孫淑娜　姚澤忠　蔣　璆　桂永浩

(1復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院心內(nèi)科　上?！?01102; 2上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院兒科　上海　201199;

3上海市心血管病研究所　上?！?00032)

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葉酸挽救乙醇致斑馬魚(yú)胚胎心臟和流出道發(fā)育異常

孫淑娜1,2姚澤忠2蔣璆3桂永浩1△

(1復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院心內(nèi)科上海201102;2上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院兒科上海201199;

3上海市心血管病研究所上海200032)

【摘要】目的觀察乙醇對(duì)斑馬魚(yú)胚胎心臟和流出道發(fā)育的干擾作用,并初步探討葉酸挽救乙醇所致心臟和流出道發(fā)育異常的最佳時(shí)段和可能機(jī)制。方法在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育不同時(shí)段予以乙醇處理,觀察胚胎的發(fā)育異常情況。將受精后7～12 h被予以乙醇組定義為乙醇處理組。在乙醇處理組胚胎的發(fā)育不同時(shí)段給予外源性葉酸進(jìn)行葉酸挽救實(shí)驗(yàn),觀察各葉酸干預(yù)組胚胎的發(fā)育狀況,探尋葉酸挽救的最佳時(shí)段。將受精后7～12 h給予葉酸組定義為葉酸挽救組。觀察并統(tǒng)計(jì)乙醇處理組以及葉酸挽救組的胚胎發(fā)育異常百分比、存活百分比、心臟和流出道形態(tài)及其異常百分比、心率、心室收縮指數(shù)等指標(biāo)來(lái)評(píng)估胚胎的發(fā)育狀況。利用熒光顯微造影的方法探查心臟流出道形態(tài),采用胚胎整體原位雜交和Real-time PCR 方法檢測(cè)胚胎bmp2b、tbx1的表達(dá)情況。結(jié)果乙醇可干擾胚胎發(fā)育,乙醇處理組胚胎存在明顯心臟和流出道形態(tài)異常以及心功能損害,在胚胎發(fā)育早期乙醇的干擾作用最明顯。給予外源性葉酸能挽救乙醇導(dǎo)致的胚胎發(fā)育異常,在胚胎受精后7～12 h葉酸挽救作用最顯著。乙醇處理組胚胎心臟和流出道的bmp2b、tbx1表達(dá)下降;予以葉酸干預(yù)后,乙醇處理組胚胎bmp2b和tbx1表達(dá)水平上調(diào)。結(jié)論葉酸能有效挽救乙醇導(dǎo)致的心臟和流出道發(fā)育異常,其機(jī)制可能是上調(diào)乙醇處理組胚胎bmp2b、tbx1的表達(dá)水平。

【關(guān)鍵詞】葉酸;乙醇;心臟;流出道;斑馬魚(yú);bmp2b;tbx1

*This work was supported by Youth Research Fund of Shanghai Municipal Health Bureau (20124y086) and Opening Project of Key Laboratory of Birth Defects Prevention in Shanghai.

先天性心臟病是胚胎時(shí)期心血管系統(tǒng)發(fā)育異常所導(dǎo)致的先天性疾病,嚴(yán)重危害兒童生命和健康,其發(fā)病率在活產(chǎn)嬰兒中約為6‰～8‰。先天性心臟病環(huán)境致病因素中的乙醇攝入不容忽視。婦女妊娠期間攝入乙醇過(guò)量對(duì)胚胎發(fā)育有嚴(yán)重影響,可導(dǎo)致胎兒酒精綜合征,表現(xiàn)為心血管系統(tǒng)發(fā)育障礙、胚胎頭面部畸形和神經(jīng)系統(tǒng)損傷。心血管系統(tǒng)發(fā)育異常在胎兒酒精綜合征患兒中發(fā)生率較高[1]。目前乙醇導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常的確切機(jī)制尚未完全闡明,探尋有效的方法挽救妊娠期孕母乙醇攝入所致胚胎發(fā)育異常逐漸成為研究熱點(diǎn)。

