張瑞杰,張瓊瓊,黃興如,郭逍宇(首都師范大學(xué)資源環(huán)境與旅游學(xué)院,北京 100048)

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再生水濕地香蒲根內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性及其水質(zhì)特征分析

張瑞杰,張瓊瓊,黃興如,郭逍宇*(首都師范大學(xué)資源環(huán)境與旅游學(xué)院,北京 100048)

摘要：以北京白河人工濕地再生水補(bǔ)水河段香蒲根為研究對象,采用16S rDNA克隆文庫技術(shù)對香蒲根內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行分析,得出該克隆文庫包括4大類群細(xì)菌,最優(yōu)勢類群為變形桿菌門Proteobacteria,其中包括Gammaproteobacteria、Betaproteobacteria、Epsilonproteobacteria、Alphaproteobacteria;其次為厚壁菌門Firmicutes、疣微菌門Verrucomicrobia、擬桿菌門Bacteroidetes;另外還包括部分非培養(yǎng)未確定種屬的細(xì)菌.結(jié)合研究區(qū)再生水排放口與濕地下游水質(zhì)數(shù)據(jù),得出TN、TP、去除率達(dá)到了42.15%、47.34%、28.56%,表明濕地對再生水中的TN、TP、具有明顯去除機(jī)制,說明香蒲根內(nèi)生細(xì)菌克隆文庫中菌株與濕地氮、磷等生物地球循環(huán)關(guān)系密切.

關(guān)鍵詞：再生水；人工濕地；香蒲根內(nèi)生細(xì)菌；16S rDNA克隆文庫

? 責(zé)任作者, 副教授, xiaoyucnu@126.com

水資源短缺已成為制約北京市發(fā)展的關(guān)鍵因素,而再生水的利用不僅可有效緩解城市水資源短缺狀況,同時(shí)也可解決城市河道水體水量短缺及水質(zhì)惡化等問題[1].但由于再生水中存在多種病原微生物、微量有毒有害化學(xué)物質(zhì)、較高的鹽分和氮磷等營養(yǎng)物質(zhì), 其利用帶來的風(fēng)險(xiǎn)不容忽視[2].人工濕地不僅具有出水水質(zhì)穩(wěn)定、投資低、耗能低、抗沖擊力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),而且能有效去除再生水水體中的氮、磷、有機(jī)物及重金屬等污染物.因而,人工濕地是目前城市河湖景觀再生水補(bǔ)水前水質(zhì)改善的普遍方式[3-7].

濕地植物作為濕地水質(zhì)凈化的主力軍,可以通過直接吸收和存儲的方式利用水體中的營養(yǎng)元素, 進(jìn)而在植物衰亡季節(jié)通過對其收割實(shí)現(xiàn)濕地富營養(yǎng)物質(zhì)凈化效能[8].然而濕地植物僅能吸收同化一少部分的污染物的,而植物根圍微生物在凈化系統(tǒng)中承擔(dān)著水中污染物去除的主要任務(wù)[9].多種微生物棲息于植物根圍和內(nèi)部, 其中植物體內(nèi)細(xì)菌較根圍細(xì)菌更不容易受干燥、紫外輻射等外部環(huán)境因素的干擾,且不同種類的植物內(nèi)生細(xì)菌之間通過定殖和運(yùn)轉(zhuǎn)能夠形成一個動態(tài)的平衡系統(tǒng)達(dá)到穩(wěn)定的生存空間,在植物修復(fù)、水體凈化等方面具有廣泛的生態(tài)學(xué)意義[10-11]. Dee等[10]從浮水草本植物水葫蘆中分離到的Enterobacter sp. SUVB4內(nèi)生細(xì)菌,可以促進(jìn)生長素的合成、鐵載體的形成和難溶性磷的溶解;Ho 等[11]從濕地植物蘆葦中分離出Achromobacter xylosoxidans F3B內(nèi)生細(xì)菌,可調(diào)控植物修復(fù)兒茶酚污染.然而對于以再生水為補(bǔ)充水源的人工濕地植物根內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性及其與水質(zhì)特征對應(yīng)關(guān)系的研究少有報(bào)道.基于此,本文采用16S rDNA克隆文庫技術(shù)對以再生水為補(bǔ)充水源的人工濕地中香蒲根內(nèi)生細(xì)菌群落進(jìn)行分析,揭示濕地植物根內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性特征以及其根內(nèi)生細(xì)菌與水環(huán)境因子的關(guān)系,預(yù)期為濕地微生物在再生水凈化及再生水補(bǔ)水濕地水生態(tài)恢復(fù)提供響應(yīng)的對策.

