張　靈　白曉敏　范　凌　張亞芳　吉慧姝

075000 河北北方學院附屬第一醫(yī)院(張　靈，白曉敏，范　凌，吉慧姝)；075000 河北省張家口市建國醫(yī)院(張亞芳)

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組蛋白去乙酰化酶抑制劑LBH589對多發(fā)性骨髓瘤復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個核細胞的抑制作用

張靈白曉敏范凌張亞芳吉慧姝

075000 河北北方學院附屬第一醫(yī)院(張靈，白曉敏，范凌，吉慧姝)；075000 河北省張家口市建國醫(yī)院(張亞芳)

【摘要】目的探討單用LBH589或聯(lián)合硼替佐米及地塞米松對多發(fā)性骨髓瘤復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個核細胞的作用。方法采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法，檢測LBH589(15、25、50) nmol/L及50 nmol/L分別聯(lián)合硼替佐米(15、25) nmol/L及地塞米松 (5、10)μmol/L對MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個核細胞作用24，48 h后的細胞增殖影響；采用流式細胞術(shù)測定LBH589對MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個核細胞細胞周期及細胞凋亡的影響；用Westernblot測定LBH589(15、25、50 nmol/L)對復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個核細胞作用24 h后組蛋白H4乙?；淖兓潭?。結(jié)果單用LBH589或聯(lián)合硼替佐米及地塞米松均能夠使復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個核細胞增殖受到抑制，且與藥物劑量和時間變化呈正比例。藥物作用于MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個核細胞48 h后，G0/G1期細胞逐漸增加，G2/M期及S期細胞則逐漸降低，細胞在G0/G1期發(fā)生阻滯，可觀察到細胞凋亡現(xiàn)象，且凋亡程度與藥物劑量變化呈正比例，三藥聯(lián)合作用均較單藥作用更加顯著(P均<0.01)；Westernblot測定顯示，不同濃度LBH589對MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個核細胞作用24 h后組蛋白H4乙?；某潭壬险{(diào)，且與藥物劑量變化呈正比例。結(jié)論LBH589能夠使MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個核細胞增殖受到抑制，阻滯細胞周期，促進細胞凋亡，且三藥聯(lián)合對MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個核細胞有加強抗瘤細胞作用。

【關(guān)鍵詞】LBH589；MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個核細胞；組蛋白乙?；?/p>

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:407～410)

多發(fā)性骨髓瘤(multipie myeloma，MM)是發(fā)生在漿細胞的惡性腫瘤，骨髓瘤細胞異質(zhì)性強，容易發(fā)生耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致復(fù)發(fā)、難治率上升，至今尚無法完全治愈[1]。因此需要進一步研發(fā)新的藥物來降低復(fù)發(fā)和難治率。組蛋白去乙酰化酶抑制劑可以使組蛋白去乙?；傅幕钚允艿揭种疲龠M靶細胞中組蛋白恢復(fù)乙?；瑥亩鴨幽承┨禺愋曰虻谋磉_，抑制腫瘤細胞的生長[2-5]。已有研究證實，LBH589是1類新型的異羥肟酸類組蛋白去乙?；敢种苿?，在體外作用于MM細胞后可促進組蛋白乙酰化，誘導(dǎo)細胞凋亡，并且對地塞米松耐藥的MM1R細胞有明顯的抑制作用[6-8]，但其對MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個核細胞有無影響尚未見報道。本研究旨在探索LBH589對MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個核細胞的作用，同時也探討其與硼替佐米及地塞米松聯(lián)合在體外抗MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個核細胞的加強作用。

1材料與方法

1.1試劑與材料

LBH589為美國Biovision公司原裝進口試劑，硼替佐米購于西安楊森公司，地塞米松注射液為上海通用藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，β-actin抗體、組蛋白H4(histone H4)抗體均為美國Cell Signaling公司產(chǎn)品，2PMI1640培養(yǎng)液購于博士德公司，胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品，碘化丙啶(PI)試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，人淋巴細胞分離液為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品，MTT為3igma公司產(chǎn)品。

1.2標本來源

按Durie-Solmon分期系統(tǒng)，從河北北方學院附屬第一醫(yī)院血液科選出12例不同類型的MM復(fù)發(fā)、難治患者，其中男性4例，女性8例，中位年齡53.4歲；，其中ⅡA期患者3例，ⅡB期患者2例，ⅢA期患者3例，ⅢB患者4例。所有病例均符合中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南(2013年修訂)診斷標準。

