劉　倩，胡　芳，牛文彥（天津醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系，天津　300070）

?

AMPK腺病毒載體在小鼠骨骼肌中的表達(dá)和作用

劉倩，胡芳，牛文彥
（天津醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系，天津300070）

摘要目的：探討注射AMPK腺病毒在小鼠骨骼肌中的表達(dá)和作用。方法：C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組:（1）無任何處理的空白對照組。（2）肌肉注射腺病毒空載體（Ad-GFP）組。（3）肌肉注射Ad-GFP，48 h后腹腔注射AMPK激活劑AICAR組。（4）肌肉注射GFP標(biāo)記的激活型AMPK腺病毒（Ad-AMPK-CA）組。注射腺病毒72 h后，處死小鼠，通過小動物成像系統(tǒng)測定骨骼肌中的熒光強(qiáng)度，檢測腺病毒的表達(dá)，用Western blot方法檢測ACC的磷酸化。結(jié)果：與空白對照組比較，注射腺病毒組的平均熒光強(qiáng)度顯著增高。與病毒空載體組比較，注射AICAR組和Ad-AMPK-CA組的ACC磷酸化水平顯著升高。結(jié)論：AMPK腺病毒能在小鼠骨骼肌中表達(dá)目的蛋白，調(diào)節(jié)AMPK的作用。

關(guān)鍵詞AMPK；腺病毒；小鼠；骨骼肌

Effect and expression of AMPK adenovirus on mouse skeletal muscle

LIU Qian,HU Fang,NIU Wen-yan
（Department of Immunology,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China）

Abstract Objective:To explore the effect and expression of injected AMPK adenovirus on mouse skeletal muscle.Methods:Ten weeks old C57BL/6 male mice were randomly divided into four groups.Mice in group1 were normal control group without treatment.Mice in group 2 were intramuscularly injected green fluorescence protein adenovirus(Ad-GFP).Mice in group 3 were intramuscularly injected Ad-GFP,after which were intraperitoneally injected AMPK activator AICAR in 48 h.Mice in group 4 were intramuscularly injected Ad-AMPK-CA.Seventy two hours after adenovirus treatment,all mice were executed and the expression of adenovirus was analysed in skeletal muscle.Fluorescence intensity and ACC phosphorylation in skeletal muscle were analysed by vivo imaging system and western blot,respectively.Results:Compared with the control group,the mean fluorescence intensity of the experimental groups which were injected adenovirus was significantly higher.Compared with the Ad-GFP group,ACC phosphorylation of AICAR and Ad-AMPK-CA groups were significantly increased.Conclusion:AMPK adenovirus can express the target protein in mouse skeletal muscle,and regulate the activity of AMPK.

