楊文棟，蘇　超，張春燕，趙亞麗，任媛媛，高星杰，楊　潔，，何津巖（天津醫(yī)科大學(xué).細(xì)胞生物學(xué)系；.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心；.醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，天津　00070）

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重組pCMV-N-Tudor-SN點突變質(zhì)粒的構(gòu)建及表達

楊文棟1，蘇超2，張春燕3，趙亞麗1，任媛媛3，高星杰2，楊潔1，2，何津巖1
（天津醫(yī)科大學(xué)1.細(xì)胞生物學(xué)系；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心；3.醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，天津300070）

摘要目的：構(gòu)建Tudor-SN蛋白的Serine426（S426）、Serine781（S781）、Threonine240（T240）和Threonine429（T429）的點突變質(zhì)粒，并使該重組質(zhì)粒能夠在HeLa細(xì)胞中融合表達。方法：利用定點突變技術(shù)，對Tudor-SN蛋白進行S426A、S781A、T240A、T429A點突變，通過雙酶切的方法獲得Tudor- SN.Mutants片段，最后將其連入到pCMV-N-Flag載體中。在HeLa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒，利用Western blot技術(shù)檢測質(zhì)粒表達效率。結(jié)果：（1）重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定，可以觀察到載體與Tudor-SN.Mutants的條帶。（2）轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒后可看出HeLa細(xì)胞中有Flag蛋白表達。結(jié)論：質(zhì)粒構(gòu)建成功，可以用于下一步科學(xué)研究使用。

關(guān)鍵詞人類Tudor-SN蛋白；pCMV-N-Flag；重組質(zhì)粒；融合蛋白

Construction and expression of recombinant pCMV-N-Tudor-SN.Mutants Flag plasmids

YANG Wen-dong1,SU Chao2,ZHANG Chun-yan3,ZHAO Ya-li1,REN Yuan-yuan3,GAO Xing-jie2,YANG Jie1,2,HE Jin-yan1
（1.Department of Cell Biology；2.Research Center of Basic Medical Science；3.Department of Medical Biochemistry,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China）

Abstract Objective:To construct eukaryotic Flag expressing recombinant pCMV-N-Tudor-SN.Mutants-Flag.Methods：The Serine426 （S426）,Serine781（S781）,Threonine240（T240）and Threonine429（T429）of Tudor-SN were transformed into Alanine by site- directed mutagenesis technique.Then the Tudor-SN.Mutants were obtained by restricting double enzyme digestion,and then inserted into pCMVN-Flag vector.The recombinant plasmids were transfected into HeLa and observed by Western blot.Results：（1）The vectorand Tudor-SN.Mutants could be observed by restricting double enzyme digestion.（2）Flag was expressed by HeLa which was transfected with recombinant plasmid.Conclusion：The recombinant plasmids of pCMV-N-Tudor-SN.Mutants-Flag are constructed successfully,and may be useful for furtherstudy.

Key words human Tudor-SN；pCMV-N-Flag；recombinant plasmid；fusion protein

人類Tudor-SN蛋白，又稱SND1（staphylococcal nuclease domain containing 1）或p100，該蛋白首次以EB病毒細(xì)胞核抗原2（epstein-barr virus nuclear protein 2，EBNA2）的轉(zhuǎn)錄共激活因子被發(fā)現(xiàn)[1]。疏水簇結(jié)構(gòu)分析（hydrophobic cluster analysis，HCA）顯示，人類Tudor-SN蛋白由N端4個連續(xù)的葡萄球菌核酸酶樣的（phylococcal nucleases-like，SN）SN （1～4）結(jié)構(gòu)域和C端的Tudor-SN5（TSN）組成[2]。近些年，本課題組研究發(fā)現(xiàn)Tudor-SN蛋白是一種多功能蛋白，可參與多種生物學(xué)行為，例如：細(xì)胞周期[3]、脂代謝[4]、細(xì)胞應(yīng)激[5]等，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[10-13]。為了進一步揭示其發(fā)揮功能的具體機制，筆者通過生物信息學(xué)的方法預(yù)測了Tudor-SN蛋白Serine426（S426）、Serine781（S781）、Threonine240 （T240）、Threonine429（T429）為其潛在磷酸化位點，并利用定點突變技術(shù)將上述位點進行突變，然后將含有突變位點的片段連入到pCMV-N-Flag載體中，成功構(gòu)建了pCMV-N-Tudor-SN.Mutants-Flag的重組質(zhì)粒，從而為深入研究Tudor-SN蛋白的結(jié)構(gòu)和功能提供了便利工具。

