劉　燕，張振華，鮑王波，余　冉①，王長永②

(1.環(huán)境保護部南京環(huán)境科學研究所，江蘇 南京　210042；2.東南大學能源與環(huán)境學院，江蘇 南京　210096)

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青霉素對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

劉燕1，張振華2，鮑王波2，余冉2①，王長永1②

(1.環(huán)境保護部南京環(huán)境科學研究所，江蘇 南京210042；2.東南大學能源與環(huán)境學院，江蘇 南京210096)

摘要：利用Biolog-ECO技術(shù)分析不同青霉素濃度處理下土壤微生物的群落代謝活性及結(jié)構(gòu)多樣性，利用變性梯度凝膠電泳 (denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)技術(shù)分析典型微生物群落結(jié)構(gòu)變化情況，探討青霉素對土壤微生物群落的生態(tài)毒理效應(yīng)。主成分分析(PCA)結(jié)果表明，高濃度青霉素(400和800 mg·kg(-1))處理能快速誘導土壤中以酚酸類化合物為碳源的微生物菌群富集。DGGE結(jié)果顯示，在高濃度青霉素(800 mg·kg(-1))脅迫初期，土壤中微生物多樣性指數(shù)(Shannon-Wiener index)顯著降低(P<0.05)；7 d后，主要微生物群落結(jié)構(gòu)隨土壤中青霉素降解又逐漸恢復。

關(guān)鍵詞：青霉素；微生物多樣性；BiologEcoplates(TM)；PCR-DGGE

抗生素生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的菌渣和廢水已成為重大環(huán)境污染問題之一[1]?？股鼐c廢水的不合理處置會導致大量抗生素及其降解產(chǎn)物進入土壤中,直接影響土壤微生物的組成,并且土壤中殘留抗生素在遷移、降解、轉(zhuǎn)化等復雜的生物及物理化學過程中亦可影響土壤微生物數(shù)量和群落結(jié)構(gòu),從而影響土壤生態(tài)系統(tǒng)。

關(guān)于土壤中殘留抗生素對土壤微生物的影響在國內(nèi)外均有研究[2-6]。謝顯傳等[7]的研究表明1～10 mg·kg-1阿維菌素對土壤微生物活性無明顯影響,而50～100 mg·kg-1阿維菌素對土壤微生物活性有顯著抑制作用;刁曉平等[5]研究發(fā)現(xiàn)安普菌素對土壤細菌生長有明顯抑制作用。ZIELEZNY等[3]研究了金霉素對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及呼吸強度的毒性效應(yīng)。然而,這些研究主要集中在磺胺類、四環(huán)素類等大宗類獸藥抗生素殘留對土壤微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)的影響上,而青霉素的相關(guān)研究還鮮見報道。

變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技術(shù)能較靈敏地分辨土壤中優(yōu)勢菌群的多樣性變化而被廣泛應(yīng)用于抗生素對土壤微生物群落多樣性影響的分析上[8]。魏松林[9]應(yīng)用DGGE法比較了長期施用含抗生素牛糞的土壤與未施用牛糞土壤的細菌群落多樣性;WESTERGAARD等[10]用DGGE法分析了泰樂素對土壤微生物多樣性的影響。將Biolog-ECO法應(yīng)用于土壤微生物群體代謝的動力學特征研究,以評價微生物群落的功能多樣性[11]。劉文娜[12]采用Biolog-ECO法分析了土霉素對土壤微生物多樣性的影響,發(fā)現(xiàn)添加土霉素能刺激土壤微生物對碳源底物的利用;唐非凡[13]的研究結(jié)果則表明經(jīng)金霉素處理后土壤微生物的AWCD值、Simpson、Shannon和McIntosh指數(shù)均顯著低于對照組。

目前,國內(nèi)抗生素生產(chǎn)領(lǐng)域中青霉素最多,年產(chǎn)量超過4萬t,青霉素菌渣的不合理處置會導致土壤污染,開展青霉素對土壤微生物多樣性影響的研究具有重要意義。筆者采用Biolog-ECO及DGGE技術(shù)分析青霉素對土壤微生物功能多樣性及群落結(jié)構(gòu)的變化,旨在初步揭示土壤中青霉素對微生物的潛在生態(tài)毒性,為青霉素菌渣的環(huán)境風險評價與安全處置提供理論依據(jù)。

1研究方法

1.1試驗儀器及試劑

高速離心機(Eppendorf AG,22331 Hamburg,Germany);研磨機(RetschM400,Germany);PCR儀(Varity 96-wellApplied Biosystems,USA);核酸定量儀(Thermo NanoDrop 1000,USA);全自動微生物鑒定分型系統(tǒng)(Biology Omnilag plus,USA);Dcode突變檢測DGGE系統(tǒng)(BIO-RAD,USA);高效液相色譜儀(Waters 2695,USA)。