Key words AMPK；adenovirus；mouse；skeletal muscle

2型糖尿病以葡萄糖代謝異常為特征，主要發(fā)病機(jī)制是胰島素抵抗[1-2]，肥胖是其主要誘因。通過非胰島素依賴機(jī)制促進(jìn)外周組織對葡萄糖的攝取和脂肪酸的氧化是2型糖尿病治療的關(guān)鍵。單磷酸腺苷（AMP）激活的蛋白激酶（AMPK）是能量代謝和響應(yīng)外部刺激的一個關(guān)鍵的調(diào)節(jié)器[3]。它是由一個催化亞基（α）和兩個調(diào)節(jié)亞基（β，γ）組成的異三聚體酶[4]。在營養(yǎng)缺乏和病毒感染時(shí)，升高胞內(nèi)AMP / ATP比值和活化一些上游激酶來激活A(yù)MPK，導(dǎo)致α亞基中的蘇氨酸172的磷酸化增加，激活A(yù)MPK[5]。當(dāng)AMPK被激活時(shí)，通過調(diào)節(jié)下游的信號通路，例如，AMPK直接磷酸化乙酰-CoA羧化酶（ACC）和HMG-CoA還原酶（HMGCR），能抑制合成代謝，并促進(jìn)分解代謝，增加骨骼肌對葡萄糖的攝取，增強(qiáng)脂肪酸的氧化作用和胰島素的敏感性，因此AMPK及其信號通路已成為2型糖尿病的預(yù)防和治療的熱點(diǎn)。本研究通過在C57BL/6小鼠中注射激活型AMPK腺病毒，檢測腺病毒在小鼠體內(nèi)的表達(dá)和作用，為進(jìn)一步在體內(nèi)研究AMPK信號通路奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料C57BL/6小鼠購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心,普通飼料購自美國Research Diets公司，HEK293β5細(xì)胞和AMPK激活型腺病毒重組質(zhì)粒（Ad-AMPK-CA)由廈門大學(xué)林圣彩教授實(shí)驗(yàn)室贈與，DMEM高糖購自美國Gibco公司，胎牛血清購自以色列Bioind公司，抗磷酸化ACC和GPADH抗體購于Cell Signaling Technology，試劑AICAR購自Enzo公司，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光底物檢測試劑盒購自美國Millipore公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)HEK293β5細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 AMPK腺病毒的包裝和擴(kuò)增轉(zhuǎn)染前24 h，HEK293細(xì)胞接種在60 mm培養(yǎng)皿中，接種密度為50%～70%。5 μg鑒定好的重組病毒質(zhì)粒通過Pac I單酶切處理。將單酶切線性化的重組腺病毒質(zhì)粒用乙醇沉淀，離心棄上清。待乙醇揮發(fā)完全后，用10μL無菌水重懸質(zhì)粒。處理過的質(zhì)粒用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染完8 h后換液，換液用10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后7～10 d，收集細(xì)胞，離心棄上清，加入2 mL 10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞。通過液氮/37℃反復(fù)凍融3次，讓病毒釋放，離心提取含腺病毒的上清。分裝保存于-80℃冰箱。在60 mm培養(yǎng)皿中接種HEK293細(xì)胞，細(xì)胞密度達(dá)70%，加入10 μL上述收集的腺病毒上清液，感染72 h后，可出現(xiàn)細(xì)胞變圓、破裂、漂浮的病變現(xiàn)象。當(dāng)50%以上的細(xì)胞出現(xiàn)漂浮時(shí)，可沖勻收集細(xì)胞，液氮反復(fù)凍融3次。離心提取上清液，完成病毒擴(kuò)增。用第一輪裂解的病毒上清液感染HEK293細(xì)胞即可得到第2輪的病毒。

1.2.3小鼠分組和處理SPF級6周齡雄性C57BL/6小鼠23只，用脂肪含量10%的普通飼料喂養(yǎng)小鼠，小鼠自由飲食飲水，飼養(yǎng)在溫度（22±2）℃、濕度（55±10）%、12 h照明/非照明循環(huán)房間。喂養(yǎng)至10周，體質(zhì)量達(dá)（23.50±0.78)g，隨機(jī)分為4組:（1）無任何處理的空白對照組（3只）。（2）肌肉注射腺病毒空載體（Ad-GFP）對照組（5只）。（3）肌肉注射Ad-GFP，48 h后腹腔注射AMPK激活劑AICAR組（5只）。（4）肌肉注射GFP標(biāo)記的激活型AMPK腺病毒（Ad-AMPK-CA）組（5只）。腺病毒注射量為110 μL/只，AICAR為150 mg/只。腺病毒注射72 h后處死小鼠，取骨骼肌肉。

