張 坤，林 茂， 李忠琴*， 劉宏偉，熊 靜， 賴曉健

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建廈門 361021；2.鰻魚現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)農(nóng)業(yè)部工程研究中心，福建廈門 361021)

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石榴皮有效抑菌部位萃取工藝的比較分析

張 坤1，2，林 茂1，2， 李忠琴1，2*， 劉宏偉1，2，熊 靜1，2， 賴曉健1，2

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建廈門 361021；2.鰻魚現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)農(nóng)業(yè)部工程研究中心，福建廈門 361021)

摘要[目的]優(yōu)化石榴皮有效抑菌部位的萃取工藝。[方法]采用超聲輔助萃取法，選取純水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷6種溶劑萃取石榴皮抑菌藥液。通過瓊脂平板法測定石榴皮抑菌藥液對9株水產(chǎn)常見致病菌的最低抑菌濃度，正交試驗方法考察溶劑濃度、料液比、溫度、超聲時間對抑菌率的影響，進(jìn)一步優(yōu)化石榴皮抑菌藥液的萃取工藝。[結(jié)果]比較不同溶劑抑菌效果，表明乙醇為最佳萃取溶劑，其萃取部位平均最低抑菌濃度為0.517 mg/mL。在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶20 g/mL、萃取溫度60 ℃、超聲時間40 min的最佳萃取工藝條件下，萃取藥液平均最低抑菌濃度為0.442 mg/mL。[結(jié)論]研究可為石榴皮在水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌性疾病防控中的應(yīng)用和石榴皮抗菌劑的研制及工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞石榴皮；超聲輔助萃?。灰志?；正交試驗

Comparative Analysis of the Extraction Technology of Effective Antibacterial Ingredients from Pomegranate Rind

ZHANG Kun1，2，LIN Mao1，2，LI Zhong-qin1，2*et al

(1.College of Fisheries，Jimei University，Xiamen，F(xiàn)ujian 361021; 2.Engineering Research Center of the Modern Industry Technology for Eel，Ministry of Agriculture，Xiamen，F(xiàn)ujian 361021)

Abstract[Objective] To optimize the extraction technology of antibacterial ingredients from pomegranate rind.[Method] Six kinds of solvents (water，methanol，ethanol，acetone，ethyl acetate and n-hexane) were used to extract antibacterial ingredients from pomegranate rind.The minimal inhibitory concentrations (MIC) of nine common strains of main aquatic pathogenic bacteria were tested by agar dilution method.The orthogonal experimental was designed to research the effects of solvent concentration，solid-liquid ratio，ultrasonic temperature and ultrasonic time on antibacterial rate.Extraction technology of antibacterial ingredients from pomegranate rind was further optimized.[Result] By comparing with the antibacterial effects of different solvents，ethanol was chosen as the best extraction solvent and the average minimum inhibitory concentration was 0.517 mg/mL.The optimal extraction technology was 70% ethanol concentration，1∶20 g/mL solid-liquid ratio，60 ℃ extraction temperature and 40 min ultrasonic time.Under this condition，the minimum inhibitory concentration was 0.442 mg/mL.[Conclusion] This research provides theoretical basis for the application of pomegranate rind in bacterial disease prevention and control of aquaculture and for the development and industrialized production of pomegranate rind antibacterial agent.

Key wordsPomegranate rind; Ultrasonic-assisted extraction; Antibacteria; Orthogonal test

隨著水產(chǎn)高密度養(yǎng)殖的迅猛發(fā)展，養(yǎng)殖病害的發(fā)生率越來越高，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展造成嚴(yán)重威脅。細(xì)菌性疾病由于發(fā)病快、感染率高，是養(yǎng)殖魚類中最常見的一類疾病[1]。長期使用抗菌化學(xué)藥物會給養(yǎng)殖環(huán)境和水產(chǎn)品帶來重大安全隱患，結(jié)合我國實際，采用中藥進(jìn)行魚類細(xì)菌性疾病防控的研究具有廣闊的應(yīng)用前景[1]。石榴皮所含的化學(xué)成分，如黃酮類[2]、生物堿類[3]、有機(jī)酸類、鞣質(zhì)類[4]、石榴多酚[5]等，均具有抗菌[6]、抗氧化[7]、抗衰老[7]等生理和藥理活性，對綠膿桿菌[8]、溶血鏈球菌[9]、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和志賀痢疾桿菌等致病菌具有很好的抑制作用。但是中藥在漁藥中的運(yùn)用由于缺乏提取工藝研究而受到一定限制。超聲波萃取法是利用超聲波輻射產(chǎn)生強(qiáng)烈的空化效應(yīng)、機(jī)械振動、擾動效應(yīng)、高的加速度、乳化、擴(kuò)散、擊碎和攪拌等多種作用，加快物質(zhì)分子運(yùn)動的頻率和速度、增大溶劑的穿透力，加速了目標(biāo)成分進(jìn)入溶劑。與傳統(tǒng)萃取方法相比，超聲波萃取法具有溶劑用量少、萃取時間短、萃取率高[10]、不影響有效成分活性、不改變萃取有效成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)，大大提高了萃取效率[11]。筆者擬利用超聲波萃取法比較不同溶劑萃取石榴皮有效抑菌藥液，優(yōu)化超聲萃取的條件，以期為水產(chǎn)養(yǎng)殖用抗菌劑的研制和實際生產(chǎn)應(yīng)用提供科學(xué)的試驗數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株。9株致病菌均為鰻魚現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)農(nóng)業(yè)部工程研究中心近年從漳浦、莆田、同安、集美等養(yǎng)殖場病鰻中分離得到，并經(jīng)過人工感染試驗證實為致病菌，其中Sh2-8為枸櫞酸桿菌，Sh2-9為鼠疫耶爾森菌，Sh2-11為魯克耶爾森菌，B10為嗜水氣單胞菌，B36為遲緩愛德華菌，G1-6為奇異變形菌，F(xiàn)3-4為舒伯特氣單胞菌，F(xiàn)J0507為創(chuàng)傷弧菌，Sh1為類志賀鄰單胞菌。

