張冬冬 ，季慕寅，徐　迪 ，張海燕，蕭　晟，楊艷麗

( 1.蕪湖職業(yè)技術學院　生物工程學院，安徽　蕪湖　241003；

2.蕪湖市畜牧獸醫(yī)局，安徽　蕪湖　241000 )

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蕪湖市規(guī)模雞場禽流感抗體水平的監(jiān)測與分析

張冬冬1，季慕寅1，徐迪1，張海燕1，蕭晟1，楊艷麗2

( 1.蕪湖職業(yè)技術學院生物工程學院，安徽蕪湖241003；

2.蕪湖市畜牧獸醫(yī)局，安徽蕪湖241000 )

摘要：目的：免疫接種是預防禽流感疫情的最主要措施，通過抗體檢測判斷免疫效果并指導后續(xù)免疫措施的改進，為蕪湖市禽流感的綜合防控提供了基礎依據；方法：2013年～2015年期間對蕪湖市部分規(guī)模雞場進行血清學調查，采用間接ELISA法(酶聯(lián)免疫吸附試驗)進行檢測，對禽流感抗體陽性率進行了分析；結果：(1)2013年至2015年間，蕪湖市禽流感免疫情況整體良好，血清抗體陽性率平均達到81.9%，但2014年度春季免疫普查結果低于國家強制免疫要求；(2)抽檢的90個養(yǎng)雞場中，74個抗體陽性率超過國家免疫要求，養(yǎng)雞場免疫合格率為82.2%；(3)蕪湖四區(qū)四縣中僅弋江區(qū)抗體陽性率結果低于國家免疫要求，各區(qū)縣抽檢的血樣抗體陽性率差異極顯著(P<0.01)；(4)三種類型養(yǎng)雞場抗體陽性率存在差異極顯著(P<0.01)，肉雞場抽檢的血樣抗體陽性率較低，需針對性加強免疫措施；結論：禽流感抗體水平監(jiān)測在蕪湖市重大動物疫病的防控中起到了積極的預警和指導作用。

關鍵詞：蕪湖；禽流感；抗體；酶聯(lián)免疫

禽流感(Avian Influenza，AI)是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一種禽類傳染病，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其劃為A類動物疫病，并被列入國際衛(wèi)生武器公約動物類傳染病名單[1]。禽流感病毒依據其外膜血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)蛋白抗原性的不同而有許多亞型，目前已從禽類鑒定出16個HA亞型(H1～H16)，9個NA亞型(N1～N9)，根據靜脈接種致病指數(IVPI)可將禽流感病毒亞型劃分高致病性禽流感、中致病性禽流感和低致病性禽流感，其中H5和H7兩個亞型可以引起高致病性禽流感，以傳播快、發(fā)病快、死亡率高為特征，也可傳染哺乳動物甚至致人發(fā)病死亡[2]。我國從2004年起，在全國范圍內對存欄禽類進行高致病性禽流感強制免疫[3]，由于影響免疫的因素較多，免疫后抗體水平仍然需要進行監(jiān)測和分析，為配合蕪湖市畜牧獸醫(yī)局的重大動物疫病的免疫普查工作，蕪湖職業(yè)技術學院動物保健中心于2013至2015年期間針對蕪湖市部分規(guī)?；u場進行血清學檢驗，為蕪湖市禽流感的有效防控提供基礎依據。

1材料與方法

1.1血清采集

由蕪湖市畜牧獸醫(yī)局下轄各動物疫病監(jiān)測站抽檢，每份血樣采集不少于0.5mL，并記錄血樣來源信息和編號，蕪湖職業(yè)技術學院動物保健中心收集整理，剔除溶血嚴重樣品，合格樣本2000 r/min 離心10 min分離血清，-20℃保存待測[4]。