1.2.4體內(nèi)分布檢測用小動物成像系統(tǒng)對肌肉組織進(jìn)行熒光定量分析，從而確定腺病毒在小鼠骨骼肌的表達(dá)。

1.2.5免疫印記檢測ACC的磷酸化裂解肌肉組織，將肌肉組織切成小塊移至冷的Eppendorf管中，用預(yù)冷的PBS緩沖液清洗肌肉組織2次。0.1 g肌肉組織中加入500 μL含蛋白酶抑制劑（1 mmol/L Na3VO4，1 μmol/L PIC，200 μmol/L PMSF，0.5 mmol/L NaF）的組織裂解液，用超聲勻漿破碎機(jī)裂解組織樣品。預(yù)冷離心機(jī)至4℃，13 000 r/min離心10 min，收集上清，重復(fù)兩次。按照BCA Protein Assay Kit說明書來測定蛋白濃度，再與5×LSB緩沖液按4∶1的比例混合，65℃加熱15 min，7.5%（V/V）SDS-PAGE電泳分離蛋白樣品，轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用3%牛血清蛋白封閉2 h，再分別用各自一抗4℃孵育過夜，二抗使用偶聯(lián)辣根過氧化物酶HRP的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgM孵育2 h，蛋白條帶用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測，曝光膠片。用GAPDH作為內(nèi)參，Image J軟件定量，即可檢測蛋白的磷酸化水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism6統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變顯微鏡下觀察正常HEK293細(xì)胞為多角形，觸角相連呈網(wǎng)狀貼壁生長。腺病毒感染HEK293細(xì)胞后，細(xì)胞變圓，觸角消失，部分細(xì)胞破碎漂浮，未脫落細(xì)胞有聚集融合（圖1）。

圖1　腺病毒載體感染細(xì)胞后形態(tài)改變Fig 1 Morphological changes in HEK293 cells infected with adenovirus

2.2 GFP熒光標(biāo)記的腺病毒在骨骼肌中的檢測結(jié)果腺病毒質(zhì)粒中帶有綠色熒光蛋白GFP，可以對腺病毒的感染表達(dá)進(jìn)行追蹤觀察。收取小鼠骨骼肌肉組織，通過小動物活體成像系統(tǒng)，檢測肌肉中GFP標(biāo)記的腺病毒的熒光強(qiáng)度，確定腺病毒感染到小鼠組織中。如圖2所示，以未注射病毒的小鼠組織為背景對照組，注射腺病毒實(shí)驗(yàn)組的小鼠骨骼肌中能檢測出熒光強(qiáng)度，通過熒光定量分析與背景對照組比較有顯著差異（圖3），說明腺病毒已轉(zhuǎn)染到小鼠肌肉組織中。

2.3 Western blot檢測磷酸化ACC水平檢測了AMPK的下游ACC的磷酸化水平以判斷激活A(yù)MPK的效果，確保在小鼠體內(nèi)發(fā)揮作用。如圖4所示，AICAR是AMPK的激活劑，與病毒空載體對照組比較，注射AICAR的實(shí)驗(yàn)組磷酸化ACC水平升高，為對照組的（1.51±0.15）倍（P<0.01），注射Ad-AMPK-CA組的磷酸化ACC水平上升至對照組的（1.91±0.09）倍（P<0.001）。

圖2　GFP在骨骼肌中的表達(dá)Fig 2 Expression of green fluorescence protein in skeletal muscle

圖3　骨骼肌中熒光定量分析結(jié)果Fig 3 The mean fluorescence intensity in skeletal muscle

圖4　骨骼肌中磷酸化ACC蛋白的表達(dá)Fig 4 The phosphorylation of ACC in mouse skeletal muscle

3　討論

糖尿病已成為一個重大的公共健康問題，預(yù)計(jì)到2030年，其發(fā)病率將達(dá)到7.7%，患病人數(shù)將增加至4.39億[6]。2型糖尿病是其最常見的形式，其特征是胰島素抵抗，骨骼肌減少了對胰島素的敏感性是重要原因[7-8]。骨骼肌是利用葡萄糖的主要外周組織，AMPK的活化能促進(jìn)骨骼肌攝取葡萄糖。AMPK是一個絲氨酸/蘇氨酸磷酸激酶，AMPK的α亞型具有催化活性。α1亞型廣泛表達(dá)，而α2亞型在肝臟、心臟和骨骼肌中高表達(dá)[9]。Thr172是AMPKα亞型的主要的磷酸化位點(diǎn)，其磷酸化是AMPK催化活性必不可少的。肌肉收縮和運(yùn)動能激活A(yù)MPK[10]。本實(shí)驗(yàn)中Ad-AMPK-CA突變位點(diǎn)在T142，而AMPK抗體檢測的磷酸化位點(diǎn)在Thr172，因此需要檢測AMPK下游蛋白的磷酸化水平判斷AMPK的活性。ACC是存在于胞液中的變構(gòu)羧化酶，通過生物素羧化酶功能和羧基轉(zhuǎn)移酶功能催化乙酰輔酶A生成丙二酸單酰輔酶A，是脂肪酸代謝的限速酶，是AMPK的下游分子[11-12]。激活A(yù)MPK進(jìn)而使ACC磷酸化增加，活性降低。5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸（AICAR）是細(xì)胞可滲透腺苷類似物，通過腺苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能被細(xì)胞吸收，腺苷激酶快速磷酸化，形成5-氨基咪唑-4-甲酰胺-1-β-D-呋喃核糖苷（ZMP），通過模擬放大作用增加AMPK的活性[13]，在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中作為一種激活A(yù)MPK的工具。本實(shí)驗(yàn)中，Ad-AMPK-CA和AICAR都顯著升高小鼠骨骼肌ACC的磷酸化水平，說明二者在小鼠體內(nèi)發(fā)揮著增加AMPK活性的作用。