葉酸在生物生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中扮演重要的角色,它參與生物體內(nèi)許多重要反應(yīng)和重要物質(zhì)的合成。有研究表明,通過(guò)抑制二氫葉酸還原酶功能而使葉酸生物學(xué)活性受抑后可導(dǎo)致心臟發(fā)育障礙,且心臟發(fā)育關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子bmp2b以及tbx1的表達(dá)水平下調(diào)[2-3]。人群中母親懷孕期間予以補(bǔ)充適量的葉酸可降低子代發(fā)生先天性心臟病的風(fēng)險(xiǎn)[4]。在小鼠中葉酸可降低胚胎酒精綜合征的發(fā)生[5],在斑馬魚(yú)中葉酸可挽救乙醇導(dǎo)致的視網(wǎng)膜等發(fā)育異常[6]。但目前圍繞葉酸挽救乙醇所致胚胎心血管系統(tǒng)發(fā)育異常的最佳時(shí)段及其相關(guān)機(jī)制研究較少。本研究旨在觀察乙醇對(duì)胚胎發(fā)育的干擾作用,并探尋葉酸挽救乙醇所致胚胎心血管系統(tǒng)發(fā)育異常的最佳時(shí)期,并通過(guò)檢測(cè)心血管發(fā)育密切轉(zhuǎn)錄因子bmp2b以及tbx1的表達(dá)水平進(jìn)行初步機(jī)制探討,為臨床合理預(yù)防乙醇所致先天性心臟病提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物斑馬魚(yú)受精卵按照Kimmel等[7]描述對(duì)發(fā)育階段分期,受精卵置于孵化液(60μg/mL海鹽)28 ℃孵化,出絨毛膜后在胚胎培養(yǎng)液內(nèi)養(yǎng)育,每天更換胚胎培養(yǎng)液。用于原位雜交的胚胎在24 hpf(hours post fertilization,受精后小時(shí)數(shù))開(kāi)始用0.003%苯硫脲處理以防止黑色素的形成。

乙醇處理將乙醇溶解于胚胎培養(yǎng)液內(nèi),根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選用250 mmol/L的乙醇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在胚胎如下不同發(fā)育階段予以乙醇：0～6 hpf、7～12 hpf、13～18 hpf、19～24 hpf、25～30 hpf、31～36 hpf、37～42 hpf、43～48 hpf。每組100枚胚胎,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,設(shè)正常對(duì)照組胚胎100枚。

給予外源性葉酸將葉酸(購(gòu)自Sigma公司,美國(guó))溶解于胚胎培養(yǎng)液內(nèi)配成5 mmol/L葉酸溶液。將7～12 hpf乙醇處理組胚胎分別在如下發(fā)育的不同階段給予外源性葉酸： 0～6 hpf、7～12 hpf、13～18 hpf、19～24 hpf、25～30 hpf、31～36 hpf、37～42 hpf、43～48 hpf。每組100枚胚胎,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,設(shè)正常對(duì)照組胚胎100枚。

胚胎整體發(fā)育情況的觀察在顯微鏡下觀察各組胚胎整體發(fā)育情況,記錄各組胚胎存活個(gè)體百分比以及發(fā)育異常百分比。死亡個(gè)體也列入發(fā)育異常個(gè)體計(jì)數(shù)中。

心臟及流出道發(fā)育情況的觀察在胚胎發(fā)育至48 hpf時(shí),在顯微鏡下觀察對(duì)照組、乙醇處理組、葉酸挽救組胚胎的心臟發(fā)育形態(tài),并記錄各組心臟發(fā)育異常個(gè)體百分比,每組20枚胚胎,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。在48 hpf和60 hpf時(shí)統(tǒng)計(jì)各組胚胎的心率以及心室收縮指數(shù)(VSF),每組20枚胚胎。

另在上述各組胚胎發(fā)育至60 hpf時(shí)向胚胎心臟內(nèi)注射3 nL熒光素,在熒光顯微鏡下觀察胚胎心臟流出道的發(fā)育情況并記錄各組心臟流出道發(fā)育異常個(gè)體百分比。每組20枚胚胎,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

基因探針制備及胚胎整體原位雜交抽提各組斑馬魚(yú)胚胎總mRNA后,經(jīng)RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。采用Primer3軟件設(shè)計(jì)引物,以逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增特異性基因序列作為原位雜交的探針片段。將PCR產(chǎn)物切膠回收,克隆入PGEM-T載體中,經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后,獲得含有目的基因cDNA片段的質(zhì)粒,利用內(nèi)切酶將其線性化后,體外轉(zhuǎn)錄反義RNA探針(地高辛標(biāo)記)。進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn)時(shí)每組各20枚胚胎,每組重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。構(gòu)建基因探針及原位雜交所用試劑主要購(gòu)自Promega 公司、美國(guó)羅氏公司、Takara公司。