1.2主要儀器

Thermo MK3酶標儀，5424R離心機，國產高壓蒸汽滅菌器、超凈工作臺、生化培養(yǎng)箱、冰箱。

1.3試劑盒和判定標準

禽流感通用型ELISA抗體檢測試劑盒購自深圳康百得。采用間接ELISA法，操作程序按照試劑盒說明進行：樣品血清1 ∶100稀釋-抗原抗體孵育30min-洗板3次-酶標二抗孵育30min-洗板3次-顯色反應10min-終止，抗原包被板上每份樣品血清一孔，陽性血清、陰性血清、空白對照實驗各兩孔，以空白對照調零，酶標儀450nm檢測波長下(630nm作為參比波長)讀取各孔OD值。

結果按照試劑盒給出條件判定：(1)實驗有效性判定，陰性對照孔OD值≤0.15、陽性對照孔OD值≥0.30，否則實驗無效；(2)檢驗結果判定(S/P=樣品OD值/陽性對照平均OD值)，在實驗有效的前提下，若樣品S/P≥1.1，判為禽流感病毒抗體陽性，若樣品S/P≤0.9，判為禽流感病毒抗體陰性，若樣品0.9

雞場免疫合格判定：該雞場抽檢的血樣抗體陽性率≥70%(國家免疫要求)，則判斷該雞場免疫合格。

2檢測結果

血樣檢測結果按照年度、區(qū)縣、養(yǎng)殖類別分別進行抗體陽性率匯總，統(tǒng)計結果使用軟件SPSS 16.0進行R×C表卡方檢驗(養(yǎng)殖場免疫合格率差異分析采用Fisher's Exact Test數據結果，血清抗體陽性率差異分析采用Pearson Chi-Square數據結果)[5]。

2.1年度統(tǒng)計

2013年1月至2015年12月期間，為配合蕪湖市畜牧獸醫(yī)局春季防疫、秋季防疫的免疫普查工作，共檢測蕪湖市四區(qū)四縣90個養(yǎng)雞場的合格血樣893份，結果詳見表1。

各年度春防，秋防免疫普查中共抽檢了90家養(yǎng)雞場，其中74家養(yǎng)雞場抽檢血樣的抗體陽性率≥70%，16家養(yǎng)雞場免疫不合格(抗體陽性率<70%)。不同年度間養(yǎng)雞場免疫合格率差異極顯著(χ2=10.447，0.01

各年度春防、秋防抽檢血樣的抗體陽性率在50.6～96.7%，平均81.9%，年度間結果差異極顯著(χ2=139.000，P<0.01)，其中2014年春防免疫普查抽檢的血樣抗體陽性率為50.6%，低于國家免疫要求。

表1　禽流感抗體檢測年度統(tǒng)計

2.2區(qū)縣統(tǒng)計

將血樣按照來源劃入鏡湖、弋江、鳩江、三山四個市屬轄區(qū)和蕪湖、繁昌、南陵、無為四縣，按照區(qū)域進行統(tǒng)計對比，結果見表2。

表2　禽流感抗體檢測區(qū)縣統(tǒng)計

結果顯示，蕪湖市屬區(qū)縣均存在少量養(yǎng)雞場的免疫不合格，其中三山區(qū)抽檢養(yǎng)雞場免疫合格率最高達94.7%，南陵縣最低為66.7%，但由于抽檢的雞場數目較少，各區(qū)縣雞場免疫合格率之間差異無統(tǒng)計學意義(χ2=5.814，P>0.05)。

按照各區(qū)縣抽檢的血樣抗體陽性率統(tǒng)計，各區(qū)縣抽檢血樣抗體陽性差異極顯著(χ2=44.971，P<0.01)，各地抽檢血樣抗體陽性率在60%～91.5%，僅弋江區(qū)未達到國家免疫要求，抽檢血樣抗體陽性率為60%。

2.3養(yǎng)殖類別統(tǒng)計

在抽檢的90家養(yǎng)雞場中，共25家蛋雞場、56家肉雞場、9家種雞場，將檢測結果按照不同養(yǎng)殖類別進行統(tǒng)計，結果見表3。

結果顯示，蛋雞場的免疫合格率最高為92%，其次是種雞場88.9%，最低為肉雞場免疫合格率76.8%，由于各養(yǎng)殖類別單位抽檢的數量較少，不同養(yǎng)殖類別養(yǎng)雞場的免疫合格率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=2.707，P>0.05)。