在基因工程中所運(yùn)用的病毒載體是一種定向或非定向的載體，來源于病毒的DNA或者RNA基因組。RNA病毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，應(yīng)用廣泛的是慢病毒。慢病毒載體是指以HIV-1來源的一種病毒載體[14]，能夠感染多種難感染的細(xì)胞，比如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞等。慢病毒能夠?qū)⑼庠椿虿迦爰?xì)胞基因組內(nèi)，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，但是重組病毒的滴度不夠高，而且有導(dǎo)致基因突變的危險(xiǎn)。DNA的病毒載體中，應(yīng)用廣泛的是腺病毒和腺相關(guān)病毒。腺病毒相對穩(wěn)定，可以長時(shí)間冷凍儲存而不失去感染能力，可以有效地轉(zhuǎn)染各種細(xì)胞類型和組織[15]，易于基因重組操作，繁殖滴度高，安全性好，發(fā)生插入突變率低。穿梭質(zhì)粒中含有編碼GFP的序列，方便追蹤檢測[16]。本實(shí)驗(yàn)中AMPK腺病毒和腺病毒空載體均含有GFP熒光蛋白，小動物活體成像采用熒光報(bào)告基團(tuán)GFP進(jìn)行標(biāo)記，通過激發(fā)光激發(fā)熒光基團(tuán)到達(dá)高能量狀態(tài)，而后產(chǎn)生發(fā)射光，通過后期的特有的軟件處理，有效地除去動物自身所發(fā)出的熒光信號，對肌肉組織進(jìn)行定性和定量分析。通過小動物成像和熒光強(qiáng)度定量分析結(jié)果表明，AMPK腺病毒成功轉(zhuǎn)染至小鼠骨骼肌中。

綜上所述，肌肉多部位注射AMPK腺病毒能感染至小鼠骨骼肌中，并且能夠表達(dá)目的蛋白，調(diào)節(jié)AMPK的活性。AMPK腺病毒可作為一種實(shí)驗(yàn)方法，用于AMPK的體內(nèi)研究。

參考文獻(xiàn):

[1]Klip A,Ramlal T,Young D A,et al.Insulin-induced translocation of glucose transporters in rat hindlimb muscles[J].FEBS Lett,1987,224（1）:224

[2]Lund S,Holman G D,Schmitz O,et al.Contraction stimulates translocation of glucose transporter GLUT4 in skeletal muscle through a mechanism distinct from that of insulin[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1995,92（13）:5817

[3]Krabbe K S,Nielsen A R,Krogh-Madsen R,et al.Brain-derived neurotrophic factor（BDNF）and type 2 diabetes[J].Diabetologia,2007,50（2）:431

[4]Xie W,Wang L,Dai Q,et al.Activation of AMPK restricts coxsackievirus B3 replication by inhibiting lipid accumulation[J].J Mol Cell Cardiol,2015,85（8）:155

[5]Mihaylova M M,Shaw R J.The AMPK signalling pathway coordinates cell growth,autophagy and metabolism[J].Nat Cell Biol,2011,13（9）:1016

[6]Shi L,Zhang T,Liang X,et al.Dihydromyricetin improves skeletal muscle insulin resistance by inducing autophagy via the AMPK signaling pathway[J].Mol Cell Endocrinol,2015,409(6):92

[7]Tunduguru R,Chiu T T,Ramalingam L,et al.Signaling of the p21-activated kinase（PAK1）coordinates insulin -stimulated actin remodeling and glucose uptake in skeletal muscle cells[J].Biochem Pharmacol,2014,92（2）:380

