范弟武，徐　莎，周曼麗，張倩楠，朱詠莉①，韓建剛②

(1.南京林業(yè)大學江蘇省南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京　210037;2.南京林業(yè)大學生物與環(huán)境學院，江蘇 南京　210037)

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Cd2+和Cr3+對崇明東灘濕地土壤堿性磷酸酶的低劑量興奮效應

范弟武1,2，徐莎1,2，周曼麗2，張倩楠2，朱詠莉1,2①，韓建剛1,2②

(1.南京林業(yè)大學江蘇省南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京210037;2.南京林業(yè)大學生物與環(huán)境學院，江蘇 南京210037)

摘要：為了明確Cd(2+)、Cr(3+)與堿性磷酸酶(ALP)活性之間的低劑量興奮效應關系，以崇明東灘濕地土壤為對象，通過添加不同劑量的外源Cd(2+)(CdCl2)和Cr(3+)(CrCl3)，使土壤中w(Cd(2+))分別為0、0.001、0.01、0.1、1、5、10、20、100和500 mg·kg(-1)，w(Cr(3+))為0、0.5、5、50、100、500和5 000 mg·kg(-1)，觀測土壤ALP活性隨時間(0、6、12、24、48、72和120 h)的變化特征。結果表明：(1)培養(yǎng)12 h后，Cd(2+)添加量為1 mg·kg(-1)時，ALP活性比對照高8.6%(P<0.05)；當Cd(2+)添加量大于10 mg·kg(-1)時，酶活性受到明顯抑制。Cr(3+)添加量為5 mg·kg(-1)時，ALP活性比對照顯著升高22.8%(P<0.05)；當Cr(3+)添加量大于100 mg·kg(-1)時，酶活性顯著降低。這表明Cd(2+)和Cr(3+)與ALP之間存在典型的低劑量興奮效應，但效應的表達與兩者接觸時間的長短密切相關。(2)以培養(yǎng)24 h的土壤樣品為例，Cd(2+)添加量為1 和5 mg·kg(-1)時，ALP的催化效率(V(max)/Km)，即最大反應速率(V(max))與Michaelis常數(shù)(Km)的比值為1.7；當Cd(2+)添加量增加到20 mg·kg(-1)時，V(max)/Km比降至0.8，而V(max)和Km的值均低于對照。Cr(3+)添加量為0.5和5 mg·kg(-1)時，V(max)/Km比為1.7；當Cr(3+)添加量增至100 mg·kg(-1)時，V(max)/Km比降為1.4，但V(max)和Km值均高于對照，這表明重金屬與土壤酶之間的低劑量興奮效應機理可能與其離子特性密切相關。

關鍵詞：低劑量興奮效應；堿性磷酸酶；重金屬；濱海濕地

濕地土壤的重金屬污染問題是當前環(huán)境科學領域的研究熱點之一，濕地土壤被公認為是最重要的環(huán)境污染物匯聚地[1]。由于日趨嚴重的近海環(huán)境污染問題及可持續(xù)發(fā)展的需要，揭示濕地在重金屬循環(huán)中的功能，認識重金屬在濕地中的遷移和循環(huán)規(guī)律十分必要[2]。呂達等[3]利用污染負荷指數(shù)法對崇明島東灘濕地重金屬含量進行分析，結果顯示崇明島東灘濕地為中度污染。鉻、鎘等重金屬在濕地土壤中分布廣泛[4]。濕地土壤中的重金屬對植物的生長發(fā)育、微生物群落,甚至對土壤酶都存在影響[5-6]，研究崇明東灘濕地重金屬對保護濕地環(huán)境及鳥類等生物的棲息地有重要作用。

低劑量興奮效應指機體受低劑量污染脅迫時出現(xiàn)刺激作用，而受高劑量污染脅迫時表現(xiàn)出抑制效應[7]。目前有關污染物低劑量興奮效應的研究主要圍繞動物、植物和細菌等機體進行，相應的測試終點包括生長狀況、繁殖率、致突變率等[8-9]。SHEN 等[10-11]在研究低劑量鎘與菲復合污染的協(xié)同與拮抗機理時，選用土壤酶作為判斷指標，但并沒有對土壤酶本身可能存在的低劑量興奮效應進行專門探討，而土壤酶可能是潛在的重要的低劑量興奮效應研究對象之一。