Real-time PCR抽提斑馬魚(yú)48 hpf的總mRNA,經(jīng)RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。采用Primer3軟件設(shè)計(jì)引物,由Sangon生物公司合成。bmp2b引物：F:5′-CTTCCTCCTCCGAGGCTT-3′,R:5′-ACTGGCATCTCCGAGAACTT-3′。tbx1引物：F:5′-GAGACTGTGATCCCGAGGAC-3′,R:5′-TCATGATTTGTAGCGAGCCT-3′。以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增,以β-actin 作為內(nèi)參對(duì)照,每個(gè)樣品重復(fù)3個(gè)孔。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用ABI7000熒光定量PCR儀提供的分析軟件進(jìn)行分析。Real-time PCR 所用SYBR Green熒光染料購(gòu)自美國(guó)羅氏公司。

結(jié)果

乙醇導(dǎo)致斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育異常對(duì)各不同時(shí)段乙醇處理組的胚胎整體發(fā)育情況進(jìn)行觀察和統(tǒng)計(jì)的結(jié)果顯示,乙醇可導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常,隨著處理時(shí)段的向后推移,胚胎發(fā)育異常百分比逐漸降低(圖1),存活百分比逐漸升高(圖2)。在18hpf之前予以乙醇處理的胚胎發(fā)育異常比例大于50%,其中0～6hpf處理組和7～12hpf處理組發(fā)育異常百分比(死亡個(gè)體也計(jì)入發(fā)育異常)分別達(dá)92.67%±3.06%和85.33%±3.06%。但0～6hpf處理組的存活百分比(43.33%±3.11%)較7～12hpf處理組(80.67%±0.89%)降低。故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,我們將7～12hpf作為斑馬魚(yú)胚胎的乙醇處理時(shí)間窗,定義為乙醇處理組。乙醇處理組胚胎存在軀干長(zhǎng)度縮短、頭部偏小、尾部彎曲、心臟畸形等發(fā)育異常(圖3)。

A:Control group；B:Ethanol group,C:Ethanol+ folic acid group.Left lateral views,heads toward left.Bar:200μm.

圖3胚胎整體發(fā)育情況的觀察(48 hpf)

Fig 3The phenotypical overview of zebrafish

embryos at 48 hpf

乙醇處理組胚胎心臟和心臟流出道發(fā)育異常乙醇處理組胚胎與正常發(fā)育的對(duì)照組胚胎相比,在48 hpf時(shí)心臟發(fā)育異常百分比達(dá)81.67%±7.64%,表現(xiàn)為心前區(qū)水腫,心房和心室的位置形態(tài)異常,心房和心室不同程度擴(kuò)張(圖4),心臟跳動(dòng)減慢且收縮無(wú)力。對(duì)心率和VSF的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,乙醇處理組胚胎在48 hpf和60 hpf心率和VSF皆下降(圖5)。60 hpf熒光顯微造影結(jié)果顯示正常對(duì)照組的心臟流出道已發(fā)育完善,顯影清晰;乙醇處理組胚胎(76.67%±7.64%)存在明顯心臟流出道發(fā)育不全(圖6)。

A and a:Control group;B and b:Ethanol group；C and c:Ethanol +folic acid group.a,b and c are conceptual diagrams of hearts.Arrow V:Ventricle;Arrow A:Atrium.Left lateral views,heads toward left.Bar:100μm.

圖4心臟的形態(tài)觀察(48 hpf)

Fig 4The phenotypical analysis of zebrafish heart at 48 hpf

乙醇處理組胚胎bmp2b、tbx1表達(dá)減弱Real-time PCR 結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,乙醇處理組中bmp2b和tbx1的整體表達(dá)水平明顯下降(圖7)。

圖5各組胚胎心率(A)和心室收縮指數(shù)(B)的比較

Fig5Thefunctionalanalysisofzebrafishheartby

heartrate(A)andVSF(B)

A:Control group;B:Ethanol group;C:Ethanol+folic acid group.Arrows indicate OFTs.Left lateral views,heads toward left.Bar:100μm.