土壤DNA提取試劑盒(MP Biomedicals,USA); PCR緩沖溶液、dNTP Mix、MgCl2和Taq酶(均購自大連Takara公司);青霉素鈉標準品(純度w>98%,Sigma,USA);甲醇、乙腈(色譜純,Merck,Germany); Oasis HLB柱(6 mL/200 mg,Waters,USA)。

1.2試驗設(shè)計

準確稱取供試土壤(選自江蘇省南京市橫溪鎮(zhèn)農(nóng)田土)200 g共5份,參考環(huán)境中殘留濃度(2 mg·kg-1),在此基礎(chǔ)上設(shè)置空白組(0 mg·kg-1)、模擬青霉素累積濃度(20 mg·kg-1)、脅迫濃度(200 mg·kg-1)、重度脅迫濃度(400 mg·kg-1)及菌渣中殘留的青霉素濃度(800 mg·kg-1),與土樣充分攪拌混勻,添加適量超純水,使土壤含水量w為最大持水量的50%[6],將處理后的土樣置于大燒杯中，用保鮮膜蓋住燒杯口并在保鮮膜上扎小孔以保持空氣流通。25 ℃條件下在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別在0、1、3、5、7、14 d采集土壤樣品20 g,取10 g新鮮土樣用于Biolog分析,10 g凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3土壤中青霉素殘留檢測

準確稱取土壤樣品1 g于15 mL離心管中,加入提取液(超純水)5 mL,渦旋1～2 min充分混勻后,20 ℃超聲40 min,4 ℃條件下按4 000 r·min-1離心15 min(離心半徑為7.7 cm),上清液轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中凈化處理后上機檢測。分析方法參考張振華等[14]的研究方法。每個處理組設(shè)3次重復,每個重復設(shè)3個平行。

1.4Biolog分析

稱取10 g新鮮土樣,加入90 mLw為0.85%的NaCl溶液,置于搖床以200 r·min-1振搖30 min,靜置5 min,取上清液2 mL置于100 mL滅菌三角瓶中,加入18 mL無菌水,重復稀釋2次,制得1∶100的稀釋液,以每孔150 μL稀釋液加入微孔板中,30 ℃ 恒溫培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)0、1、2、3、4、5、6、7 d后測定波長在590 nm下的吸收值。檢測培養(yǎng)168 h后土壤微生物對6類碳的平均利用率[15],并進行主成分分析(PCA)。

采用Microsoft Excel 2007和SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù),采用Canoco for Windows 4.5軟件進行PCA分析。

1.5PCR-DGGE分析

以土壤DNA為模板,用V3可變區(qū)通用引物341F(5′-G￣C￣C G￣C￣C C￣G￣C G￣C￣G C￣G￣G C￣G￣G G￣C￣G G￣G￣G C￣G￣G G￣G￣G C￣A￣C G￣G￣G G￣G￣G C￣C￣T A￣C￣G G￣A￣G G￣C￣A G￣C￣A G-3′)和518R (5′-A￣T￣T A￣C￣C G￣C￣G C￣G￣T G￣C￣T G￣G-3′)。PCR-DGGE方法參考WATANABE等[16]的研究方法。切取DGGE圖譜上特異性條帶回收后進行克隆測序分析。

DGGE圖譜使用Quantity one軟件分析,計算每個條帶的豐度值和條帶數(shù)(S),并由此計算每條泳道的Shannon指數(shù)(H′)[17]及均勻度(E)[18]。

H′=-∑Pi×lnPi,

(1)

E=H′/lnS,

(2)

Pi=ni/N。

(3)

式(1)～(3)中,Pi為第i個種占總數(shù)的比例,%;ni為第i個條帶豐度值;N為第i個條帶的泳道上所有條帶豐度之和。

2結(jié)果與討論

2.1土壤中青霉素殘留量

對土壤樣品進行青霉素殘留量分析(圖1)。土壤經(jīng)青霉素處理后立即采集樣品檢測,檢出濃度接近于理論添加量,回收率均在90%左右;試驗1 d時,青霉素添加量為0、2和20 mg·kg-1處理組青霉素殘留量低于檢測限,添加量為200、400和800 mg·kg-1處理組青霉素降解率均高達50%以上,3 d后所有處理組青霉素殘留量均低于檢測限。土壤中青霉素降解較快,這可能是因為青霉素的β-內(nèi)酰胺環(huán)不穩(wěn)定,對pH值、環(huán)境溫度及β-內(nèi)酰胺酶非常敏感[19-20]。同時,土壤中的微生物也是導致青霉素快速降解的一個重要因素[21]。