1.3方法

1.3.1MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個核細胞的分離和培養(yǎng)無菌條件下行骨髓穿刺術(shù)在髂后上嵴抽取骨髓液15～20 mL，肝素抗凝。加入一定量的PBS后1 500 r/min 離心約10 min，把骨髓中的脂肪組織消除，再放入等量的D-Hanks液混勻。將淋巴細胞分離液放入另一無菌離心管，再緩慢加入骨髓液，骨髓液與淋巴細胞分離液的體積比為1∶2。以2 000 r/min 離心10 min，將中間的白細胞層用毛細吸管吸取后加入另一試管中，用PBS洗滌3遍。將以上分離出的骨髓單個核細胞接種于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于5%CO2、37 ℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，2～3天換液并傳代1次，收集對數(shù)生長期的細胞用來測定。

1.3.2藥物處理MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個核細胞

根據(jù)參考文獻[5]中濃度和預(yù)實驗結(jié)果，將濃度分別為0、15、25、50 nmol/L LBH589，濃度分別為15、25 nmol/L硼替佐米，注射液濃度為5、10 μmol/L，地塞米松，加入對數(shù)生長期的細胞24或48 h后收集細胞并進行洗滌，用于實驗。

1.3.3MTT法檢測細胞增殖活性收集對數(shù)生長期的骨髓單個核細胞，將不同濃度藥物加入接種了以細胞密度1×105/ml的96孔培養(yǎng)板，用無血清的RPMI 1640補足未加藥物濃度組，設(shè)置每孔總體系0.2 ml，分別作用24 h、48 h，再加入MTT工作液20 μl/孔(終濃度0.5 mg/ml)，置37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育4 h，1 000 r/min離心，后吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入DMSO 200 μl，振蕩10 min，選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值(A)。

細胞增殖抑制率(%)=(A對照組-A實驗組)/(A對照組-A未加藥物濃度組)×100%

1.3.4流式細胞術(shù)檢測MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個核細胞周期及細胞凋亡收集對數(shù)生長期的骨髓單個核細胞，將不同濃度的藥物加入接種于細胞密度為1×106/mL的24孔板，同時設(shè)未加藥物濃度組，48 h后收集各組細胞，離心并去掉上清液，用4 ℃預(yù)冷的PB3洗滌2次，1 000 r/min，4 ℃離心7 min，去上清液。將細胞重懸于1×緩沖液，將5 μl PI加入100 μl細胞，混勻后室溫避光反應(yīng)15 min，再加入300 μl×緩沖液，然后用流式細胞儀檢測，實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3.5Westernblot檢測組蛋白H4乙酰化程度收集對數(shù)生長期的骨髓單個核細胞，將不同濃度的LBH589加入接種于細胞密度為1×107/ml的24孔板，同時設(shè)未加藥物濃度組，24 h后收集各組細胞，用超聲波細胞粉碎機處理(160 W，持續(xù)3 s，間隔5 s，共3次)，4 ℃ 10 000×g離心10 min，取上清液，Bradford法測蛋白質(zhì)濃度后-70 ℃凍存?zhèn)溆?。等量蛋白?00 g/LSDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電轉(zhuǎn)移后將PVDF膜放入密閉盒中，加入一抗，4 ℃過夜。用1×TBST洗膜3～4次，每次5 min。PVDF膜置于二抗中，雜交爐中室溫溫育1 h。用1×TBST洗膜3次，每次5 min，β-actin作為內(nèi)參對照，參照化學發(fā)光試劑盒說明書進行操作。

1.4統(tǒng)計學分析

2結(jié)果

2.1單用LBH589或聯(lián)合硼替佐米及地塞米松對MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個核細胞增殖作用的影響

MTT法檢測細胞增殖表明，單用LBH589及三藥聯(lián)合均可以使MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個核細胞的增殖受到抑制，呈時間和濃度依賴性，且有明顯差異(P均<0.01)，逐漸延長時間及增加濃度劑量，抑制效果更加明顯，三藥聯(lián)合抑制效果均較單藥抑制效果明顯(P<0.01)(表1)。

表1　單用LBH589或三藥聯(lián)合對MM復(fù)發(fā)、難治患者

注：與未加藥物組比較，*為P<0.05。

2.2LBH589促進MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個核細胞組蛋白乙?；?/p>

LBH589(0、15、25、50 nmol/L)作用于MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個核細胞24 h，隨著藥物劑量的增加，組蛋白H4乙酰化程度逐漸上調(diào)；且呈濃度依賴性(P<0.01)(表2，圖1)。