1　材料與方法

1.1研究區(qū)概況

白河人工濕地位于北京市北部,屬于半濕潤、半干旱區(qū),四季分明,全年降水量470～600mm,降水集中于夏季占全年降水量的2/3;平均氣溫13.1℃ ;日照時(shí)數(shù)2954.5h,屬大陸性季風(fēng)氣候.白河引用水源主要為再生水.本研究區(qū)位于距白河支流的密云再生水廠再生水排水口下游約50m 處,密云再生水廠位于白河左岸,年實(shí)際處理污水為919萬m3,出水水質(zhì)指標(biāo)滿足北京市《水污染排放標(biāo)準(zhǔn)》(DB11/307-2005)[12]中一級A排放標(biāo)準(zhǔn),出水主要回用于河道景觀用水及市政雜用.該水廠再生水以暗渠方式補(bǔ)給流入濕地,經(jīng)濕地凈化的再生水通過溢流壩的形式在濕地下游形成河道景觀.濕地面積約為2.1萬m2,濕地植物以大型水生維管束植物香蒲為主,其根系發(fā)達(dá),繁殖能力強(qiáng),通氣組織較為發(fā)達(dá),是人工濕地中凈化水質(zhì)常用的植物之一.

1.2材料與方法

1.2.1樣品采集及DNA提取選取白河濕地植物香蒲根為研究對象,于2013年6月中下旬植物生長旺盛期進(jìn)行樣品采集.在密云再生水廠再生水排水口下游約50m處合理設(shè)置采樣點(diǎn),依據(jù)徑向水流離岸2m、水深30cm處均勻布設(shè)5個采樣點(diǎn),采集高約2.5m香蒲,將所采集到的香蒲根樣品混合,迅速置于冰上,帶回實(shí)驗(yàn)室處理.將新鮮香蒲根置于震蕩儀震蕩,以去除根表面附著基質(zhì),選取1g健康的表面無附著物的香蒲新鮮根組織,用無菌水徹底沖洗干凈后,依次在70%乙醇中浸泡3min,5% 次氯酸鈉中浸泡5min,70% 乙醇清洗30s,用無菌水沖洗5～7次[13],最后將消菌結(jié)束的根組織用無菌濾紙將其表面多余水分吸干,將最后一次清洗水均勻涂布于LB培養(yǎng)基上, 設(shè)3個平行,28 ℃培養(yǎng)72h,以驗(yàn)證表面消菌效果.采用植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取香蒲根組織樣品的基因組DNA.提取后的基因組DNA用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度,將有效的目的基因組DNA置于-20℃保存,備用.

1.2.2香蒲根內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA PCR擴(kuò)增、克隆文庫的構(gòu)建以及獲取核酸登錄號選用正反向通用引物799f (5'-AACAGGATTAGATACCCTG-3')和1492r(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')對香蒲根組織樣品內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA基因進(jìn)行擴(kuò)增.PCR反應(yīng)體系(25μL)包括2μL正反向引物,12.5μL的2×Taq PCR Master Mix,8.5μL的ddH2O,2μL的DNA 模板.PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min;30個循環(huán)的常規(guī)PCR (94℃變性50s,54℃退火50s,72℃引物延伸1min); 72℃延伸7min;4℃保存.PCR產(chǎn)物采用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測.

割膠純化PCR產(chǎn)物,與pGEM-T Easy載體連接,轉(zhuǎn)化PCR產(chǎn)物,涂板,37℃培養(yǎng)16～18h后,篩選陽性克隆子,利用(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)、DNAdist(選擇jukes-cunter算法),通過mothur軟件計(jì)算克隆文庫的OTUs、覆蓋度C值、Shannon-Wiener index.經(jīng)過序列測定的陽性克隆,利用mothur軟件將相似性高于97%的序列劃分為1個OTU.所得測序結(jié)果利用BLAST軟件在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對,確定相似性菌株與已知序列的同源關(guān)系.

將已知序列通過 Sequin 批量提交至GenBank,獲得的序列登錄號為KP895224-KP895410.

