趙亞繪，王彥竹，宋麗明，張赫然，王杏林，田　沛（1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津　300070；.天津藥物研究院有限公司，釋藥技術(shù)與藥代動(dòng)力學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津　300193）

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丁酸氯維地平注射乳劑中依地酸二鈉的含量測定

趙亞繪1，2，王彥竹2，宋麗明2，張赫然2，王杏林2，田沛1，2
（1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070；2.天津藥物研究院有限公司，釋藥技術(shù)與藥代動(dòng)力學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300193）

摘要目的：建立測定丁酸氯維地平注射乳劑中微量依地酸二鈉的高效液相色譜法。方法：采用Agilent ZORBAX Extend-C(18)柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），梯度洗脫流動(dòng)相A為0.66 %四丁基氫氧化銨溶液-乙腈（3∶1）（pH6．5），B相為甲醇-水（9∶1），流速為1.0 mL·min(-1)，進(jìn)樣量50 μL，檢測波長為254 nm。結(jié)果：依地酸二鈉峰不受輔料干擾，在8.04～80.37 μg·mL(-1)內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 9），加樣回收率為97.78%（n=9，RSD=0.62%），定量限0.402 μg，供試品中依地酸二鈉含量分別為46.7 μg·mL(-1)、47.0 μg·mL(-1)、49.6 μg·mL(-1)。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確可靠、專屬性強(qiáng)，可用于丁酸氯維地平注射乳劑中依地酸二鈉的含量測定。

關(guān)鍵詞丁酸氯維地平；注射乳劑；依地酸二鈉；高效液相色譜法；含量

Determination of EDTA-2Na in clevidipine butyrate injectable emulsion

ZHAO Ya-hui1,2,WANG Yan-zhu2,SONG Li-ming2,ZHANG He-ran2,WANG Xing-lin2,TIAN Pei1,2
（1．Graduate School，Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2.Tianjin Institute of Pharmaceutical Research Co.,Ltd.State Key Laboratory of Drug Delivery Technology and Pharmacokinetics,Tianjin 300193,China）

Abstract Objective:To establish an HPLC method for determination of tracing EDTA -2Na in clevidipine butyrate injectable emulsion.Methods:The determination was performed on Agilent ZORBAX Extend-C18 column(150 mm×4.6 mm,5 μm)with gradient elution,mobile phase A was 0.66% tetrabutylammonium hydroxide solution-acetonitrile(3:1)(pH was adjusted to 6.5)，and mobile phase B was methanol-water(9:1),the flow rate was 1.0 mL·min-1and the injection volume was 50 μL and the detection wavelength was 254 nm.Results:EDTA-2Na in clevidipine butyrate injectable emulsion could be detected without excipients interfering.Calibration curve was linear range of 8.04-80.37 μg·mL-1(r=0.999 9),the average recovery rate was 97.78%(n=9,RSD=0.62%),and the limit of quantitation was 0.402 μg and the determination of EDTA-2Na in the three batches of tests were 46.7 μg·mL-1，47.0 μg·mL-1，49.6 μg·mL-1respectively.Conclusion:This method is accurate,reliable,exclusive,so it can be used for the determination of EDTA-2Na in clevidipine butyrate injectable emulsion.

Key words clevidipine butyrate;injectable emulsion;EDTA-2Na;HPLC;content

丁酸氯維地平（clevidipine butyrate）屬L型短效二氫吡啶類鈣通道阻滯劑，可選擇性作用于動(dòng)脈血管以實(shí)現(xiàn)精確降壓[1-3]，臨床常用其注射乳劑以減少藥物的血管刺激性[4-5]，實(shí)際生產(chǎn)中常加入適量金屬離子螯合劑EDTA-2Na以提高乳劑穩(wěn)定性，但體內(nèi)Ca2+易與其形成配合物引起骨鈣流失或低血鈣[6]，因此，對注射劑中EDTA-2Na含量進(jìn)行監(jiān)測至關(guān)重要。目前，中國藥典僅收載了EDTA-2Na原料藥的含量測定方法[7]，尚未收錄注射液中EDTA-2Na的控制標(biāo)準(zhǔn)，通常認(rèn)為注射液中EDTA-2Na安全有效濃度為5～100 μg·mL-1[8]。本試驗(yàn)建立了準(zhǔn)確、方便、快速測定丁酸氯維地平注射乳劑中EDTA-2Na含量的高效液相色譜法，為該藥質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1儀器與試藥Agilent 1200高效液相色譜儀（配有四元泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、UV檢測器、ChemStation工作站，美國）；XS205電子分析天平（梅特勒-托利多公司，瑞士）；FE20 pH計(jì)（梅特勒-托利多公司，瑞士）。