土壤酶是土壤組分中最活躍的有機成分之一[12]，土壤酶活性與土壤中生物數(shù)量、生物多樣性等密切相關，是土壤生物學活性的表現(xiàn)。有研究者認為可以將土壤酶作為土壤質量的生物指示器來評估重金屬對土壤的污染程度[13]，土壤酶并非個體，不受種群等尺度約束，可反映整個環(huán)境的功能效應。對土壤生態(tài)系統(tǒng)的營養(yǎng)物質循環(huán)、能量轉化和凈化污染物等方面有重要作用[14-15]。堿性磷酸酶(ALP)是一種專一性較好的磷酸酯水解酶，廣泛分布在生態(tài)系統(tǒng)的各個角落，已經成為一種環(huán)境監(jiān)測的指示物，具有重要的生態(tài)學意義[16]。

筆者以濱海濕地為原型區(qū)域，選擇ALP活性為測試終點，研究不同培養(yǎng)時間下Cd2+和Cr3+對ALP活性的影響，同時對ALP酶促反應動力學特征進行探討，以期明確Cd2+和Cr3+與濕地土壤ALP活性之間的劑量效應關系及機理。

1材料與方法

1.1區(qū)域概況

崇明東灘(北緯31°37′31″，東經121°23′33″)位于崇明島東部，是目前長江口規(guī)模最大的潮汐灘涂濕地。區(qū)域盛行東亞季風，年均溫度15.7 ℃，年均降水量1 123.7 mm。崇明東灘表層土壤重金屬w(Cr)與w(Cd)平均值為71和0.23 μg·g-1，均超過上海潮灘背景值，在長江口灘涂、中國河口濕地和全球濱岸地區(qū)范疇內均處于居中地位?；诔练e速率和重金屬含量計算得出的崇明東灘重金屬Cr與Cd的年沉降量分別為312和1.04 t，總沉積通量為11 g·m-2·a-1[17]。

1.2土壤樣品采集

2012年3月16日于崇明東灘濕地按照平行線采樣原則，在中潮灘帶采集0～20 cm表層土壤及其上覆水樣品。土壤樣品風干后用木棍碾壓，過1.0 mm孔徑尼龍篩，置于陰涼干燥處保存，水樣置于4 ℃ 冰箱冷藏，其中水樣與土壤樣品的有機碳含量分別為2.2 mg·L-1和17.5 g·kg-1，pH值分別為7.9和8.2〔m(水)∶m(土)=2.5〕，土壤樣品的有機碳含量和pH值測定均參照文獻[18]。

1.3試驗設計

稱取2.0 g風干土于25 mL小玻璃瓶中，加入0.8 mL不同w(Cd2+)(0、0.001、0.01、0.1、1、5、10、20、100和500 mg·kg-1)和w(Cr3+) (0、0.5、5、50、100、500和5 000 mg·kg-1)至土壤最終質量含水率為40%，密閉后置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在0、6、12、24、48、72、120 h取樣測定，每個時間點培養(yǎng)1組樣品(含1個對照和2個平行)。

1.4ALP活性測定

取濕泥樣約1.0 g于20 mL玻璃瓶中，加入pH值為8.4的Tris-HCl緩沖液3 mL。加入5 mmol·L-1對硝基苯磷酸二鈉(pNPP)1 mL和0.5 mol·L-1CaCl2溶液1 mL，搖勻。37 ℃水浴1 h后，取出玻璃瓶，立刻加入0.5 mol·L-1NaOH 4.0 mL終止反應，過濾。取濾液5.0 mL于25 mL具塞比色管中，加入2 mol·L-1Tris-HCl緩沖液2 mL，定容，采用紫外分光光度計(UV-2550型)在400 nm波長下測定對硝基苯酚(p-NP)吸光度。ALP活性以1 kg土壤1 h生成的p-NP的量表示。