1.3水質(zhì)指標(biāo)監(jiān)測

分別于2012年1月～2013年11月份逐月對白河有再生水補(bǔ)給人工濕地上游(中加公司)、補(bǔ)水口(再生水排放口)和濕地下游(潮匯大橋)共3個監(jiān)測斷面,采用定點(diǎn)水環(huán)境要素的方法監(jiān)測水質(zhì)指標(biāo).具體的監(jiān)測的指標(biāo)有Ca2+、Fe2+、K+、 Mg2+、Mn2+、Na+、F-、Cl-、、、總氮(TN)、總磷(TP)、、、、高錳酸鉀指數(shù)(CODMn)、氨氮(-N)、生物需氧量(BOD5)、TDS、溶解氧(DO)、pH值共21項(xiàng).其中,氨氮(-N)由離子色譜儀(ICS-1500、 ICS-90,Dionex,the United States)測定,總磷(TP)采用鉬酸銨分光光度法測定,總氮(TN)采用N/C分析儀(Multi N/C, Analytik-jena, Germany)測定,酸堿度pH值、溶解氧(DO)采用水質(zhì)儀(Hydrolab Datasonde5 5X,Hach,the United States)現(xiàn)場測定,其他水質(zhì)指標(biāo)依據(jù)地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB3838-2002)中規(guī)定的方法測定.所獲得的逐月水質(zhì)檢測數(shù)據(jù)采用多元統(tǒng)計(jì)分析方法中判別分析進(jìn)行分析研究.各類統(tǒng)計(jì)方法由Office Excel 2007和SPSS 18.0實(shí)現(xiàn).

2　結(jié)果與分析

2.1水質(zhì)監(jiān)測結(jié)果

表1　水質(zhì)監(jiān)測指標(biāo)和和國家地表水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Table 1　Summary statistics of measured parameters and the national standards for surface water quality

通過水質(zhì)分析獲得水質(zhì)參數(shù)的統(tǒng)計(jì)特征,依據(jù)研究區(qū)不同時(shí)期水質(zhì)參數(shù)的統(tǒng)計(jì)特征及其點(diǎn)位判別結(jié)果見表1.由表1可以看出,河道氮磷污染尤為嚴(yán)重,其中,(32.37mg/L)、TP(1.39mg/L)和TN(46.03mg/L)分別超過地表水國家Ⅱ類標(biāo)準(zhǔn)的3倍、5倍以及92倍.通過對濕地上游、排水口和下游不同空間點(diǎn)位采用逐步判別分析篩選出TN、TP、-N、Na+、、、CODMn,回代驗(yàn)證正確率同樣為90.5%,表示從統(tǒng)計(jì)學(xué)的角度講再生水補(bǔ)水及濕地凈化主要對這7項(xiàng)指標(biāo)產(chǎn)生顯著影響.再生水中豐富的N、P等無機(jī)組分是造成河道TN、TP、嚴(yán)重超標(biāo)的主要原因,而濕地在TN、TP和的去除方面發(fā)揮重要作用,尤其是TN和TP去除率達(dá)到了42.15%和47.34%,其次是去除率達(dá)到28.56%.其次由于再生水中Na+、K+、Ca2+、Mg2+、、等陰陽子的增加導(dǎo)致河道水質(zhì)TDS呈明顯的升高趨勢,尤其再生水消毒過程使得再生水排水口Cl-濃度超過河道上游7倍以上.以CODMn為代表的有機(jī)污染物與濕地內(nèi)高密度的挺水、沉水植物種植及其藻類的繁殖具有密切的關(guān)系,是導(dǎo)致濕地下游有機(jī)污染增加的主要原因.

2.2香蒲根內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA基因多樣性及系統(tǒng)發(fā)育分析

通過計(jì)算克隆文庫的OTUs、覆蓋度C值、Shannon-Wiener index和繪制稀釋曲線(Rarefaction Curve)評價(jià)克隆文庫的大小及內(nèi)生細(xì)菌多樣性.通過對香蒲根內(nèi)生細(xì)菌群落16S rDNA克隆文庫的構(gòu)建共檢測350個克隆子,最終經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測獲得322個陽性克隆子并測序.經(jīng)mothur軟件將陽性克隆子序列相似性高于97%的序列劃分為1個OTU,共劃分69個OTUs,覆蓋度C值為91%,可基本反映香蒲根內(nèi)生細(xì)菌種群的多樣性信息.依據(jù)97%遺傳距離獲得的香蒲根內(nèi)生細(xì)菌chao豐富度指數(shù)為88.33、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)為3.213,說明香蒲根內(nèi)生細(xì)菌較為豐富.