表2　LBH589作用MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個核細胞

注：與未加藥物組比較，*為P<0.05。

1為未加藥物組；2為15 nnomL/L LBH589處理組；3為25 nnomL/L LBH589處理組；4為50 nnomL/L LBH589處理組。

圖1Western blot檢測結(jié)果

2.3單用LBH589或聯(lián)合硼替佐米及地塞米松對MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個核細胞周期及凋亡的影響

不同濃度LBH589作用MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個核細胞48 h，與未加藥物組相比，隨著藥物劑量的不斷升高，G0/G1期細胞逐漸增加，而G2/M期及S期細胞則逐漸降低，細胞在G0/G1期發(fā)生阻滯。作用48 h后，未加藥物組細胞未見顯著凋亡，而藥物處理組的細胞凋亡率越來越高，呈濃度依賴性，三藥聯(lián)合作用處理48 h較單藥組細胞凋亡率顯著增高(P值均<0.05)(表3)。

3討論

研究表明，LBH589 是1種新型的HDAC抑制劑，體外試驗已證實它對卵巢癌、淋巴瘤等實體瘤，以及多發(fā)性骨髓瘤耐藥細胞均有抑制增殖、誘導(dǎo)再分化和促進凋亡作用，且具有效果強、毒性低的特性，與一些藥物聯(lián)合應(yīng)用能夠加強抗瘤細胞效應(yīng)[9-13]。

結(jié)果表明單用LBH589及三藥聯(lián)合均可以使MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個核細胞的增殖受到抑制，且逐漸延長時間及增加濃度劑量，抑制效果更加明顯，三藥聯(lián)合抑制效果均較單藥抑制效果明顯，且50 nmol/L LBH589+25 nmol/L硼替佐米+10 μmol/L地塞米松組抑制效果最強，這明顯表明LBH589與其它兩藥聯(lián)合具有共同抗瘤細胞效應(yīng)。

另外，單用LBH589或聯(lián)合硼替佐米及地塞米松均能夠使MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個核細胞在G0/G1期發(fā)生阻滯，且隨著藥物劑量的增大，該期細胞逐漸增加，S期細胞則逐漸降低，且伴隨藥物劑量的不斷增加，阻滯作用越來越強，呈藥物濃度依賴性變化，由此表明細胞凋亡可能發(fā)生在G1期。作用48 h后MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個核細胞發(fā)生了凋亡現(xiàn)象，且凋亡率隨著藥物劑量的增加逐漸升高，也呈藥物濃度依賴性，表明LBH589具有使MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個核細胞周期發(fā)生阻滯，促進細胞凋亡的作用。

表3　單用LBH589或三藥聯(lián)合對MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個核細胞48 h后細胞周期分布及凋亡率±s，%)

注：與未加藥物比較，*為P<0.05。

Western blot實驗表明，使用不同濃度LBH589作用MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個核細胞24 h后，組蛋白H4乙?；潭入S著藥物劑量的增大越來越明顯，表明LBH589能夠促進MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個核細胞中組蛋白高度乙?；瑥亩朔[瘤，使機體恢復(fù)正常。

綜上所述，LBH589通過提高組蛋白乙酰化程度來抑制MM復(fù)發(fā)、難治患者骨髓單個核細胞增殖、阻滯細胞周期，促進細胞凋亡，從而克服腫瘤。LBH589有望成為治療MM的一類開創(chuàng)性的新型藥物，會成為一種重要的MM治療選擇。

參考文獻

[1]Pramanik D，Campbell NR，Das S，et al.A composite polymer nanoparticle overcomes multidrug resistance and ameliorates doxorubicin-associated cardiomyopathy〔J〕.Oncotarget，2012，3(6)：640-650.

[2]Lee H，Park JR，Yang J，et al.Nicotine inhibits the proliferation by upregulation of nitric oxide and increased HDAC1 in mouse neural stem cells〔J〕.In Vitro Cell Dev Biol Anim，2014，50(8)：731-739.

[3]Martinez-Lglesias O，Ruiz-Llorente L，Sanchez-Martine R，et al.Histone deacetylase inhibition： mechanism of action and therapeutic use in cancer〔J〕.Clin Transl Oncol，2008，10(7) ：395-398.

[4]謝華峰，陸濤.抗腫瘤藥物組蛋白去乙酰化酶抑制劑的研究進展〔J〕.中國藥師雜志，2010，13(6)：805-807.

[5]Newbold A，Matthews GM，Bots M，et al.Molecular and biologic analysis of histone deacetylase inhibitors with diverse specificities〔J〕.Mol Cancer Ther，2013，12(12)：2709-2721.