1　材料和方法

1.1材料基因定點突變試劑盒（Site-directed Gene Mutagenesis Kit）購于碧云天生物技術(shù)有限公司。限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ及T4 DNA連接酶購于Thermo公司。Lipofectamine誖2000、opti-MeM購于Life technology公司。去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購于Omega公司。小量DNA快速膠回收提取試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司。T/A載體（Ptz57R/T）購自上海Takara生物工程公司。載體質(zhì)粒pCMV-N-Flag重組質(zhì)粒（圖1）、PGEX-4T-1-Tudor-SN、大腸桿菌Trans 10及HeLa細(xì)胞均來自本實驗室。

圖1　pCMV-N-Flag質(zhì)粒圖譜Fig 1 Plasmid profile of pCMV-N-Flag

1.2方法

1.2.1 Tudor-SN蛋白潛在磷酸化位點的定點突變及目的片段Tudor-SN.Mutants的獲取按照基因定點突變試劑盒提供的實驗流程，以PGEX-4T-1-Tudor-SN為模板，利用含有突變位點的正、反引物（表1），進行PCR反應(yīng)，條件為：95℃預(yù)變性1 min，以95℃40 s，60℃1 min，68℃1 min進行18個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃終止反應(yīng)。在PCR產(chǎn)物中加入Dpn I酶以切除模板質(zhì)粒，最終獲得4種含有突變位點的質(zhì)粒，即：PGEX -4T -1 -Tudor -SN （S426A）、PGEX-4T-1-Tudor-SN（S781A）、PGEX-4T-1-Tudor-SN（T240A）、PGEX-4T-1- Tudor-SN （T429A）。將該4種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌Trans 10中，37℃，200 r/min條件下?lián)u菌擴增并提取質(zhì)粒。根據(jù)Tudor-SN的全長序列設(shè)計能夠?qū)隕coR I 和BamH I酶切位點的引物（表2），以獲得的4種突變質(zhì)粒為模板進行PCR反應(yīng)，瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，確定目的片段與實際大小相符后，利用膠回收試劑盒回收目的片段。在T4 DNA連接酶催化下，將該目的片段與T/A載體在22℃條件下連接過夜。次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌Trans 10中，將轉(zhuǎn)化好的菌液涂布于含有氨芐的固體培養(yǎng)板上，37℃培養(yǎng)12 h后挑取陽性克隆，搖菌擴增并提取質(zhì)粒。以EcoR I和BamH I對提取的質(zhì)粒進行雙酶切，最后對純化后的目的片段進行膠回收。

1.2.2重組真核質(zhì)粒pCMV-N-Tudor-SN.Mutants-Flag的構(gòu)建對pCMV-N-Flag質(zhì)粒進行EcoR I和BamH I的雙酶切，使其線性化，切下含有目的條帶的凝膠塊，并回收目的片段。在T4 DNA連接酶催化下，將回收的線性化載體與純化后的Tudor-SN.Mutants片段在16℃條件下連接過夜，次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌Trans 10中，以卡那霉素篩選單克隆菌落，挑取單克隆后，37℃搖菌過夜，次日提取質(zhì)粒，并將質(zhì)粒進行EcoR I和BamH I雙酶切鑒定。