丁酸氯維地平注射乳劑（批號(hào)：141110，141111，141112，規(guī)格50 mL:25 mg，自制），空白丁酸氯維地平注射乳劑（不加EDTA-2Na，規(guī)格50 mL:25 mg，自制）；EDTA-2Na對照品（純度99.9 %，中國藥品生物制品檢定所），乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。

1.2方法

1.2.1色譜條件及系統(tǒng)適用性色譜柱Agilent ZORBAX Extend-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相A相為0.66%氫氧化四丁基銨溶液-乙腈（3∶1）（pH6．5），B相為甲醇-水（9∶1），梯度洗脫條件見表1，流速為1.0 mL·min-1，柱溫35℃，檢測波長254 nm，進(jìn)樣體積50 μL，理論板數(shù)按EDTA-2Na峰計(jì)算不低于3 000。

表1　梯度洗脫條件Tab 1 The condition of gradient elution

1.2.2對照品溶液配制取EDTA-2Na對照品適量，精密稱定，加水制成約50 μg·mL-1的溶液。精密量取該溶液1 mL，置50 mL離心管中，加空白丁酸氯維地平注射液（不含EDTA-2Na）9 mL，混合均勻。精密加入混合液[異丙醇-正庚烷（8∶2）]10 mL振搖1 min，再加入25mL正庚烷振搖1min，于5000 r·min-1離心10 min，精密量取下層水相5 mL，置10 mL量瓶中，加入1.0 mL 0.08% Cu（NO3）2溶液，加水至刻度，制得50 μg·mL-1的對照品溶液。

1.2.3供試品溶液配制精密量取丁酸氯維地平注射液10 mL，置50 mL離心管中，按“1.2.2對照品溶液配制”項(xiàng)下自“精密加入混合液”起同法操作。

1.2.4方法專屬性精密量取空白丁酸氯維地平注射液（不含EDTA-2Na）10 mL，置50 mL離心管中，按“1.2.2對照品溶液配制”項(xiàng)下自“精密加入混合液”起同法操作，制得空白溶液。分別取空白溶液、對照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。

1.2.5線性關(guān)系考察精密稱定EDTA-2Na對照品50 mg，置50 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得1 mg·mL-1的對照品儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液2、3、5、7、8 mL置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。再精密量取配制好的800 μg·mL-1EDTA-2Na溶液1mL置于10mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，得到200、300、500、700、800、80μg·mL-1的EDTA-2Na溶液。精密量取上述溶液1 mL，按“1.2.2對照品溶液制備”項(xiàng)下同法操作，以EDTA-2Na濃度(C)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6耐用性試驗(yàn)分別改變流動(dòng)相流速（1.1、0.9 mL·min-1）、柱溫（32℃、38℃）、緩沖液pH（pH 6.4和7.0）、檢測波長（250 nm、260 nm），其他條件不變，評(píng)估測定條件發(fā)生微小變動(dòng)時(shí)測定結(jié)果不受影響的承受程度。

1.2.7定量限以信噪比10∶1對應(yīng)濃度為定量限，取EDTA-2Na的對照溶液逐級(jí)稀釋，各精密量取1mL，同“1.2.2對照品溶液配制”項(xiàng)下操作，記錄色譜圖。

1.2.8精密度試驗(yàn)按“1.2.2對照品溶液配制”項(xiàng)下制備對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算RSD。

1.2.9重復(fù)性試驗(yàn)取丁酸氯維地平注射乳劑（141110批），按“1.2.3供試品溶液配制”項(xiàng)下制備6份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣，計(jì)算RSD。

1.2.10穩(wěn)定性試驗(yàn)取對照品溶液，分別于0、5、12和24 h測定EDTA-2Na峰面積。取供試品溶液，分別于0、4和16 h測定EDTA-2Na峰面積。

1.2.11回收率精密稱取EDTA-2Na對照品適量，配制4.0、5.0、6.0 mg·mL-1的EDTA-2Na水溶液，分別精密量取100 μL上述溶液置于50 mL離心管中（即加入樣品量的80%、100%和120%），量取丁酸氯維地平注射液10 mL，置50 mL離心管中，按“1.2.2對照品溶液配制”項(xiàng)下自“精密加入混合液”同法操作，制得回收液。每個(gè)濃度樣品平行測3份，計(jì)算EDTA-2Na含量及回收率。

1.2.12供試品中EDTA-2Na含量測定取不同批號(hào)丁酸氯維地平注射液(141110、141111、141112)按“1.2.2供試品溶液配制”項(xiàng)下方法配制，平行3次測定EDTA-2Na含量。

2　結(jié)果

2.1方法專屬性空白溶液、對照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣測定結(jié)果見圖1，結(jié)果表明EDTA-2Na峰不受其他組分干擾，該法專屬性良好。