[6]Neri P，Bahlis NJ，Lonial S.Panobinostat for the treatment of multiple myeloma〔J〕.Expert Opin Investig Drugs，2012，21 (5)：733-747.

[7]Sanchez E，Shen J，Steinberg J.The histone deacetylase inhibitor LBH589 enhances the anti-myeloma effects of chemotherapy in vitro and in vivo〔J〕.Leuk Res，2011，35(3)：373-379.

[8]張靈，馬艷萍，賈谷，等.組蛋白去乙?；敢种苿㎜BH589對多發(fā)性骨髓瘤細胞MM12的抑制作用〔J〕.中國實驗血液學雜志，2012，20(5)：1122-1126.

[9]晁宏圖，鄧君麗，馬一鳴，等.LBH589 或聯(lián)合多烯紫杉醇對人卵巢癌OVCAR-3 細胞增殖和凋亡的研究〔J〕.中國腫瘤臨床雜志，2013，40(10)：567-570.

[10]張明增.組蛋白去乙?；敢种苿┞?lián)合蛋白酶體抑制劑對伯基特淋巴瘤細胞株Raji生長調(diào)控的研究〔D〕.河北醫(yī)科大學，2013.

[11]張靈，馬艷萍，賈谷，等.組蛋白去乙?；敢种苿㎜BH589誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細胞凋亡及其逆轉(zhuǎn)耐藥的機制研究〔J〕.中華血液學雜志，2012，33(11)：926-931.

[12]江雪杰，孟凡義，周紅升，等.LBH589 或聯(lián)合硼替佐米逆轉(zhuǎn)髓系白血病耐藥及其分子機制研究〔J〕.中華血液學雜志，2011，32(8)：537-542.

[13]Jones SF，Infante JR，Thompson DS，et al.A phase I trial of oral administration of panobinostat in combination with paclitaxel and carboplatin in patients with solid tumors〔J〕.Cancer Chemother Pharmacol，2012，70(3)：471-475.

(編輯：吳小紅)

The Inhibitive Effect of Histone Deacetylase Inhibitors LBH589 On Bone Marrow Mononuclear Cells of Patients with Relapsed or Refractory Multiple Myeloma

ZHANGLing，BAIXiaomin，F(xiàn)ANLing，etal.

FirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity，Zhangjiakou,075000

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of LBH589 alone or combined with bortezomib and dexamethasone on bone marrow mononuclear cells of patients with relapsed or refractory multiple myeloma.MethodsMethyl thiazolyl tetrazolium(MTT)was used to detect the effect of LBH589(15，25，50) nmol/L and 50nmol/L respectively combined with bortezomib(15，25) nmol/L and dexamethasone(5，10)mol/L on cell proliferation of bone marrow mononuclear cells of patients with relapsed or refractory multiple myeloma 24 h and 48 h later；flow cytometry was used to detect the effect of LBH589 on cell cycle and apoptosis of bone marrow mononuclear cells of patients with relapsed or refractory multiple myeloma；Westernblot was used to detect the effect of LBH589(15，25，50 nmol/L)on the changes of degree of histone H4 acetylation of bone marrow mononuclear cells of patients with relapsed or refractory multiple myeloma 24 h later.ResultsLBH589 alone or combined with bortezomib and dexamethasone were able to inhibit proliferation of bone marrow mononuclear cells of patients with relapsed or refractory multiple myeloma，and its relationship with drug dose and time was direct ratio.48 h after bone marrow mononuclear cells of patients with relapsed or refractory multiple myeloma treated with drugs，G0/G1 phase cells gradually increased，G2/M phase and S phase cells gradually decreased，G0/G1 phase occurred cell block，cell apoptosis was observed，and apoptosis degree was positively proportional with drug dose，combined effect of the 3 drugs was more significant than any single drug(P all<0.01)；Westernblot showed that degree of histone H4 acetylation increased 24 h after different concentrations of LBH589 on bone marrow mononuclear cells of patients with relapsed or refractory multiple myeloma，and it was positively proportional with drug dose.ConclusionLBH589 can inhibit proliferation of bone marrow mononuclear cells of patients with relapsed or refractory multiple myeloma，arrest cell cycle，promote apoptosis，and the combination of 3 drugs can strengthen the anti-tumor effects of cells.

【Key words】LBH589；Bone marrow mononuclear cells of patients with relapsed or refractory multiple myeloma；Histone acetylation

(收稿日期2015-05-21修回日期 2015-12-01)

中圖分類號：R739.42

文獻標識碼：A

文章編號：1001-5930(2016)03-0407-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.03.018