已知序列經(jīng)BLAST軟件比對分析,其中代表94.73%的克隆序列與可培養(yǎng)細(xì)菌的已知有效序列的相似性高于97%,代表5.27%的克隆序列與非培養(yǎng)細(xì)菌的有效序列相似性在96%以上.序列分析表明,該克隆文庫包括4大類群細(xì)菌,最優(yōu)勢類群為變形桿菌門Proteobacteria,包含299個克隆子,占總克隆數(shù)的92.85%,其中包括Gammaproteobacteria(203個克隆子,63.04%)、Betaproteobacteria (84個克隆子,26.09%)、Epsilonproteobacteria(8個克隆子,2.48%)、Alphaproteobacteria(4個克隆子,1.24%);其次為厚壁菌門Firmicutes(4個克隆子,1.24%)、疣微菌門Verrucomicrobia(2個克隆子, 0.62%)、擬桿菌門Bacteroidetes(1個克隆子,0.31%);還包括4.65%非培養(yǎng)未確定種屬的細(xì)菌.香蒲根內(nèi)生細(xì)菌克隆文庫中各類群占據(jù)不同比例及不同的種群結(jié)構(gòu),具體組成見表2.

表2　香蒲根內(nèi)生細(xì)菌群落組成分析Table 2　Communities component analysis of endophytic bacteria within Typha. root

續(xù)表2

續(xù)表2

2.2.1變形桿菌Gammaproteobacteria為該克隆文庫最優(yōu)勢類群,共包括203個克隆子,代表了32個OTUs,占總克隆子數(shù)的63.04%,包含假單胞菌目(Pseudomonadales)(118個克隆子,18個OTUs,36.65%)、腸桿菌目(Enterobacteriales) (65個克隆子,11個OTUs,20.18%)、氣單胞菌目(Aeromonadales) (20個克隆子,3個OTUs,6.21%).假單胞菌目中有109個克隆子與假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)相似性為98%～100%,其中11個克隆子與假單胞菌科(Pseudomonadaceae)中Pseudomonas putida同源性達(dá)100%,4個克隆子與Pseudomonas alcaligenes同源性達(dá)100%,2個克隆子與Pseudomonas syringae同源性為99%; 有7個克隆子與莫拉菌科(Moraxellaceae)中不動桿菌屬(Acinetobacter sp.)相似性為99%～100%,其中2個克隆子與Acinetobacter baylyi同源性達(dá)100%;有2個克隆子與假單胞菌科(Pseudomonadaceae)中纖維弧菌屬(Cellvibrio sp.)的相似性為98%,且與Cellvibrio gandavensis同源性達(dá)100%.腸桿菌目中有35個克隆子與腸桿菌科(Enterobacteriaceae)中Rahnella sp.的相似性為98%～100%,其中29個克隆子與Rahnella aquatilis同源性達(dá)100%;有12個克隆子與Raoultella sp.的相似性為100%,并與Raoultella ornithinolytica同源性為100%;有6個克隆子與腸桿菌屬(Enterobacter sp.)的相似性在98%以上,但與Enterobacter aerogenes同源性僅為82%;有5個克隆子與克雷伯氏菌屬(Klebsiella sp.)的相似性為98%,但同源性較低;有2個克隆子與志賀氏菌屬(Shigella sp.12L_11)的相似性及同源性均為100%;其余4個克隆子分別與沙雷氏菌屬(Serratia sp.HC3-14)、愛文氏菌屬(Ewingella sp.KTHG3-2)及哈夫尼菌屬(Hafnia sp.HC4-16)的相似性均為99%.氣單胞菌目包含20個克隆子,19個與氣單胞菌科(Aeromonadaceae)中氣單胞菌屬(Aeromonas sp.)的相似性為99%,其中8個克隆子與Aeromonas veronii同源性為100%;1個克隆子與Tolumonas osonensis的相似性及同源性均為100%.總體來說,Gammaproteobacteria菌群中假單胞菌目包含的內(nèi)生細(xì)菌具有最高豐富度,腸桿菌目包含的內(nèi)生細(xì)菌具有最豐富的多樣性,其中最優(yōu)勢菌屬為假單胞菌屬,其次為Rahnella sp.及氣單胞菌屬.