表1　突變引物對Tab 1 Mutation primers

表2　Tudor-SN全長引物序列Tab 2 Primer sequences of Tudor-SN

1.2.3重組真核質(zhì)粒pCMV-N-Tudor-SN.Mutants-Flag的表達鑒定HeLa接種于6孔板中，并在37℃，5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度到達60 % ～70 %時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2 h，將原有的含有10%胎牛血清的DMEM換成無血清的DMEM。取6個高壓無菌的1.5 mL離心管，并在每管中加入200 μL 的opti-MeM，隨后各加入pCMV-N-Flag、pCMV-NTudor-SN、pCMV -N -Tudor -SN（S426A）-Flag、pCMV-N-Tudor-SN（S781A）-Flag、pCMV-N-Tudor-SN（T240A）-Flag、pCMV-N-Tudor- SN（T429A）-Flag質(zhì)粒2.5 μg（每個離心管只加入一種質(zhì)粒），最后加入Lipofectamine誖2000（轉(zhuǎn)染試劑）8 μL，輕輕彈勻后靜置15 min。取出細(xì)胞，將混好的液體均勻滴加入孔板中，水平搖勻。7 h后將細(xì)胞培養(yǎng)液換成含有10%胎牛血清的完全培基。48 h后收取細(xì)胞，以RIPA裂解液提取蛋白后，利用Western blot技術(shù)檢測質(zhì)粒表達效率。

2　結(jié)果

2.1 Tudor-SN蛋白潛在磷酸化位點的定點突變及目的片段Tudor-SN.Mutants的獲取以PGEX-4T-1-Tudor-SN為模板，利用能夠引入突變位點的正、反引物進行PCR反應(yīng)，并獲得4種突變質(zhì)粒：PGEX-4T-1-Tudor-SN（S426A）、PGEX-4T-1-Tudor-SN （S781A）、PGEX-4T-1-Tudor-SN（T240A）和PGEX-4T-1-Tudor-SN（T429A），以這4種點突變質(zhì)粒為模板，利用能夠?qū)隕coR I和BamH I酶切位點的引物對目的片段進行擴增（圖2），結(jié)果顯示條帶位于2 700 bp左右，與預(yù)期相符。凝膠回收該片段用以下一步反應(yīng)。

圖2　目的片段Tudor-SN.Mutants的獲取Fig 2 Acquisition of target fragment Tudor-SN.Mutants

2.2線性質(zhì)粒載體的獲取利用EcoR I和BamH I雙酶切pCMV-N-Flag質(zhì)粒，使其線性化。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示該條帶在4 000 bp左右（圖3），與質(zhì)粒的實際大小相符，凝膠回收該片段，用以后續(xù)連接反應(yīng)。

圖3　線性pCMV-N-Flag質(zhì)粒的獲取Fig 3 Acquisition of linear plasmid pCMV-N-Flag

2.3重組真核質(zhì)粒pCMV-N-Tudor-SN.Mutants-Flag的構(gòu)建在T4 DNA連接酶的作用下，將線性pCMV-N-Flag質(zhì)粒與純化后的Tudor-SN.Mutants進行連接，將連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Trans 10中，篩選擴增后提取質(zhì)粒，將該4種質(zhì)粒進行EcoR I和BamH I雙酶切鑒定（圖4），從結(jié)果可以看出產(chǎn)物大小與實際大小相符，證明質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖4　重組質(zhì)粒pCMV-N-Tudor-SN.Mutants-Flag的雙酶切鑒定Fig 4 Identification by restricting double enzyme digestion of recombinant plasmids pCMV-N-Tudor-SN.Mutants-Flag

2.4重組真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表達鑒定在六孔板中轉(zhuǎn)染該種質(zhì)粒，48 h后收取細(xì)胞，利用Western blot技術(shù)檢測質(zhì)粒表達效率（圖5），從結(jié)果可以看出pCMV-N-Tudor-SN.Mutants-Flag在HeLa細(xì)胞可以正常的融合表達。

圖5　重組質(zhì)粒的表達鑒定Fig 5 Identification of recombinant plasmids

3　討論

Tudor-SN蛋白是一種高度保守、廣譜存在的多功能蛋白，可以通過特有的功能結(jié)構(gòu)域參與多個細(xì)胞生物學(xué)過程。例如，在白介素4介導(dǎo)的特異性基因的轉(zhuǎn)錄過程中，Tudor-SN蛋白可以作為STAT6 （signal transducer and activator of transcription 6）的轉(zhuǎn)錄共激活因子與STAT -TAD（transcription activation domain）相結(jié)合，同時Tudor-SN蛋白還可以與RNApolⅡ（RNApolymeraseⅡ）結(jié)合，為STAT6 和RNA polⅡ的相互作用提供橋梁，共同調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄活性[6]。此外，Tudor-SN蛋白能夠與轉(zhuǎn)錄因子c-Myb結(jié)合，參與造血細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的增殖和分化[7]。在周期調(diào)控中，Tudor-SN蛋白通過增強E2F1 （E2F transc ription factor1）與啟動子的結(jié)合，促使E2F1的靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化[3]。同樣，在細(xì)胞應(yīng)激中，Tudor-SN蛋白也發(fā)揮著重要作用。HeLa細(xì)胞在亞砷酸鹽條件下可形成應(yīng)激顆粒，Tudor-SN蛋白通過SN結(jié)構(gòu)域可以與應(yīng)激顆粒組分G3BP蛋白及AGTR1（angiotensinⅡtype 1 receptor 1）的3′UTR（3′untranslated region）相結(jié)合，參與應(yīng)激顆粒的形成[8]。此外，Tudor-SN蛋白與多種疾病的發(fā)病機制密切相關(guān)[9-13]，諸如肺腺癌、腎癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、常染色體顯性遺傳多囊腎病等。