圖1　各青霉素濃度處理組土壤中青霉素隨時間的降解

2.2Biolog分析

圖2為各處理組土壤微生物對6類碳源利用率的PCA分析。0 d時,其第1、2主成分分別可解釋變量特征的51.2%和23.7%。碳源對PC1軸的方差貢獻率:多聚物類為-0.939，羧酸類為-0.705，酚酸類為-0.600;PC2軸:酚酸類為-0.778，碳水化合物類為0.556，氨基酸類為0.530。1 d時,其第1、2主成分分別可解釋變量特征的62.5%和31.5%。碳源對PC1軸的方差貢獻率:多聚物類為-0.641，羧酸類為-0.645，酚酸類為-0.421;PC2軸:酚酸類為-0.618，碳水化合物類為0.421，氨基酸類為0.721。各處理組的空間分布分散,無顯著差異。

3 d時,其第1、2主成分分別可解釋變量特征的59.9%和26.5%。碳源對PC1軸的方差貢獻率:酚酸類為0.989，氨基酸類為-0.716，碳水化合物類為-0.618;PC2軸:多聚物類為0.947，羧酸類為-0.427，碳水化合物類為-0.406。5 d時,其第1、2主成分分別可解釋變量特征的58.5%和25.5%。碳源對PC1軸的方差貢獻率:酚酸類為0.788，氨基酸類為-0.831，碳水化合物類為-0.588;PC2軸:多聚物類為0.747，羧酸類為-0.217，碳水化合物類為-0.676。在3和5 d時,400和800 mg·kg-1青霉素處理組均勻分布在圖右側(cè),且各聚成一簇，均與酚酸類化合物呈顯著正相關(guān),說明這2組微生物群落對酚酸類化合物的利用率相對較高,其他處理組則分布在圖的左側(cè),無顯著差異。

7 d時,其第1、2主成分分別可解釋變量特征的62.0%和20.1%,碳源對PC1軸的方差貢獻率:多聚物類為0.918，酚酸類為-0.818，羧酸類為-0.095;PC2軸:酚酸類為-0.562，羧酸類為-0.492，多聚物類為-0.391。14 d時,其第1、2主成分分別可解釋變量特征的59.5%和27.5%,碳源對PC1軸的方差貢獻率:多聚物類為0.522，酚酸類為-0.521，羧酸類為-0.671;PC2軸:酚酸類為-0.441，羧酸類為-0.361，多聚物類為-0.678。7 d時,400和800 mg·kg-1青霉素處理組分布趨勢與3 d時一致,均勻分布在圖的左下側(cè),且各聚成一簇,與酚酸類化合物呈顯著正相關(guān)。14 d時,各處理組空間分布分散,無顯著差異，說明14 d時各處理組微生物多樣性又趨于一致。

大部分抗生素都有其作用的靶標微生物,當土壤中其靶標菌群被抑制時,可能會誘導其抗性菌群以及能以其作為營養(yǎng)而利用的菌群富集,而對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響。該研究結(jié)果表明,低濃度(2～200 mg·kg-1)青霉素處理組土壤微生物的代謝功能多樣性并無顯著改變;而400和800 mg·kg-1青霉素處理組土壤微生物菌群對碳源的利用則發(fā)生顯著改變,以酚酸類化合物為碳源的微生物菌落被快速誘導、富集。

2.3DGGE分析

2.3.1DGGE圖譜及微生物多樣性

對0、3和7 d的土壤樣品進行PCR-DGGE多樣性指數(shù)及特異條帶的16S rDNA測序分析。由圖3可知,0 d時各處理組DGGE條帶數(shù)差異較小,且條帶分布均勻;3 d時,條帶1在各個處理組均存在且為優(yōu)勢條帶,條帶2和3在0和2 mg·kg-1青霉素處理組為優(yōu)勢條帶,而在其他處理組相對豐度較低;7 d時,各處理組微生物多樣性逐漸恢復,但對照組條帶4相對豐度較低。

表1表明,3 d時,800 mg·kg-1處理組Shannon指數(shù)比對照組顯著降低(P<0.05),其他處理組較對照組也有一定程度降低,但無顯著差異;7 d時,800 mg·kg-1處理組Shannon指數(shù)恢復到對照組水平。各泳道條帶均勻度均在0.99左右,無顯著差異。以上結(jié)果表明,在高濃度(800 mg·kg-1)青霉素脅迫初期,土壤微生物多樣性顯著降低,但隨著青霉素在土壤中的快速降解,微生物多樣性逐漸恢復到對照組水平。