1.1.2藥材與主要試劑。石榴皮，產(chǎn)地甘肅；MH肉湯，山東青海高科園海博生物技術(shù)有限公司；氫氧化鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂粉，廣東環(huán)凱微生物科技公司。

1.1.3主要儀器。中草藥粉碎機(jī)(FW177型)，天津市泰斯特儀器有限公司；超凈工作臺(AIRTECH型)，天津鈞星瑞科技有限公司；高壓滅菌鍋(高壓滅菌GI54DS型)，AUTOCLAVE；超聲破碎儀(KQ-300TDE型)，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1藥材的粉碎與超聲波萃取。將石榴皮用中草藥粉碎機(jī)粉碎，用200目的篩網(wǎng)過濾，收集過篩后的超微藥粉，備用。根據(jù)下列Ⅰ～Ⅳ方案配制單溶劑萃取溶劑[11]，再根據(jù)Ⅴ、Ⅵ 2種方案配制雙水相萃取溶劑，浸泡30 min，然后在超聲萃取儀下萃取60 min，條件為變幅桿6 mm，超聲功率720 W，溫度50 ℃，超聲3 s，間歇5 s，萃取后離心取上清液，經(jīng)過濾，去除藥渣，將濾液置于多樣品平行蒸發(fā)儀中減壓濃縮，得到粗提浸膏，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

方案Ⅰ：60%(體積分?jǐn)?shù))乙醇[12]，料液比1∶20 g/mL，60 ℃；方案Ⅱ：70%(體積分?jǐn)?shù))甲醇[13]，料液比1∶30 g/mL、60 ℃；方案Ⅲ：62%(體積分?jǐn)?shù))丙酮[13]，料液比1∶30 g/mL，60 ℃；方案Ⅳ：正己烷，料液比1∶20 g/mL，60 ℃；方案Ⅴ：純水，料液比1∶20 g/mL，60 ℃；方案Ⅵ：60%(體積分?jǐn)?shù))乙醇+0.325 mg/mL硫酸銨，料液比1∶20 g/mL，60 ℃；方案Ⅶ：60%(體積分?jǐn)?shù))乙醇+10%(體積分?jǐn)?shù))乙酸乙酯，料液比1∶30 g/mL，60 ℃。

1.2.2菌懸液的制備。先將9株致病菌進(jìn)行分離純化后，于普通瓊脂培養(yǎng)基斜面中劃線培養(yǎng)，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h ；然后將菌種沖洗下，取菌液200 μL加入2 mL生理鹽水，取已稀釋菌液200 μL于酶標(biāo)板，以生理鹽水為空白對照，用酶標(biāo)儀測定吸光度值，吸光度值范圍為0.18～0.30時，菌濃度已校正為108CFU/mL；再將已校正的108CFU/mL菌液與生理鹽水按1∶9混合稀釋成107CFU/mL。

1.2.3藥物敏感試驗。藥敏培養(yǎng)基均經(jīng)過高壓滅菌后倒平板，將菌液濃度調(diào)至107CFU/mL，取菌液2 μL接種在含藥平板上，每個藥物梯度做2組平行試驗。將接種的平板放置28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24和48 h后分別觀察平板上菌落的生長情況，記錄其最小抑菌濃度(MIC)[14]。