[8]Xiao B,Sanders M J,Underwood E,et al.Structure of mammalian AMPK and its regulation by ADP[J].Nature,2011,472（7342）:230[9]Niesler C U,Myburgh K H,Moore F.The changing AMPK expression profile in differentiating mouse skeletal muscle myoblast cells helps confer increasing resistance to apoptosis[J].Exp Physiol,2007,92（1）:207

[10]O’neill H M,Maarbjerg S J,Crane J D,et al.AMP-activated protein kinase（AMPK）beta1beta2 muscle null mice reveal an essential role for AMPK in maintaining mitochondrial content and glucose uptake duringexercise[J].Proc Natl Acad Sci USA,2011,108（38）:16092

[11]Choi J W,Da Silva N A.Improving polyketide and fatty acid synthesis by engineering of the yeast acetyl-CoA carboxylase[J].J Biotechnol,2014,187:56

[12]Zordoky B N,Nagendran J,Pulinilkunnil T,et al.AMPK-dependent inhibitory phosphorylation of ACC is not essential for maintaining myocardial fatty acid oxidation[J].Circ Res,2014,115（5）:518

[13]Gadalla A E,Pearson T,Currie A J,et al.AICA riboside both activates AMP -activated protein kinase and competes with adenosine for the nucleoside transporter in the CA1 region of the rat hippocampus[J].J Neurochem,2004,88（5）:1272

[14]Katzourakis A,Tristem M,Pybus O G,et al.Discovery and analysis of the first endogenous lentivirus[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2007,104（15）:6261

[15]Khare R,Chen C Y,Weaver E A,et al.Advances and future challenges in adenoviral vector pharmacology and targeting[J].Curr Gene Ther,2011,11（4）:241

[16]Li X,Liu Q,Bi X,et al.An in vitro model to evaluate virus aerosol characteristicsusingaGFP-expressingadenovirus[J].JMedMicrobiol,2008,57（Pt 11）:1335

（2015-08-16收稿）

關(guān)于醫(yī)學(xué)符號的使用

統(tǒng)計(jì)學(xué)符號不論用哪種字母，也不論大寫或小寫一律都用斜體。要注意區(qū)分拉丁字母和希臘字母。例如均數(shù)的符號是字母，卡方的符號是希臘字母χ2，自由度的符號是希臘文“υ”，不是拉丁文“V”。樣本的相關(guān)系數(shù)是英文“r”，不能誤為希臘文“γ”。

化學(xué)元素及核素在醫(yī)學(xué)寫作時(shí)一般多采用符號，都是拉丁字母正體大寫。離子態(tài)是在右上角用數(shù)字加“-”或“+”表示。例如Na+、Ca2+、P3-等等，不采用Ca++、P---、Al+3、O-2表示。核素的核子素（質(zhì)量數(shù)）應(yīng)寫在元素符號的左上角，例如131I、32P。表示激發(fā)狀態(tài)的m寫在右上角，例如：99Tcm、133Inm。在科技論文和專著中不應(yīng)寫核素的中文名稱，即不能寫成131碘、133銦m等。

近幾年分子生物學(xué)發(fā)展很快，并已滲透到許多學(xué)科，大多數(shù)分子生物學(xué)名詞術(shù)語的符號已有統(tǒng)一的確定形式，要對符號的來源及其內(nèi)涵有深刻的了解，使用時(shí)不致發(fā)生錯誤，例如：RNA有rRNA（ribosonal RNA）、tRNA（transfer RNA）、mRNA（messenger RNA）3類。r、t、m是表示類型的符號應(yīng)小寫，RNA應(yīng)大寫。

（編輯部）

作者簡介劉倩（1989-），女，碩士在讀，研究方向：免疫學(xué)；通信作者：牛文彥，E- mail：wniu@tijmu.edu.cn。

基金項(xiàng)目國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目基金資助（81170740）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)基金（20121202110014）；天津市科委應(yīng)用基礎(chǔ)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（15JCZDJC35500）

文章編號1006－8147（2016）01-0001-04

中圖分類號R392.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A