圖2　各青霉素濃度處理組對6類碳源利用率的主成分分析

2.3.2DGGE特異性條帶的測序及分析

DGGE特異性條帶測序比對結(jié)果表明,條帶1與Burkholderialessp.、條帶4與Sphingomonasroseiflava16S rDNA片段序列的同源性均為100%,且不受青霉素濃度及作用時間的影響。ZHANG等[22]的研究表明伯克氏菌屬能以青霉素為單一碳源生長繁殖,是一種青霉素降解菌。COLQUHOUN等[23]則發(fā)現(xiàn)Sphingomonasroseiflava中攜帶編碼β-內(nèi)酰胺酶的青霉素抗性基因。條帶2與Bacillusniabensis、條帶3與Agromyceslapidis16S rDNA片段序列的同源性分別為100%和99%。土壤中條帶2和3代表的優(yōu)勢菌株豐度隨青霉素濃度的升高逐漸降低。據(jù)報道,這2種菌株對青霉素的最高耐受濃度分別為23[24]和10 mg·kg-1[25],可見它們能適應(yīng)在低濃度青霉素環(huán)境介質(zhì)中生存。

圖3　各青霉素濃度處理組在0、3和7 d時土壤樣品的DGGE圖譜

表10、3和7 d時各青霉素濃度處理組土壤微生物多樣性指數(shù)和均勻度

Table 1Functional diversity and evenness indices of soil microbial community on 0, 3 and 7 d relative to concentration of penicillin added

w(青霉素)/(mg·kg-1)0d3d7dShannon指數(shù)均勻度Shannon指數(shù)均勻度Shannon指數(shù)均勻度03.641±0.230.996±0.0053.523±0.130.991±0.0023.652±0.250.995±0.00323.662±0.170.990±0.0033.458±0.210.993±0.0053.651±0.320.992±0.001203.751±0.110.989±0.0043.412±0.240.993±0.0033.540±0.110.996±0.0012003.740±0.040.994±0.0013.374±0.330.992±0.0043.622±0.300.995±0.0024003.712±0.190.988±0.0053.186±0.320.990±0.0073.701±0.140.994±0.0018003.670±0.090.983±0.0082.590±0.27*0.981±0.0093.680±0.170.998±0.003

*表示與對照組差異顯著(P<0.05)。

3結(jié)論

青霉素在土壤中降解較快,3 d后所有處理組青霉素殘留量均低于檢測限;高濃度青霉素能快速誘導土壤中以酚酸類化合物為碳源的微生物菌群富集;在高濃度(800 mg·kg-1)青霉素脅迫初期,土壤微生物多樣性顯著降低,但隨著青霉素在土壤中的快速降解,微生物多樣性水平逐漸恢復。

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(責任編輯： 陳昕)

Effects of Penicillin on Soil Microbial Community Structure.

LIUYan1,ZHANGZhen-hua1,BAOWang-bo2,YURan2,WANGChang-yong1

(1.Nanjing Institute of Environmental Sciences, Ministry of Environmental Protection, Nanjing 210042, China;2.Department of Energy and Environment, Southeast University, Nanjing 210096, China)

Abstract:Effect of penicillin, varying in concentration, on metabolic activity and structural diversity of soil microbial community was analyzed with the Biolog-ECO technology, and changes in the soil microbial community structure were with the DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) technology, so as to explore eco-toxicological effect of penicillin on soil microbial community. PCA based on the BiologEcoplates(TM) shows that penicillin high in concentration (400-800 mg·kg(-1)) may induce rapid enrichment of microbial groups that use phenolic compounds as carbon source in the soil microbial community. PCR-DGGE analysis reveals that in the soil treated with a high dose(800 mg·kg(-1)) of penicillin, Shannon-Wiener diversity index was significantly lowered in the first days and gradual recovered 7 days later with the penicillin in the soil degrading.

Key words:penicillin;microbial diversity;BiologEcoplates(TM);PCR-DGGE

作者簡介：劉燕(1977—),女,江蘇南京人,副研究員,碩士,主要研究方向為生物安全與生物多樣性保護。E-mail: liuyan@nies.org

DOI：10.11934/j.issn.1673-4831.2016.02.021

中圖分類號：X51

文獻標志碼：A

文章編號：1673-4831(2016)02-0309-06

通信作者①E-mail: yuran@seu.edu.cn ②E-mail: wcy@nies.org

基金項目：環(huán)保公益性行業(yè)科研專項(201209024);國家自然科學基金青年基金(41401363);江蘇省自然科學基金青年基金(BK20130102)；公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費項目

收稿日期：2015-06-26