圖6心臟流出道的形態(tài)觀察(60 hpf)

Fig 6The phenotypical analysis of zebrafish outflow

tract (OFT) at 60 hpf

原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,乙醇處理組胚胎bmp2b在心臟中的表達(dá)明顯減弱,tbx1在心臟流出道中的表達(dá)強(qiáng)度降低(圖8)。

圖7Real-timePCR檢測(cè)bmp2b和tbx1在胚胎的整體表達(dá)情況

Fig7bmp2bandtbx1expressionsanalysis

byreal-timePCR

A,B and C:The expression ofbmp2bat 48 hpf,arrows indicated the expression ofbmp2bin hearts.D,E and F:The expression oftbx1 at 60 hpf,arrows indicated the expression oftbx1 in OFTs.Compared with control group,expressions ofbmp2bandtbx1 decreased in ethanol group.Compared with ethanol group,expressions ofbmp2bandtbx1 increased in ethanol +folic acid group.A and D:control group,B and E:ethanol group,C and F:ethanol +folic acid group.A,B and C:Dorsal views,heads to the top.D,E and F:Left-lateral views,heads to the left.Bar:200μm.

圖8胚胎整體原位雜交法檢測(cè)bmp2b和tbx1在心臟及流出道的表達(dá)情況

Fig 8bmp2bandtbx1 expressions analysis byinsituhybridization in heart and OFT

葉酸可挽救乙醇處理組胚胎發(fā)育異常將乙醇處理組胚胎在不同發(fā)育時(shí)段給予外源性葉酸后,發(fā)現(xiàn)18 hpf之前給予葉酸,可顯著提高乙醇處理組胚胎的存活百分比(圖9),12 hpf前給予葉酸,可顯著降低乙醇處理組胚胎的發(fā)育異常百分比(圖10)。其中在7～12 hpf給予外源性葉酸后,乙醇處理組的發(fā)育異常百分比降低最顯著,存活百分比升高最明顯,因此將在7～12 hpf給予乙醇處理組外源性葉酸定義為乙醇+葉酸處理組,即葉酸挽救組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖9乙醇處理組和各乙醇+葉酸處理組的存活百分比比較

Fig9Comparationofsurvivalpercentagesinethanol

groupandethanol+folicacidgroups

圖10乙醇處理組和各乙醇+葉酸處理組的發(fā)育異常

百分比比較

Fig10Comparationofabnormalpercentagesinethanol

groupandethanol+folicacidgroups

與乙醇處理組相比,葉酸挽救組胚胎心臟發(fā)育異常個(gè)體百分比降低(41.67%±2.89%);心臟形態(tài)發(fā)育狀況明顯改善,表現(xiàn)為胚胎心房和心室的形態(tài)及位置趨于正常(圖4),而且心率和VSF在各時(shí)間點(diǎn)明顯增加(圖5)。熒光顯微造影結(jié)果顯示葉酸挽救組與乙醇組相比,心臟流出道發(fā)育異常個(gè)體百分比明顯下降(31.67%±5.77%),且心臟流出道發(fā)育情況明顯改善(圖6)。

葉酸挽救組胚胎bmp2b及tbx1表達(dá)增強(qiáng)Real-time PCR 結(jié)果顯示,與乙醇處理組相比,葉酸挽救組的bmp2b及tbx1整體表達(dá)水平明顯下降(圖7)。原位雜交結(jié)果顯示與乙醇處理組相比,bmp2b及tbx1在葉酸挽救組心臟以及流出道中的表達(dá)明顯增加(圖8)。

討論

先天性心臟病的致病因素錯(cuò)綜復(fù)雜,包括環(huán)境因素以及遺傳因素。孕母乙醇攝入是先天性心臟病較為常見(jiàn)的環(huán)境致病因素,利用模式生物對(duì)其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究并探尋有效的防治方法有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究利用模式生物斑馬魚(yú)開(kāi)展。斑馬魚(yú)與人類(lèi)基因同源性較高;且其繁殖量大、發(fā)育周期短,適用于本實(shí)驗(yàn)中的大規(guī)模表型篩選和觀察;另外斑馬魚(yú)在受精后72 hpf內(nèi)(即從受精卵發(fā)育至幼魚(yú))不需要給予飼料喂養(yǎng),其胚胎生長(zhǎng)的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(包括葉酸等)來(lái)自于受精卵內(nèi)的卵黃,各受精卵的葉酸供給是均等的,提高了本研究中葉酸挽救實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