(1)

式(1)中，E為ALP活性，mmol·kg-1·h-1；c1和c0分別為處理組和對照組p-NP濃度，mmol·L-1；m為換算為干土后的土壤質量，g；t為培養(yǎng)時間，h。

1.5酶促反應動力學

稱取2.0 g土樣至于小玻璃瓶中，分別加入0.8 mL不同w(Cd2+)(1、5和20 mg·kg-1)、w(Cr3+)(0.5、5和100 mg·kg-1)，密閉后置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。從培養(yǎng)箱取出后，加入pH值為8.4的Tris-HCl緩沖液3.0 mL，分別加入0、1.7、2、2.5、3.3、5和10 mmol·L-1pNPP溶液1 mL和0.5 mol·L-1CaCl2溶液1 mL，搖勻，37 ℃水浴1 h，測定ALP活性，根據(jù)Michaelis-Menten方程計算酶促反應速率v[19]。

(2)

式(2)中，v為酶促反應速率，mmol·kg-1·h-1；Km為米氏常數(shù)，mmol·L-1；Vmax為最大酶促反應速率，mmol·kg-1·h-1；[S]為底物濃度，mmol·L-1。

1.6統(tǒng)計方法

采用單因素方差分析法(SPSS 19.0軟件)比較不同Cd2+和Cr3+添加量條件下酶活性的差異顯著性。

2結果與分析

2.1重金屬離子與土壤ALP活性之間的劑量效應關系

2.1.1Cd2+與土壤ALP活性之間的劑量效應關系

在不同Cd2+添加水平下(0.001～500 mg·kg-1)，培養(yǎng)6 h之前樣品的ALP活性與對照相比沒有明顯的劑量效應關系(圖1)。當培養(yǎng)時間延長至12 h時，1 mg·kg-1Cd2+處理樣品的ALP活性顯著升高(P<0.05)，酶活性比對照高8.6%；當Cd2+添加量增至5～500 mg·kg-1時，酶活性受到明顯抑制。隨著培養(yǎng)時間的延長(24～120 h)，所有Cd2+添加量下ALP活性均受到不同程度的抑制，最高抑制率達55.9%(表1)。

圖1　不同Cd2+添加量對土壤ALP活性的影響

2.1.2Cr3+與土壤ALP活性之間的劑量效應關系

不同Cr3+添加水平下(0.5～5 000 mg·kg-1)，培養(yǎng)12 h之前土樣的ALP活性與對照相比沒有明顯的劑量效應關系(圖2)。當培養(yǎng)時間延長至24 h時，0.5～50 mg·kg-1Cr3+處理樣品的ALP活性顯著升高(P<0.05)，酶活性比對照高8.30%～22.8%；隨著Cr3+添加量增至100～5 000 mg·kg-1，酶活性受到明顯抑制。隨著培養(yǎng)時間的延長(48～120 h)，所有Cr3+添加水平下(0.05～5 000 mg·kg-1)ALP活性均受到明顯抑制，最高抑制率達60.3%(表2)。

2.2Cd2+、Cr3+對土壤ALP酶促反應動力學參數(shù)變化的影響

由表3可知，與CK相比，Cd2+添加量為1和5 mg·kg-1時，Km值無顯著變化，Vmax值分別降低7.3%和11.5%；當Cd2+添加量增加到20 mg·kg-1時，Vmax和Km分別降低61.5%和10.7%。Cd2+添加量為1和5 mg·kg-1時，Vmax/Km比值均為1.7；當Cd2+添加劑量增加到20 mg·kg-1時，Vmax/Km比值為0.8，減少52.9%。

表1與對照相比各處理組Cd2+的促進率和抑制率

Table 1Promotion and inhibition rates of Cd2+in various treatments as compared with that in control