而以各養(yǎng)殖類別的血樣抗體陽性率進行統(tǒng)計，蛋雞禽流感抗體陽性率為91.0%，其次為種雞89.5%，而肉雞最低為76.7%，蛋雞、肉雞、種雞抗體陽性率差異極顯著(χ2=27.369，P<0.01)。

表3　禽流感抗體檢測養(yǎng)殖類別統(tǒng)計

3結論與討論

本研究使用的是雞禽流感通用型ELISA檢測試劑盒，檢測結果并不能區(qū)分是哪種亞型禽流感病毒疫苗引發(fā)的抗體，也不能確定是疫苗還是禽流感病毒引發(fā)的抗體，蕪湖市各規(guī)模養(yǎng)雞場經調研發(fā)現(xiàn)，主要使用的是重組禽流感病毒H5亞型二價滅活苗、H7亞型二價滅活苗和H5+H9亞型二聯(lián)滅活苗等，市場上雖然也有具體亞型禽流感病毒抗體檢測試劑盒，但本研究重點考察疫苗的免疫后效果，并不強調病原檢測和亞型抗體分類，故在考慮實驗效率和實驗成本的前提下，采用雞禽流感通用型ELISA檢測試劑盒，而并未采用其他方法如血凝(HA)試驗和血凝抑制(HI)試驗、PCR法等。

年度統(tǒng)計結果顯示，蕪湖市禽流感整體免疫情況良好，6次春防、秋防普查中，5次整體抗體合格率超過國家免疫要求，但在2014年度春防免疫普查中，抽檢15家養(yǎng)雞場，其中7家養(yǎng)雞場免疫不合格，其中弋江區(qū)1家，鳩江區(qū)、蕪湖縣、繁昌縣各2家，7家養(yǎng)雞場抽檢血樣的抗體陽性率為0%或極低，調查發(fā)現(xiàn)由于這7家養(yǎng)雞場，疫苗免疫時間和檢測時間間隔太短，抗體水平還未能顯著升高，后期應重新對抗體水平進行檢測評估。

區(qū)縣統(tǒng)計結果顯示蕪湖市屬四區(qū)四縣大部分雞場免疫合格，但各地均有少量雞場免疫不合格。弋江區(qū)抽檢血樣的抗體陽性率為60%，未達到國家免疫要求，原因為弋江區(qū)僅抽檢4家養(yǎng)雞場共30份血清數量，其中1家養(yǎng)雞場抽檢了10份血樣抗體檢測全部陰性，調查發(fā)現(xiàn)這家養(yǎng)雞場送檢血樣為初次免疫肉雞，進行二次加強免疫即可提高抗體水平，所以結果并不能真實反映弋江區(qū)的禽流感免疫狀況。南陵縣抽檢分屬15家養(yǎng)雞場的血樣雖然抗體陽性率整體達到80.7%，由于其中10家養(yǎng)雞場抗體陽性率近100%，而5家養(yǎng)雞場免疫不合格，不足以抵御疫病風險，應當引起相關從業(yè)者和管理部門的重視，進一步調整免疫程序和疫苗選擇，進行補免加強并及時監(jiān)控免疫效果。

對蛋雞、肉雞、種雞三種類型養(yǎng)雞場進行統(tǒng)計分析，三種類型養(yǎng)雞場都達到了國家免疫要求，肉雞場免疫合格率和抗體陽性率均低于蛋雞場和種雞場，主要由于大部分蛋雞場、種雞場的規(guī)?；?、集約化、管理水平較高，免疫程序科學合理，部分肉雞場由于飼養(yǎng)周期短、免疫次數少，抗體陽性率水平較低，更有部分肉雞場采用傳統(tǒng)散養(yǎng)或半散養(yǎng)方式，免疫難度大，免疫程序的制定及執(zhí)行存在一定的問題，需根據檢測結果，迅速制定和落實相關免疫措施，預防疫病風險。