目前國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者利用模式生物斑馬魚(yú),圍繞乙醇導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常的機(jī)制進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)乙醇可影響底索分泌Rada和Ang-1等血管形成因子,干擾斑馬魚(yú)背主動(dòng)脈的形成[8],提示乙醇可干擾斑馬魚(yú)胚胎血管發(fā)育。但在整個(gè)胚胎心臟發(fā)育時(shí)期中,乙醇導(dǎo)致心臟發(fā)育異常的最敏感時(shí)段有待于探討,乙醇導(dǎo)致心血管系統(tǒng)發(fā)育異常的機(jī)制亦尚未明確。斑馬魚(yú)胚胎心臟在48 hpf即已發(fā)育完善,本研究首先通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)用不同濃度的乙醇處理斑馬魚(yú)胚胎,經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)觀察,發(fā)現(xiàn)250 mmol/L乙醇可導(dǎo)致胚胎發(fā)生明顯發(fā)育異常,且存活率相對(duì)較高;因此選擇250 mmol/L乙醇進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。我們將0 hpf到48 hpf劃分為不同時(shí)段進(jìn)行乙醇處理,發(fā)現(xiàn)乙醇在胚胎發(fā)育早期12 hpf之前對(duì)胚胎發(fā)育的干擾作用最顯著,其中7～12 hpf處理組胚胎的發(fā)育異常百分比和存活百分比皆較高,因此將7～12 hpf處理組定義為乙醇處理組。后續(xù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),乙醇處理組胚胎存在明顯心臟和流出道形態(tài)學(xué)發(fā)育異常。且通過(guò)對(duì)心率、心室收縮指數(shù)進(jìn)行心功能評(píng)估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醇處理組胚胎存在心率下降、心室收縮功能受損。我們推測(cè)乙醇有可能通過(guò)影響心臟發(fā)育密切相關(guān)因子的表達(dá)而導(dǎo)致胚胎心臟和流出道發(fā)育異常。

在心臟發(fā)育密切相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子中,bmp2b在調(diào)控心臟收縮功能方面有重要作用[9],tbx1對(duì)于心臟流出道發(fā)育十分關(guān)鍵[10-11]。且我們前期研究發(fā)現(xiàn),葉酸生物學(xué)活性降低可導(dǎo)致bmp2b和tbx1的表達(dá)水平降低[2-3]。因此我們檢測(cè)了bmp2b以及tbx1的表達(dá)情況。首先利用Real-time PCR檢測(cè)bmp2b以及tbx1在胚胎內(nèi)的整體表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)bmp2b以及tbx1的表達(dá)水平降低。我們進(jìn)而通過(guò)胚胎整體原位雜交的方法檢測(cè)此兩個(gè)基因在心臟和流出道特定部位的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)bmp2b以及tbx1在乙醇處理組胚胎心臟和流出道的表達(dá)水平也降低,提示乙醇可能通過(guò)下調(diào)bmp2b以及tbx1的表達(dá)而導(dǎo)致胚胎心臟發(fā)育異常。

在先天性心臟病的防治策略中,對(duì)一些導(dǎo)致先心病發(fā)生的環(huán)境高危因素進(jìn)行控制并采取改善措施至關(guān)重要。發(fā)現(xiàn)孕母攝入乙醇后,及時(shí)有效地采取措施防止乙醇影響胎兒的心血管系統(tǒng)發(fā)育有十分重要的意義。葉酸是一種十分重要的維生素,我們前期研究發(fā)現(xiàn)葉酸生物學(xué)活性降低可導(dǎo)致斑馬魚(yú)胚胎發(fā)生明顯心臟和流出道異常,且心臟發(fā)育關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平降低[2-3,12-13]。在人群中進(jìn)行的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果也顯示人群中葉酸缺乏可導(dǎo)致先天性心臟病的發(fā)生率明顯上升[14],而母親孕期適當(dāng)補(bǔ)充葉酸可以有效預(yù)防先心病的發(fā)生[4,15]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),葉酸可以有效防治乙醇攝入導(dǎo)致的胚胎視網(wǎng)膜病變[6],但葉酸挽救乙醇導(dǎo)致胚胎心血管發(fā)育異常的最佳干預(yù)時(shí)段有待于探討,其挽救的機(jī)制尚未明確。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),在乙醇處理組胚胎發(fā)育早期7～12 hpf及時(shí)予以葉酸干預(yù),可以有效地改善胚胎心臟和流出道發(fā)育異常情況。這一時(shí)段與斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的原腸胚期(5.25～10 hpf)大致吻合。在原腸胚期,位于外、中、內(nèi)胚層的細(xì)胞開(kāi)始向特定的組織分化,是心臟發(fā)育早期的重要階段,此時(shí)期外源性因素可對(duì)心臟發(fā)育產(chǎn)生較大影響。這提示在胚胎心臟形成和分化的關(guān)鍵時(shí)期給予外源性葉酸可以最佳程度上預(yù)防乙醇所致的心臟和流出道發(fā)育異常。另外，乙醇處理組胚胎予以葉酸后,bmp2b以及tbx1的表達(dá)水平較乙醇處理組增高,提示葉酸可能通過(guò)影響bmp2b以及tbx1的表達(dá)而挽救乙醇處理組胚胎心臟和流出道發(fā)育異常。