培養(yǎng)時間/h不同Cd2+添加量(mg·kg-1)下的促進和抑制率/%0.0010.010.11510201005000+6.0-12.5+1.2-7.7+9.6+9.0-8.6-13.7-1.16-6.5-24.9-11.6-11.6-9.2-11.1-11.7-28.2-17.212-0.2-0.80+8.6-11.6-18.2-19.1-30.4-32.124-10.1-14.0-3.8-4.7-14.7-17.0-32.1-42.7-55.948-11.7+0.7-10.4-8.6-10.6-18.7-23.0-28.8-49.072-0.2-2.1+0.1-6.6-8.8-14.0-14.7-27.8-43.2120-8.9-17.2-18.8-14.0-19.3-31.5-26.2-32.0-41.6

+為促進，-為抑制。

圖2　不同Cr3+添加量對土壤ALP活性的影響

表2與對照相比各處理組Cr3+的促進率和抑制率

Table 2Promotion and inhibition rates of Cr3+in various treatments as compared with that in control

培養(yǎng)時間/h不同Cr3+添加量(mg·kg-1)下的促進率和抑制率/%0.55501005005000026.8-16.3-18.86.0-28.5-26.261.6-24.7-27.9-15.7-29.1-44.6124.0-5.0-8.44.0-22.8-59.02410.022.88.3-13.1-21.3-73.5482.2-6.7-8.3-17.3-30.2-60.372-4.1-11.5-13.9-12.9-21.9-49.5120-5.3-4.5-8.7-8.7-17.3-42.1

+為促進，-為抑制。

Cr3+添加量為0.5、5和100 mg·kg-1時，ALP的Km和Vmax值分別增加14.3%和12.5%、59%和13.5%、11.5%和32.3%。Cr3+添加量為0.5和5 mg·kg-1時，Vmax/Km比值均為1.7；當Cr3+添加量增加到100 mg·kg-1時，Vmax/Km比值為1.4，減少17.6%。

表3不同Cd2+、Cr3+添加量對ALP酶促反應動力學參數(shù)的影響

Table 3Effects of dosage of Cd2+and Cr3+on kinetic parameters of the promotive effects on ALP in the soil

處理組添加量/(mg·kg-1)Vmax/(mmol·kg-1·h-1)Km/(mmol·L-1)R2Vmax/KmCK 09.65.6 0.995*1.7Cd2+18.95.30.993*1.758.55.10.986*1.7203.74.50.956*0.8Cr3+0.510.96.40.984*1.7510.76.30.989*1.710012.78.90.992*1.4

Vmax為最大酶促反應速率，Km為米氏常數(shù)。*表示P<0.01。

3討論

3.1Cd2+、Cr3+與土壤ALP活性之間的劑量效應關系

以土壤生態(tài)系統(tǒng)為試驗模型，酶活性為測試終點，對土壤酶的低劑量興奮效應進行探討。以往研究表明，重金屬對ALP活性總體表現(xiàn)為抑制作用[20]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，Cd2+、Cr3+與土壤ALP活性之間存在典型的雙相劑量效應關系，這與陸文龍等[21]研究結果相一致。土壤體系相對復雜，由有機質、土壤生物以及水分、空氣和氧化的腐殖質等組成。王浩等[22]研究發(fā)現(xiàn)土壤有機質積累可顯著增加有機質結合態(tài)重金屬比例。許多研究表明植物殘物分解而成的有機質可與重金屬絡合增加金屬離子活性，降低土壤對重金屬的吸附[23]。徐明崗等[24]研究發(fā)現(xiàn)黃棕壤在pH 值為4～7時不同吸附量下重金屬的解吸量均隨吸附量增加而增大，兩者呈顯著線性相關。隨著土壤pH值升高，可交換態(tài)Cd含量逐漸降低，有機結合態(tài)Cd含量緩慢升高[25]。