Betaproteobacteria為該克隆文庫的次優(yōu)勢類群,共包括84個克隆子,代表了26個OTUs,占總克隆子數(shù)的26.09%,包含伯克氏菌目(Burkholderiales)(48個克隆子,18個OTUs, 14.92%)、奈瑟氏球菌目(Neisseriales)(25個克隆子,2個OTUs,7.76%)、紅環(huán)菌目(Rhodocyclales)(9個克隆子,5個OTUs,2.80%)、嗜甲基菌目(Methylophilales)(2個克隆子,1個OTUs,0.62%).伯克氏菌目中有16個克隆子與叢毛單胞菌科(Comamonadaceae)中食酸菌屬(Acidovorax sp.)的相似性為98%～99%,其中2個克隆子與Acidovorax citrulli為98%;有8個克隆子與紅育菌屬(Rhodoferax sp.)的相似性為99%,其中2個克隆子與其同源性達(dá)100%;有6個克隆子與Pelomonas sp. 的相似性為99%,同源性僅為83%; 有5個克隆子與紅長命菌屬(Rubrivivax sp.)的相似性為98%以上;另外有5個克隆子與Aquincola tertiaricarbonis的相似性為99%,但同源性僅為82%;有3個克隆子與噬氫菌屬(Hydrogenophaga sp.)的相似性為99%～100%,其中2個克隆子與Hydrogenophaga taeniospiralis同源性達(dá)100%,1個克隆子與Hydrogenophaga bisanensis同源性達(dá)100%;有2個克隆子與Curvibacter sp.的序列同源性為100%;其余3個克隆子分別與叢毛單胞菌屬(Comamonas sp.R15-4)、纖發(fā)菌屬(Leptothrix sp.LCM014)和Sphaerotilus natans的相似性分別為99%、99%、97%.奈瑟氏球菌目中23個克隆子與Aquitalea magnusonii相似性及同源性均為100%,2個克隆子與Vitreoscilla filiformis相似性為99%,同源性為100%.紅環(huán)菌目中3個克隆子與紅環(huán)菌科(Rhodocyclaceae)中Dechloromonas denitrificans相似性為99%,同源性為100%;2個克隆子與Ferribacterium limneticum相似性為99%,同源性為98%;2個克隆子與Propionivibrio pelophilus相似性為98%,同源性為98%;其余2克隆子分別與Sterolibacterium sp. SB90和Uliginosibacterium sp. 24D 相似性均為99%,同源性均為100%.嗜甲基菌目中的2個克隆子與嗜甲基菌科(Methylophilaceae)中Methylotenera mobilis相似性為99%,同源性為100%.總體來說, Betaproteobacteria菌群中伯克氏菌目包含的內(nèi)生細(xì)菌具有最高的豐富度及多樣性,其次為奈瑟氏球菌目.最優(yōu)勢屬為Aquitalea sp.,其次為食酸菌屬和紅育菌屬.

Epsilonproteobacteria中共包括8個克隆子,代表了2個OTUs,占總克隆子數(shù)的2.48%,其中2個克隆子與彎曲菌科(Campylobacteraceae)中Arcobacter butzleri相似性為99%,同源性100%.Alphaproteobacteria中共包括4個克隆子,代表了2個OTUs,占總克隆子數(shù)的1.24%,2個克隆子與根瘤菌科(Rhizobiaceae)的中華根瘤菌屬(Sinorhizobium sp. Van49)的相似性為99%,同源性達(dá)100%;2個克隆子與Agrobacterium vitis的相似性為99%,同源性達(dá)100%.

2.2.2非變形桿菌厚壁菌門包含4個克隆子,代表1個OTU,占總克隆子數(shù)的1.24%,該克隆子與明串珠菌科(Leuconostocaceae)中Leuconostoc pseudomesenteroides的相似性為99%,同源性為100%.疣微菌門包含2個克隆子,代表1個OTU, 與Uncultured Verrucomicrobia BC_CK737相似性為95%,同源性為100%,為非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌.擬桿菌門僅包含1個克隆子,代表1個OTU,與紫單胞菌科(Porphyromonadaceae)中Paludibacter sp.MOBA65的相似性為98%,同源性為100%.

3　討論

3.1香蒲根內(nèi)生細(xì)菌功能多樣性特征

大多數(shù)濕地植物內(nèi)生細(xì)菌以根部最豐富,且香蒲根系發(fā)達(dá),通過16S rDNA克隆文庫構(gòu)建發(fā)現(xiàn)其根組織內(nèi)生細(xì)菌較為豐富,其中變形桿菌門為最優(yōu)勢類群,占文庫總量的92.85%.Li等[18,63]通過16S rDNA克隆文庫構(gòu)建方法研究翠湖人工濕地香蒲及蘆葦根內(nèi)生細(xì)菌,結(jié)果表明香蒲及蘆葦根內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢類群均為變形桿菌門.孫磊等[13]研究水稻根內(nèi)生細(xì)菌發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢類群為變形桿菌門,其中Gamaproteobacteria為最優(yōu)勢類群.李虎等[64]通過對濱海濕地系統(tǒng)中互花米草根內(nèi)生細(xì)菌組成及多樣性研究發(fā)現(xiàn)變形桿菌門為優(yōu)勢類群,其中Gamaproteobacteria占文庫比例最大.