本研究利用模式生物斑馬魚(yú),圍繞乙醇對(duì)胚胎心血管系統(tǒng)發(fā)育的干擾作用以及葉酸挽救效應(yīng)開(kāi)展研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醇在胚胎發(fā)育早期可導(dǎo)致顯著心臟和流出道發(fā)育異常,在胚胎發(fā)育早期7～12 hpf予以葉酸挽救可達(dá)到最佳效果,其挽救機(jī)制可能與bmp2b和tbx1的表達(dá)水平上調(diào)有關(guān)。本研究旨在為乙醇導(dǎo)致先天性心臟病的機(jī)制研究提供線索,也期望為由于母親孕期乙醇攝入過(guò)量而導(dǎo)致胎兒先天性心臟病的有效早期預(yù)防和治療提供依據(jù)。

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The folic acid rescue of ethanol-induced heart and outflow tract malformations in zebrafish

SUN Shu-na1,2,YAO Ze-zhong2,JIANG Qiu3,GUI Yong-hao1△

(1DepartmentofCardiology,Children′sHospitalofFudanUniversity,Shanghai201102,China;2DepartmentofPediatrics,CentralHospitalofMinhangDistrict,Shanghai201199,China;3ShanghaiInstituteofCardiovascularDiseases,Shanghai200032,China)

【Abstract】ObjectiveTo observe ethanol-induced cardiac phenotypes and identify ethanol-sensitive stages during embryonic development,and to explore the optimal period during which the administration of folic acid can effectively rescue the ethanol-induced heart and outflow tract (OFT) defects and its underlying mechanisms.MethodsEthanol was administrated to zebrafish embryos in a series of developmental stages (7-12 h) and the abnormal heart and OFT phenotypes were observed after ethanol exposure.The embryos which were given ethanol at 7-12 hpf was defined as ethanol treated group.Administrating folic acid to ethanol-treated zebrafish embryos in different stages (7-12 h) was conducted to rescue the abnormal cardiac defects.The ethanol-treated embryos which were given folic acid at 7-12 hpf was defined as folic acid rescue group.The survival percentage,the malformation percentage,the heart rate and the ventricular shortening fraction (VSF) were recorded.The OFT phenotypes were evaluated using fluorescein micro-angiography.Whole-mount in situ hybridization and Real-time PCR were conducted to analyze the expression of bmp2b and tbx1.ResultsEthanol exposure produced heart and OFT defects,including the abnormal cardiac shapes,the hypogenesis of OFT and the reduced heart rate and VSF.The teratogenic effect of ethanol was observed most obviously at the early embryonic development.Supplementation of folic acid at 7-12 hours post-fertilization partially rescued the developmental defects in ethanol-induced zebrafish embryos.The expressions of bmp2b and tbx1 were reduced in ethanol-treated group,and they were partially recovered after administration of folic acid.ConclusionsFolic acid supplementation can effectively rescue ethanol-induced heart OFT defects,possibly by enhancing the expressions of bmp2b and tbx1.

【Key words】folic acid;ethanol;heart;outflow tract;zebrafish;bmp2b;tbx1

(收稿日期:2015-11-08;編輯:張秀峰)

【中圖分類(lèi)號(hào)】R725.4,R394.1

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.02.002

上海市衛(wèi)生局青年科研基金(20124y086);上海市出生缺陷防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題

△Corresponding authorE-mail:yhgui@shmu.edu.cn