郭雪雁等[26]研究認為時間是劑量效應關系中的一個重要組成部分。就土壤ALP而言，Cd2+和Cr3+與酶活性低劑量興奮效應的表達與兩者之間的作用時間長短密切相關(>12 h)。在較短作用時間內(0～12 h)，土壤ALP活性在不同Cd2+、Cr3+添加量之間的變化沒有明顯的促進或抑制現(xiàn)象。相對而言，當作用時間延長至12～24 h時，才會出現(xiàn)酶活性顯著升高現(xiàn)象，這表明酶與脅迫物接觸后存在相互作用期，表現(xiàn)為響應的滯后，同時Cd2+、Cr3+對酶活性的促進幅度與低劑量興奮效應研究的“30%～60%法則”[27-28]相比刺激效應幅度略低。略低的刺激效應幅度與響應時間的滯后可能與土壤模型的復雜性密切相關。王瑞興等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在被重金屬污染的土壤樣中添加底物，8 d后土壤中有效態(tài)重金屬含量減少50%～70%。

3.2Cd2+、Cr3+對土壤ALP 低劑量興奮效應的機制探索

一定劑量的Cd2+、Cr3+污染刺激了土壤酶活性增加，高劑量Cd2+、Cr3+污染對土壤酶活性的抑制作用非常顯著，這與低劑量興奮效應定義相吻合[7]。低濃度重金屬對土壤ALP活性具有促進作用，一方面可能是由于低濃度重金屬對土壤微生物生物量存在刺激作用，而當微生物受到刺激后，微生物對土壤中ALP活性具有促進作用。韓桂琪等[30]研究發(fā)現(xiàn)，低劑量重金屬刺激了細菌等微生物生長，但高劑量則使得微生物生物量顯著下降。另一方面可能由于酶作為蛋白質，重金屬離子作為輔基，有利于酶活性中心與底物的配位結合，從而使酶分子與酶活性中心保持一定的專性結構，改變酶促反應的平衡性和酶蛋白的表面電荷，從而增強酶活性[31]。在高劑量重金屬離子的影響下，酶活性下降，這與重金屬對酶產生的抑制作用有關，反競爭性抑制是指抑制劑只與酶-底物的復合物結合，而不與游離酶結合的一種酶促反應抑制作用，特點為Vmax和Km都變小，但Vmax/Km比值不變。該現(xiàn)象的作用機理可能是重金屬通過抑制土壤微生物的生長和繁殖，減少體內酶的合成和分泌，最終導致酶活性下降[32-33]。

酶促反應動力學研究有助于了解酶與底物結合機制與作用方式，以及酶的結構與功能的關系[34]。研究發(fā)現(xiàn)，Cd2+添加量為1和5 mg·kg-1時，Km值無顯著差異，Vmax/Km比值則與對照相同，說明Cd2+對ALP與底物的結合(親和力)幾乎沒有影響。隨著Cd2+劑量增加，Vmax/Km比值降低。Cd2+對ALP活性變化影響的機理可能在于Cd2+充當了反競爭性抑制劑，即并未對酶本身產生抑制，而是對ALP與底物結合的產物形成抑制作用。這與徐冬梅等[35]研究結果一致，符合反競爭性抑制劑的特點。與對照相比，Cr3+的加入均顯著降低ALP與底物的親和力，且隨著Cr3+濃度的增加，ALP與底物的親和力逐漸降低。以此來看，低劑量Cr3+并不是作為反競爭性抑制劑，也未改變酶的催化效率，只是增加了最大反應速率。因此，重金屬離子對土壤酶低劑量興奮效應的機理可能取決于不同離子之間的特性。由此可以延伸到分子生物學角度對低劑量興奮效應現(xiàn)象進行探索[36-38]。MORRE[38]研究發(fā)現(xiàn)刺激植物生長的低劑量興奮效應的分子靶位是TIP/NOX蛋白質。但目前有關重金屬對土壤的低劑量興奮效應在分子水平上的作用機制尚不明確。

4結論

(1)Cd2+、Cr3+與濕地土壤ALP活性之間存在顯著的雙相劑量效應關系，但該劑量關系的表達與兩者之間接觸時間的長短密切相關。12 h后，低劑量Cd2+、Cr3+使土壤ALP活性顯著升高；隨著添加劑量的增加，酶活性受到明顯抑制。

(2)低劑量Cd2+對ALP活性變化影響的機理是Cd2+充當了反競爭性抑制劑，即其并未對酶本身產生抑制，而是對ALP與底物結合后產物的形成產生抑制。相比較而言，低劑量Cr3+增加了ALP的最大反應速率。這表明重金屬與土壤酶之間的低劑量興奮效應機理可能與其離子特性密切相關。

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(責任編輯： 陳昕)

Low-Dose Hormetic Effects of Cd2+and Cr3+on Alkaline Phosphatase in Wetland Soil in Dongtan of Chongming.