Gammaproteobacteria作為該克隆文庫最優(yōu)勢類群,其中Pseudomonas、Aeromonas、 Enterobacter為濕地植物內(nèi)生細(xì)菌常見菌屬. Chen W M等從蘆葦、菹草、睡蓮、大茨藻中均獲得了Pseudomonas,Aeromonas和Enterobacter則存在于其中兩種植物體內(nèi)[55]. Pseudomonas專性需氧,普遍存在于濕地中,其中優(yōu)勢種為Pseudomonas panacis包含22個克隆子,具有降解硝酸鹽和亞硝酸鹽的特性[48];其次Pseudomonas fluorescens和Pseudomonas putida均具有良好的除磷效果[49,51];總之,Pseudomonas可以將多種物質(zhì)作為能源和碳源,對有毒物質(zhì)具有耐受性[18],同時(shí)通過固氮促進(jìn)植物生長,也能夠以還原性硫化物作為硫的來源,對錳、鉛、鎘等金屬或重金屬也有吸收作用[52-53].次優(yōu)勢菌屬Rahnella中Rahnella aquatilis包含29個克隆子,且同源性100%,該屬具有固氮和除磷作用,Klebsiella也具有固氮作用[18,55].12個克隆子與Raoultella ornithinolytica同源性為100%,張宇燕等研究該菌屬于好氧反硝化菌(脫氮),在以硝酸鹽或亞硝酸鹽為唯一碳源時(shí),Raoultella ornithinolytica對其去除率分別為26%和67%,脫氮效率較高[58]. Aeromonas廣泛的分布于淡水、土壤中,可以影響氨、硝酸鹽和磷酸鹽濃度[18],其中包含11個克隆子的Aeromonas hydrophila通過參與氮循環(huán),促進(jìn)植物生長,并在特定環(huán)境作為一種致病菌存在,引起人類敗血癥或腹瀉[18,39].朱麗麗等對濕地植物對葉榕榕果內(nèi)生細(xì)菌抗病性研究表明, Acinetobacter、Serratia、Pseudomonas均對植物病原菌有不同程度的抑制作用,其中Acinetobacter的廣譜性最大,且該屬在除磷系統(tǒng)中具有重要作用[33],參與硫循環(huán)[65].Dee B等發(fā)現(xiàn)水葫蘆中的Enterobacter可以促進(jìn)植物生長[10],如可以促進(jìn)擬南芥的生長,也可以抑制致病菌[55]. Gammaproteobacteria類群中存在一些病原菌,如Shigella是常見的病原菌,能夠引發(fā)人類細(xì)菌性痢疾[25].

Betaproteobacteria作為該文庫次優(yōu)勢類群,占克隆文庫的26.06%,其中23個克隆子與分離自湖水中的Aquitalea magnusonii同源性為100%,為該克隆文庫最優(yōu)勢種,分離自湖中的腐殖質(zhì)樣品,能夠利用葡萄糖、有機(jī)酸等作為能源,屬于Neisseriaceae,該菌科廣泛分布于湖水、土壤、淤泥中,參與反硝化作用,具有脫氮效果[66].有16個克隆子與Acidovorax的同源性較高,沈海樺等發(fā)現(xiàn)在腐殖酸微污染水中隨著腐殖酸初始濃度增加,食酸菌屬菌株MN33.2對CODMn的去除率呈增加趨勢[17].8個克隆子與Rhodoferax同源性達(dá)100%,該屬能夠以硝酸鹽作為電子受體和氮源進(jìn)行光合作用[25],其中Rhodoferax ferrireducens屬于產(chǎn)電微生物,能夠分解有機(jī)物[24].Pelomonas包含6個克隆子,能夠固氮和氧化氫[20].分別有5個克隆子與Rubrivivax和Aquincola同源性為98%以上,其中Rubrivivax在無光或有光條件下均可以產(chǎn)氫和代謝CO[19],Aquincola tertiaricarbonis是2007年Lechner等從德國一處污染甲基叔丁基醚的地下水中分離出來的新屬種,而后Muller等發(fā)現(xiàn)該菌能夠利用甲基叔丁基醚為唯一能源和碳源,對這類污染物的主要代謝產(chǎn)物具有很好降解效果,有助于環(huán)境污染的生物修復(fù)[29].共有3個克隆子與Hydrogenophaga taeniospiralis和Hydrogenophaga bisanensis同源性達(dá)100%,Lambo等人發(fā)現(xiàn)Hydrogenophaga taeniospiralis能夠在聯(lián)苯或多氯聯(lián)苯的介質(zhì)中生長,并可以降解水中有機(jī)污染物[22].3個克隆子與Dechloromonas denitrificans相似性為99%,該菌為兼性好氧細(xì)菌,分離自蚯蚓腸道,參與反硝化過程,能夠還原硝酸鹽為氮?dú)鈁32].另外包含2個克隆子的Ferribacterium具有除鐵作用,占文庫同樣比例的Propionivibrio pelophilus在PAOs中具有重要的聚磷作用[33].