抗體陽性率在各雞場分布極不平衡，部分雞場禽流感的抗體陽性率可達100%，而免疫情況差的雞場禽流感抗體陽性率低至為0%，免疫存在較大的差異，原因在于各雞場的飼養(yǎng)管理、疫苗選擇和免疫程序制定以及雞群自身的健康水平差異較大。本研究通過抗體水平檢測，及時反饋各養(yǎng)雞場，并指導補免加強和后期監(jiān)測，使得免疫不合格的雞場的抗體陽性率均有大幅度提升，起到了良好的預警作用和指導作用，在2015年的春防、秋防檢測中，禽流感的抗體陽性率，整體達到了90%以上。對于免疫情況良好的雞場，也不能放松警惕，應當根據免疫抗體消長規(guī)律，間隔數月再次評估群體抗體水平，實現(xiàn)抗體水平監(jiān)測的常態(tài)化。

除了疫苗自身質量原因以外，科學制定和嚴格執(zhí)行免疫程序規(guī)定的接種方式、時間、次數、接種量、操作方式、藥物影響[6]、盲目聯(lián)合應用疫苗等[7]，以及疫苗的保管存放，也是免疫成敗的關鍵。另外，某些雞場疫苗接種時間和抗體檢測時間接近，抗體未能產生，也是檢測結果偏低的原因之一，應根據疫苗免疫規(guī)律，再次檢測抗體水平，獲得合理評估結果。

本研究通過血清學調查，統(tǒng)計了近年來蕪湖市屬各區(qū)縣禽流感的抗體陽性率，并分年度、區(qū)縣、養(yǎng)殖種類對檢測結果進行分析，基本掌握了蕪湖市禽流感的抗體水平分布情況，為禽流感的綜合防控措施提供了基礎依據，在本研究的警示和反饋指導下，蕪湖市2015年抽檢的養(yǎng)雞場免疫合格率和血樣抗體陽性率較往年有較大提高，對地方重大動物疫病的防控起到了積極作用。同時，本研究僅進行了禽流感抗體水平檢測，未進行病毒抗原和抗體分型測定，在制定禽流感綜合防控措施時，需在抗體和抗原檢測的共同基礎上，加大免疫和監(jiān)測力度，并加強日常管理[8]，防范疫病風險，促進養(yǎng)殖業(yè)良性發(fā)展。

參考文獻：

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(責任編輯：馬世堂)

Detection and Analysis of Avian Influenza Antibody in Large-scale Henneries of Wuhu City

ZHANG Dong-dong1, JI Mu-yin1, XU Di1, ZHANG Hai-yan1, XIAO Sheng1, YANG Yan-li2

(1.Department of Biology Engineering，Wuhu Institute of Technology，Wuhu 241003，China；2. Bureau of Animal Husbandry and Veterinary，Wuhu 241000，China)

Abstract：Immunization is the most important measure to prevent the outbreak of avian influenza. This paper studied antibody positive rate of bird flu in some large-scale henneries of Wuhu City by using Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay (ELISA) method during 2013 to 2015. The result showed that the overall situation of avian influenza immunization in Wuhu City was good from 2013 to 2015 during which serum antibody positive rate was 81.9%, but the 2014 annual spring immune census results is below the national mandatory immunization requirements. In the sampling of 90 chicken farms, 74 antibody positive rates were over the national immunization requirements, and the immunity percent of pass was 82.2%. The positive rate of serum antibody was significantly different among districts in Wuhu City (P<0.01), and only Yijiang District antibody positive rate was lower than the national immunization requirements. It also indicated the antibody positive rate of bird flu had significant differences in three types of henneries (P<0.01), that broiler farms need to strengthen immunization measures due to its lower antibody positive rate. This paper uses antibody detection to judge the immune effect and to guide the improvement of follow-up immunization measures which provided the basis for the comprehensive prevention and control of avian influenza in Wuhu City.

Key words:Wuhu; Avian Influenza; antibody; ELISA

中圖分類號：S855.3

文獻標識碼：A

文章編號：1673-8772(2016)01-0025-05

作者簡介：張冬冬(1983-)，男，安徽省定遠縣人，碩士，講師，主要從事生化檢測研究。

基金項目：蕪湖職業(yè)技術學院自然科學研究項目(WZ[2012]ky04)；安徽省高等學校省級自然科學研究重點項目( KJ2016A765)。

收稿日期：2015-12-20