1.2.4正交試驗設(shè)計。選出萃取物抑菌效果最好的溶劑乙醇，采用正交試驗設(shè)計法優(yōu)化石榴皮超聲波萃取條件，設(shè)置16組4水平4因素正交試驗，以萃取溶劑乙醇的濃度、料液比、萃取溫度和超聲波處理時間為4個因素，每個因素選擇4個水平，利用SPSS軟件設(shè)計正交試驗表進(jìn)行正交試驗。

2結(jié)果與分析

2.1不同溶劑萃取石榴皮藥液的抑菌作用比較由表1可知，乙醇萃取的石榴皮藥液對Sh2-11、F3-4、FJ0507 3株致病菌的抑制效果最佳，MIC為0.225 mg/mL；甲醇萃取的石榴皮藥液對F3-4的抑制作用最強(qiáng)，MIC為0.375 mg/mL；丙酮萃取的藥液對B10、F3-4的抑制效果最好，MIC為0.375 mg/mL；正己烷萃取的石榴皮藥液對9株致病菌的抑制效果不明顯，僅對Sh2-8、Sh1、FJ0507的MIC<1.0 mg/mL；而用蒸餾水萃取的石榴皮藥液僅對Sh2-8、Sh1、Sh2-11、FJ0507的MIC<1.0 mg/mL。從平均最低抑菌濃度來看，乙醇萃取石榴皮藥液對9株致病菌的抑制效果最好，平均MIC為0.517 mg/mL。為了進(jìn)一步提高乙醇萃取藥液對9株致病菌的效果，該試驗采用乙醇分別與硫酸銨和乙酸乙酯組成雙水相體系(Ⅵ、Ⅶ)進(jìn)行萃取液抑菌試驗，但是結(jié)果表明，2種雙水相體系萃取石榴皮有效組分的抑菌效果不如單用乙醇作為萃取溶劑，故該試驗選擇乙醇作為超聲萃取的最佳溶劑，后續(xù)進(jìn)一步優(yōu)化其萃取工藝條件。

表1　不同溶劑萃取石榴皮藥液對9株致病菌抑菌效果

2.2正交試驗結(jié)果分析正交試驗因素水平設(shè)計見表2，結(jié)果見表3。

表2　正交試驗因素水平

從表3可見，組合9對7株菌的抑菌效果最佳，平均MIC為0.700 mg/mL，組合3對6株菌的抑菌效果最好，平均MIC為0.725 mg/mL，組合2、4對3株菌的抑菌效果最好，平均MIC為0.825、0.875 mg/mL，組合5、10只對1株菌的抑菌效果最好，平均MIC為0.875、0.950 mg/mL。其余組合效果不明顯，平均MIC≥1.0 mg/mL。從均值來看，組合9即乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、萃取時的料液比為1∶40 g/mL、萃取溫度為60 ℃、超聲時間40 min抑菌效果最好，為更準(zhǔn)確得出最佳萃取工藝條件，筆者將對數(shù)據(jù)進(jìn)行極差、方差分析。

2.2.1極差分析法。極差分析法是通過比較極差的大小進(jìn)而確定因素的主次。特別指出，對于空白列也需要計算極差，并且要與其他因素的極差進(jìn)行比較。若所有因素的極差都比空白列極差還小，則說明因素之間可能存在有不可忽略的交互作用，或是忽略了對試驗結(jié)果有重要影響的其他因素。

表3　石榴皮抑菌藥液超聲提取工藝正交試驗結(jié)果

由表4中極差(R)可知，各因素對石榴皮抑菌藥液的萃取率的影響次序大小依次為A、D、C、B，即試驗因素的主次順序依次為乙醇濃度、超聲萃取時間、萃取溫度、料液比。故必須控制主要因素在最優(yōu)水平上，對于次要因素則可在一定范圍內(nèi)選取適當(dāng)水平。

表4正交試驗設(shè)計安排及結(jié)果的極差分析

Table 4Range analysis of the arrangements and results of orthogonal test

試驗號TestNo.因素FactorABCD平均抑菌濃度AverageMICmg/mL111111.350243120.825332140.725424130.875542230.875621221.050714241.100833211.075934320.7001022310.9501113331.0501241341.0001344411.3501431431.0751523441.0001612421.200K14.7004.4753.7754.725K23.8753.7504.1003.775K33.5753.9503.7003.875K44.0504.0254.6253.825極差(R)Range0.2810.1810.2310.238

通過對正交試驗結(jié)果分析，得出萃取石榴皮抑菌藥液的最優(yōu)組合為A3B2C3D2，即要獲得最佳抑菌效果應(yīng)選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，萃取時的料液比為1∶20 g/mL，萃取溫度為60 ℃，超聲時間40 min。

2.2.2方差分析法。由于極差分析法存在一定的局限性，不能估計試驗過程及試驗結(jié)果測定中必然存在的誤差，因而不能區(qū)分某因素各水平所對應(yīng)的試驗結(jié)果的差異究竟是由于水平的改變所引起的，還是由試驗誤差所引起的。所以該項目還采用方差分析法來彌補(bǔ)極差分析法的不足。