Epsilonproteobacteria中8個克隆子屬于Arcobacter,該屬可以降解纖維素,也屬于人畜共患的水源性及食源性病原菌[67].在Alphaproteobacteria中分別有2個克隆子與Sinorhizobium和Agrobacterium同源性在99%以上,其中Sinorhizobium具有固氮作用, Agrobacterium一般分離自根瘤,可與根瘤聯(lián)合發(fā)生固氮作用,促進(jìn)植物生長[14],目前在紅車軸草、胡蘿卜、馬鈴薯等多種植物體內(nèi)分離到Agrobacterium.

Firmicutes中4個克隆子均屬于Leuconostoc,該屬在以蛋白胨、胰蛋白胨和酪蛋白胨為氮源刺激其生長及酸化活性方面沒有差別,都可以作為氮源[62].Verrucomicrobia包含2個克隆子,在該文庫中所占比例最低,具有降解高分子多糖類物質(zhì)的特性[29].Bacteroidia中1個克隆子與Paludibacter相似性為98%,屬于Porphyromonadaceae,一般分離自水稻田,屬于厭氧菌,可以分解葡萄糖和乙酸,但不能將其作為碳源[15].

3.2香蒲根內(nèi)生細(xì)菌與水環(huán)境因子的關(guān)系

總氮、總磷、氨氮、BOD及細(xì)菌等是分析水質(zhì)污染程度及清潔程度的重要指標(biāo)[68].微生物是濕地生態(tài)系統(tǒng)重要組成部分,其數(shù)量及種類影響水中各類污染物的去除效果,因此細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與水環(huán)境質(zhì)量呈協(xié)同變化特征.

再生水排放口水體中TP的均值為2.64mg/L,而濕地下游水體中TP的均值為1.39mg/L,濕地在磷去除方面發(fā)揮重要作用,其中在濕地香蒲根內(nèi)生細(xì)菌克隆文庫中有12.42%的克隆子參與濕地磷循環(huán),如Aeromonas、Acinetobater、Rhodocyclus.但相對于總氮,細(xì)菌的除磷能力較低,而基質(zhì)的吸附、沉淀可以捕獲大量磷元素[72],且可能發(fā)揮著重要作用.濕地植物僅通過利用和實(shí)現(xiàn)對磷元素的直接吸收[73],其作用有限,一般占總磷去除率的5%[74].

與再生水排放口相比,濕地下游以CODMn為代表的有機(jī)污染物不同程度的增加,一方面與濕地內(nèi)高密度的挺水、沉水植物種植及其藻類的繁殖密切相關(guān),另一方面也與微生物參與到濕地生態(tài)系統(tǒng)中有機(jī)質(zhì)的分解和營養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)有關(guān),克隆文庫有26.08%的克隆子參與濕地碳循環(huán),如Methylotenera mobilis以甲烷等為生長能源[28];Aquincola tertiaricarbonis可以降解有機(jī)物,參與碳循環(huán);Rubriviviax gelatinosus、Aquincola tertiaricarbonis和Hydrogenophaga taeniospiralis均可代謝有機(jī)污染物.

相對于海岸鹽沼濕地來說,淡水濕地的硫酸鹽含量偏低[66].本研究中再生水口的均值為80.17mg/L,濕地下游的均值為79.06mg/L,值變化不大.本研究中參與硫循環(huán)的菌屬可能為Pseudomonas,沒有發(fā)現(xiàn)典型脫硫菌種,而Li等通過構(gòu)建克隆文庫發(fā)現(xiàn)翠湖濕地香蒲根內(nèi)生細(xì)菌群落中存在典型脫硫菌屬,這可能與樣品組織差異及PCR過程中擴(kuò)增片段差異有關(guān).

