究該基因的功能和對(duì)生物個(gè)體發(fā)育的影響，cDNA-AFLP 和dd-PCR的結(jié)合更適合差異基因的分離，已逐漸成為基因表達(dá)模式研究的有效手段之一，也是研究功能基因組的新方法、新手段，并已顯示出巨大的應(yīng)用潛能。cDNA-AFLP技術(shù)必將在全面了解基因表達(dá)和后基因組計(jì)劃中發(fā)揮巨大作用。

參考文獻(xiàn)

[1] 鄭鷺，祁建民，陳紹，等.蓖麻遺傳育種進(jìn)展及其在生物能源與醫(yī)藥綜合利用潛勢(shì)[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，22(9)：109-113.

[2] 虢婷婷，劉祥華，邢超，等.蓖麻栽培品種的遺傳多樣性及蓖麻籽脂肪酸組分分析[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2012(4)：373-376.

[3] 于秋馥.白城市蓖麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及對(duì)策研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010(23)：365-369.

[4] 潘國才，丁愛華.蓖麻的綜合利用現(xiàn)狀[J].農(nóng)業(yè)科技與裝備，2009(1)：1-2，5.

[5] 張興泉.淺析蓖麻的作用及高產(chǎn)栽培技術(shù)[J].吉林農(nóng)業(yè)，2010(9)：108.

[6]卜書海，鄭雪莉，王云果.小鼠飼糧添加脫毒蓖麻餅粕的飼喂效果試驗(yàn)[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2007(3)：61-62.

[7] BISHOP G J，HARRISON K，JONES J D G.The tomato Dwarf gene isolated by heterologous transposon tagging encodes the first member of a new cytochrome P450 family[J].Plant cell， 1996，8：959-969.

[8] 嵇怡，繆珉，陳學(xué)好.植物矮生性狀的分子遺傳研究進(jìn)展[J].分子植物育種，2006，6(4)：753-771.

[9] DONSON J，F(xiàn)ANG Y，ESPIRITU-SANTO G，et al.Comprehensive geneexpression analysis by transcript profiling [J].Plant molecular biology，2002，48：75-97.

[10] GABRIELS S H，TAKKEN F L，VOSSEN J H，et al.cDNA-AFLP combined with functional analysis reveals novel genes in-volved in the hypersensitive response[J].Molecular plant microbe interaction，2006，19(6)：567-576.

中圖分類號(hào)S 188

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)06-177-02

收稿日期2016-01-28

作者簡(jiǎn)介陳曉鳳(1990- )，女，內(nèi)蒙古赤峰人，碩士研究生，研究方向：蓖麻分子育種。*通訊作者，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事蓖麻分子育種研究。

基金項(xiàng)目?jī)?nèi)蒙古民族大學(xué)研究生科研資助項(xiàng)目(NMDSS1467)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30760123，31160290，31460353)；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?！扒嗄昕萍加⒉胖С钟?jì)劃”(NJYT-14-A10)；內(nèi)蒙古自治區(qū)科技創(chuàng)新引導(dǎo)項(xiàng)目；內(nèi)蒙古自治區(qū)“草原英才” 計(jì)劃項(xiàng)目；市校合作項(xiàng)目(SXZD2012018，SXZD2012017，SXZD2012006)。