本課題組多年來致力于對Tudor-SN蛋白的多功能性研究，其中特異性位點的磷酸化是筆者很關(guān)注的點。蛋白質(zhì)的磷酸化是蛋白質(zhì)行使生物學(xué)功能的最直接、最重要的方式，例如，在細(xì)胞G2/M期轉(zhuǎn)化的過程中，CDK1(cyclin-dependent kinase 1)的磷酸化扮演了關(guān)鍵性的“分子開關(guān)”的作用[14]，首先與周期蛋白結(jié)合的CDK1在wee1/mik1激酶、CDK活化激酶（CDK1-activiting kinase）和蛋白磷酸水解酶cdc25C的作用下被磷酸化激活，激活的CDK1可以進一步磷酸化多種底物蛋白，包括核仁蛋白[15]、組蛋白[16]、p53[17]等，被磷酸化后的底物蛋白可以行使不同的生物學(xué)功能，促進細(xì)胞由G2期向M期轉(zhuǎn)化。在糖原的代謝中，蛋白質(zhì)磷酸化的聯(lián)級反應(yīng)也發(fā)揮重要作用[18]，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的cAMP（cyclic adenosine monophosphate）升高時，PKA（protein kinase A）被激活，隨后它可以磷酸化糖原磷酸化酶激酶，激活的糖原磷酸化酶激酶又可以磷酸化糖原磷酸化酶，此時糖原磷酸化酶可降解糖原，生成葡糖-1-磷酸，可見，蛋白質(zhì)的磷酸化在各種生理生化反應(yīng)中發(fā)揮著極其重要的作用。

近年來，多種實驗技術(shù)被應(yīng)用到蛋白質(zhì)的磷酸化研究中，其中定點突變是最常用、最重要的技術(shù)之一。它是將已有的DNA序列中，定向改變堿基的實驗技術(shù)，包括堿基對的改變、缺失或插入?，F(xiàn)今，定點突變技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究中。例如，研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，優(yōu)化DNA作用元件，增強酶的作用活性以及提高抗體的穩(wěn)定性等。雖然本課題組前期的利用生物信息學(xué)手段預(yù)測的Tudor-SN蛋白的Serine426（S426）、Serine781（S781）、Threonine240 （T240）、Threonine429（T429）為潛在的磷酸化位點，但是對其磷酸化所行使的生物學(xué)功能則不是很清楚，因此筆者引入了定點突變技術(shù)將上述磷酸化位點都突變?yōu)锳lanine，并成功構(gòu)建了pCMV-N-Tudor-SN （S426A）-Flag、pCMV-N-Tudor- SN（S781A）-Flag、pCMV-N-Tudor-SN（T240A）-Flag、pCMV-N-Tudor-SN（T429A）-Flag的突變質(zhì)粒，為進一步研究Tudor-SN蛋白的多功能性奠定了基礎(chǔ)。

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（2015-10-19收稿）

作者簡介楊文棟（1989-），男，碩士在讀，研究方向：腫瘤免疫；通信作者：何津巖，E- mail：hejinyan@tijmu.edu.cn。

基金項目國家杰出青年基金資助項目（31125012）；教育部“創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃”（IRT13085）；國家自然科學(xué)基金資助項目（31170830、31370749、31571380）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃（青年基金項目）（15JCQNJC09900）

文章編號1006－8147（2016）01-0005-04

中圖分類號Q7

文獻標(biāo)志碼A