在本研究區(qū)監(jiān)測的水質(zhì)要素中,濕地下游出水中的Ca2+、Fe2+、K+、Mg2+等金屬元素均值均低于再生水排放口處均值,說明濕地在吸收重金屬離子方面作用顯著.在克隆文庫中11.8%的克隆子可吸收重金屬物質(zhì),如Ferribacterium屬于除鐵菌.研究表明,微生物能夠促進(jìn)超積累植物生長,進(jìn)而提高對植物對重金屬的吸收,植物內(nèi)生細(xì)菌能夠提高重金屬的溶解態(tài)含量,促進(jìn)植物對重金屬的吸收及在其體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)[75].微生物群落的形成受鐵、錳離子選擇性作用的影響[76].如實(shí)驗(yàn)中獲取的優(yōu)勢屬Pseudomonas可提高環(huán)境中溶解態(tài)鎘與鉛的含量,提高對重金屬的吸收,其中Pseudomonas orientalis和Pseudomonas protegens均具有耐鎘特性.此外,濕地香蒲根內(nèi)生細(xì)菌群落中存在部分致病菌和具有抑制病原菌的菌株,且分布比例相當(dāng),這可能是植物體達(dá)到健康調(diào)節(jié)的平衡結(jié)果.

4　結(jié)論

4.1通過構(gòu)建香蒲根內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA克隆文庫表明,香蒲根內(nèi)生細(xì)菌群落具有豐富多樣性,共包括4大類群:最優(yōu)勢類群為變形桿菌門Proteobacteria(92.85%),其中包括Gammaproteobacteria(63.04%)、Betaproteobacteria (26.09%)、Epsilonproteobacteria (2.48%)、Alphaproteobacteria(1.24%);其次為厚壁菌門Firmicutes (1.24%);疣微菌門Verrucomicrobia(0.62%);擬桿菌門Bacteroidetes(0.31%);另外包括4.65%非培養(yǎng)未確定種屬的細(xì)菌.

4.2香蒲根內(nèi)不同菌屬的內(nèi)生細(xì)菌按不同比例參與濕地凈化系統(tǒng)的碳、氮、磷、硫等循環(huán),濕地凈化系統(tǒng)在TN、TP和NO3-的去除方面作用顯著.

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Endophytic bacterial diversity in roots of typha and the relationship of water quality factors in reclaimed water replenishment constructed wetland.

ZHANG Rui-jie, ZHANG Qiong-qiong, HUANG Xing-ru, GUO Xiao-yu*(College of Resources Environment and Tourism, Capital Normal University, Beijing 100048, China). China Environmental Science, 2016,36(3)：875～886

Abstract：In order to understand the purification processes of bacteria communities in reclaimed water replenishment constructed wetlands, this study employed 16S rDNA clone library technique to analyze the community diversity of endophytic bacteria in roots of typha, which growed in Baihe constructed wetland in Miyun. We further investigated the relationship between endophytic bacteria communities and water quality factors. The results of 16S rDNA clone library showed that community included four major groups: the most dominant phylum was Proteobacteria (92.85%), including Gammaproteobacteria (63.04%), Betaproteobacteria (26.09%), Epsilonproteobacteria (2.48%) and Alphaproteobacteria (1.24%); The second group was Firmicutes (1.24%); the third phylum was Verrucomicrobia (0.62%); the fourth phylum was Bacteroidetes (0.31%). Additionally, 4.65% bacteria was unclassified. Stepwise discriminant analysis suggested that endophytic bacteria in roots of typha were significantly important in the geochemical cycle in reclaimed water replenishment wetlands. Specificially, 41.60% clones involved in the nitrogen cycle in wetlands, 12.42% clones involved in the phosphorus cycle in wetland, 14.92% of clones involved in the carbon cycle in wetland, 26.08% of clones involved in the metabolism of organic matter, 11.8% of the clones absorption of heavy metal matter. Thus, endophytic bacteria in plants may play a major role in the process of removal of nitrogen, nitrification and denitrification except for phosphorus removal. As our results concluded through single sampling, more evidences should be abtained by multi temporal sampling.

Key words：reclaimed water；constructed wetland；endophytic bacteria within typha root；16S rDNA clone library

作者簡介：張瑞杰(1992-),男,山東省東營人,首都師范大學(xué)碩士研究生,主要研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物.

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(40901281),北京市教育委員會科技計(jì)劃面上項(xiàng)目(KM201310028012)

收稿日期：2015-08-30

中圖分類號：X172

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-6923(2016)03-0875-12