FANDi-wu1,2,XUSha1,2,ZHOUMan-li2,ZHANGQian-nan2,ZHUYong-li1,2,HANJian-gang1,2

(1.Collaborative Innovation Center of Sustainable Forestry in Southern China of Jiangsu Province, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China;2.College of Biology and the Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China)

Abstract:To explore low-dose hormetic effects (a biphasic dose-response characterized by a low dose benefit and a high dose inhibition) of Cd(2+) and Cr(3+)on activity of alkaline phosphatase in wetland soil, soil samples were collected from the wetland in Dongtan of Chongming, treated with different doses of Cd(2+) and Cr(3+), making the samples 0, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 5, 10, 20, 100 and 500 mg·kg(-1) in Cd(2+) concentration and 0, 0.5, 5, 50 100, 500 and 5 000 mg·kg(-1) in Cr(3+) concentration, separately, and then incubated for 0, 6, 12, 24, 48, 72 and 120 hrs. After the incubation soil samples were analyzed for activity of alkaline phosphatase (ALP)in soils to determine characteristics of the temporal variation of the activity with the incubation. Results show that after 12 hours of incubation, ALP activity was 8.6% higher in the soil samples 1 mg·kg(-1) in Cd(2+) concentration than in CK, and was obviously inhibited in the soil samples 10 mg·kg(-1) in Cd(2+) concentration(P<0.05), while ALP activity was 22.8% higher in the soil samples 5 mg·kg(-1) in Cr(3+) concentration than in CK (P<0.05), but substantially lower in the soil samples 100 mg·kg(-1) or higher in Cd(2+) concentration, which indicates that the two types of heavy metals have some low-dose hormetic effects on ALP activity in the wetland soil, and the effects were closely related to duration of their contact. Meanwhile, after 24 hours of incubation, V(max )/Km (maximum reaction velocity/Michaelis constant) was 1.7 in the soil samples 1 and 5 mg·kg(-1) in Cd(2+) concentration and lowered down to 0.8 in the soil samples 20.0 mg·kg(-1) in Cd(2+) concentration with both V(max) and Km being lower than their respective ones in CK (soil samples 0 mg·kg(-1) in Cd(2+) concentration), and V(max)/Km was also 1.7 in the soil samples 1 and 5 mg·kg(-1) in Cr(3+) concentration, and 1.4 in the soil samples 100 mg·kg(-1) in Cr(3+) concentration, with both V(max) and Km being higher than their respective ones in CK. All the findings indicate that both V(max) and Km fall simultaneously in the presence of Cd(2+), but rise simultaneously in the presence of Cr(3+), and that the mechanism of low-case hormesis existing between heavy metals and soil enzymes may be closely related to properties of the heavy metal ions.

Key words:hormesis;alkaline phosphatase;heavy metal;coastal wetlands

作者簡介：范弟武(1992—)，男，安徽宣城人，碩士生，主要從事環(huán)境毒理學方面的研究。E-mail： 709719226@qq.com

DOI：10.11934/j.issn.1673-4831.2016.02.023

中圖分類號：X53

文獻標志碼：A

文章編號：1673-4831(2016)02-0320-06

通信作者①E-mail: zhuyongli76@126.com ②E-mail: hanjiangang76@126.com

基金項目：國家自然科學基金 (41375149,41471191)；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目(PAPD)；南京林業(yè)大學2015年度大學生實踐創(chuàng)新訓練計劃(2015sjcx188)

收稿日期：2015-10-26