方差分析法能把因素水平的變化所引起的試驗結(jié)果間的差異與誤差的波動所引起的試驗結(jié)果間的差異區(qū)分開，并能給出可靠的數(shù)量估計。該項目通過使用SPSS對試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析得到結(jié)果如下：F校正模型=10.262，P校正模型=0.040；F截距=3 840.585，P截距=0.000；FA=13.244，PA=0.031；FB=5.488，PB=0.098；FC=10.366，PC=0.043；FD=11.951，PD=0.036；R2=0.976；因變量為平均抑菌濃度。由各因素的平方和可得出各因素的主次順序為A>D>C>B。

從表5可以看出各水平的均值，根據(jù)該項目的需要，在同樣的抑菌效果條件下，選擇的乙醇濃度均值越低越省化學(xué)藥品。由此可見，選擇水平3即乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%是最佳參數(shù)。其他因素的方差分析結(jié)果見表6。

表5　乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)的方差分析

表6　B、C、D因素的方差分析

同理從表6可見，最佳萃取工藝參數(shù)為萃取時的料液比為1∶20 g/mL、萃取溫度為60 ℃、萃取時間40 min。從結(jié)果可以看出，極差分析和方差分析結(jié)果一致，更加證明了試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.3最佳工藝條件的驗證試驗采用正交試驗最佳水平進(jìn)行驗證試驗，結(jié)果(表7)表明：在該條件下對9株常見致病菌的平均抑菌濃度為0.442 mg/mL，比未優(yōu)化前的抑菌效果有了一定提高。

表7超聲波萃取最佳工藝條件的驗證結(jié)果

Tale 7Verification results of the optimal technology conditions for

ultrasonic extraction

mg/mL

3結(jié)論與討論

石榴皮是農(nóng)產(chǎn)品的廢棄物，但卻是一種常用的、廉價的抑菌中草藥，其中富含多種生物活性物質(zhì)，如酚類和鞣質(zhì)、黃酮、生物堿、糖苷等，這些物質(zhì)均具有抑菌作用[15]。該試驗采用不同溶劑做單因素試驗研究超聲萃取石榴皮的有效抑菌藥液對常見致病菌的抑菌活性，結(jié)果表明，乙醇為最佳萃取溶劑，其萃取部位MIC為0.517 mg/mL。進(jìn)而通過4因素4水平正交試驗得出最佳提取條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、萃取時的料液比為1∶20 g/mL、萃取溫度為60 ℃、超聲時間40 min，MIC為0.442 mg/mL。影響抑菌效果的大小次序為乙醇濃度、超聲萃取時間、萃取溫度、料液比。這是因為乙醇穿透細(xì)胞能力強(qiáng)，對難溶于水的親脂性成分溶解性能好，與甲醇相比無毒、安全。其次，隨著時間推移，提取率增加，再增加時間因細(xì)胞內(nèi)外達(dá)到平衡，對有效成分溶出無明顯影響。再次，溫度增高使分子運(yùn)動速度加快，滲透、擴(kuò)散、溶解的速度也加快，但雜質(zhì)的溶出也相應(yīng)增加，而過高的溫度會使有效成分氧化分解而遭到破壞[16]。最后，過低的料液比導(dǎo)致材料的浪費(fèi)及有效成分溶出不徹底，而過高又會使得雜質(zhì)溶出增大。

根據(jù)正交試驗結(jié)果表明，石榴皮抑菌藥液對9株致病菌的平均抑菌濃度范圍在0.70～1.35 mg/mL，造成這種差異的原因可能是由于不同致病菌對石榴皮藥液中所含有效抗菌成分的敏感度不同，且不同提取工藝對石榴皮提取液中所含的抑菌成分及濃度有所不同，因此在使用中藥防治魚類疾病的實踐中， 應(yīng)該先診斷致病的細(xì)菌種類， 再根據(jù)致病菌的種類來確定用藥量。

超聲萃取的有效抑菌藥液有待于通過具體的定性及定量分析，進(jìn)一步確定抑菌成分，以期為今后研究中草藥聯(lián)用以及中西藥復(fù)方提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并為石榴皮抗菌劑的研制和工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

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中圖分類號S 609.9

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)06-109-04

收稿日期2016-01-27

作者簡介張坤(1990- )，男，福建霞浦人，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)病害防治技術(shù)。*通訊作者，副教授，博士，從事水產(chǎn)生物醫(yī)學(xué)研究。

基金項目公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項項目(201203085)；國家海洋局海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范專項項目(2012FJ03)；福建省教育廳項目(JA15260)；鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心開放基金項目(RE201306)；福建省科技廳重點(diǎn)項目(2013Y0089)；廈門市科技局項目(3502Z20133015)。