圖1　專屬性HPLC色譜圖Fig1 Specificity tests for HPLC chromatograms

2.2線性關(guān)系考察結(jié)果以EDTA-2Na濃度（C）為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A=8.7099C+6.8851（r＝0．999 9）。結(jié)果表明，在8.04～80.37 μg·mL-1范圍內(nèi)，EDTA-2Na濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3耐用性試驗(yàn)結(jié)果見圖2。正常情況下EDTA-2Na保留時(shí)間約6.0 min，當(dāng)流速為1.1 mL·min-1，EDTA-2Na出峰稍提前，流速0.9 mL·min-1時(shí)出峰稍延后，但均屬合理范圍且峰型基本不變；流動(dòng)相pH為6.4和7.0時(shí)，EDTA-2Na與其它成分的分離效果較好，但低于6.4時(shí)EDTA-2Na峰與溶劑峰重合，保留時(shí)間顯著增加；柱溫及檢測波長稍變動(dòng)時(shí)，EDTA-2Na的保留時(shí)間及峰型均基本不變，且理論板數(shù)均大于5 000，因此，本法耐用性良好。

圖2　方法的耐用性試驗(yàn)Fig2 The durability test

2.4定量限結(jié)果當(dāng)對照品濃度為8.04 μg·mL-1時(shí)其信噪比約為10∶1，EDTA-2Na定量限為0.402μg。

2.5精密度試驗(yàn)結(jié)果對照品中EDTA-2Na平均含量為49.4 μg·mL-1，RSD為1.47 %，說明該法精密度良好。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果141110批丁酸氯維地平注射乳劑中EDTA-2Na平均含量為46.8 μg·mL-1，RSD為0.07%，說明該法重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果EDTA-2Na對照品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定，峰面積的RSD為0.7 %，EDTA-2Na供試品溶液在室溫條件下16 h內(nèi)穩(wěn)定，峰面積的RSD為0.5 %，符合要求。

2.8回收率結(jié)果見表2。平均回收率為97.78%（RSD=0.62%,n=9）。

表2　加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=9)Tab 2 Results of recovery(n=9)

2.9供試品中EDTA-2Na含量測定結(jié)果3批丁酸氯維地平注射液（141110、141111、141112）中EDTA-2Na含量分別為46.7 μg·mL-1、47.0 μg·mL-1、49.6 μg·mL-1，均在含量限度范圍內(nèi)（5～100 μg·mL-1），符合輔料安全原則。

3　討論

3.1回收率對定量的影響對照品及供試品溶液配制過程中異丙醇-正庚烷起到破乳及萃取作用，離心加速油水分層，以便準(zhǔn)確量取溶有EDTA-2Na的水層，但實(shí)際操作中不可避免的有EDTA-2Na損失。直接以EDTA-2Na水溶液為對照的預(yù)試驗(yàn)存在回收率不足（低于90%）的問題，因此，在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，先向?qū)φ掌匪芤褐屑尤肟瞻锥∷崧染S地平微乳，然后破乳萃取，使對照溶液與供試品溶液制備過程保持一致，以便利用外標(biāo)法相對準(zhǔn)確計(jì)算供試品中EDTA-2Na的實(shí)際濃度，該法準(zhǔn)確度及回收率顯著提高（97.78%，n=9，RSD=0.62%）。

3.2流動(dòng)相pH選擇及梯度條件優(yōu)化EDTA合銅離子與等摩爾的氫氧化四丁基銨定量反應(yīng)，流動(dòng)相pH是該定量反應(yīng)關(guān)鍵，酸度較大時(shí)，H+競爭性的結(jié)合EDTA合銅離子，使離子對作用減弱，峰型變差；流動(dòng)相堿度較大時(shí)易減少色譜柱和液相系統(tǒng)使用壽命，因此，實(shí)驗(yàn)將流動(dòng)相A相調(diào)至近中性，同時(shí)采用梯度洗脫充分、及時(shí)洗脫水相中殘余的脂肪酸，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)等度洗脫柱效惡化，峰型拖尾等不足。

本試驗(yàn)采用優(yōu)化的梯度洗脫結(jié)合全面的方法學(xué)驗(yàn)證，建立了可靠、高效、專屬性強(qiáng)的測定丁酸氯維地平注射乳劑中微量EDTA-2Na的HPLC法，該法也為其他藥品中EDTA-2Na含量監(jiān)測提供了思路和依據(jù)。

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（2015-08-25收稿）

基金項(xiàng)目國家重大新藥創(chuàng)制課題基金資助(2014ZX09507005- 001)

作者簡介趙亞繪(1990-)，女，碩士在讀，研究方向：藥物制劑；通信作者:王杏林，E- mail:wangxl@tjipr.com。

文章編號(hào)1006－8147（2016）01-0073-03

中圖分類號(hào)R927.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A