張家禹,劉麗麗,李國超,余凱敏,呂　鵬,閆艷春(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院,北京 100081)

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毒死蜱對斑馬魚胚胎氧化應(yīng)激效應(yīng)研究

張家禹,劉麗麗,李國超,余凱敏,呂鵬,閆艷春*(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院,北京 100081)

摘要：以斑馬魚為模型,研究了毒死蜱對斑馬魚胚胎形態(tài)學(xué)的影響,及其對胚胎的氧化應(yīng)激和氧化損傷作用.將斑馬魚胚胎暴露在梯度濃度的毒死蜱溶液中96h后,發(fā)現(xiàn)毒死蜱會(huì)造成斑馬魚胚胎嚴(yán)重畸形甚至死亡,其96h半致死濃度為1.18mg/L.對氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)及抗氧化酶活性和丙二醛(MDA)含量進(jìn)行檢測,結(jié)果表明,在毒死蜱脅迫下抗氧化酶(SOD、CAT)活性降低,并且其編碼基因(Cu/Zn-sod、Mn-sod、cat)的表達(dá)受到抑制;但在低濃度毒死蜱脅迫下,抗氧化酶活性并沒有受到顯著影響,而抗氧化酶基因的表達(dá)對毒死蜱更加敏感.毒死蜱能引起gstp2的表達(dá)上調(diào),但GST活性與gstp2的表達(dá)變化并不一致.處理組胚胎中nrf2表達(dá)上調(diào),從而上調(diào)抗氧化蛋白和II相解毒酶基因的表達(dá).毒死蜱脅迫下,基因ucp2、cox1表達(dá)下調(diào),能夠減少呼吸鏈ROS的產(chǎn)生.同時(shí)基因bcl2表達(dá)下調(diào),表明凋亡的平衡受到破壞.毒死蜱處理組中MDA含量顯著升高,說明毒死蜱能造成斑馬魚胚胎氧化損傷.

關(guān)鍵詞：毒死蜱；斑馬魚胚胎；氧化應(yīng)激；氧化損傷

* 責(zé)任作者, 教授, yanyanchun@caas.cn

毒死蜱是一種高效、廣譜、中等毒性的有機(jī)磷類殺蟲殺螨劑,對害蟲具有觸殺、胃毒和熏蒸作用.自從國家對高毒農(nóng)藥的禁限用政策出臺(tái)后,毒死蜱作為主要替代品種之一,廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和城市害蟲的防治[1-2].毒死蜱的大量使用對生態(tài)環(huán)境已產(chǎn)生了負(fù)面影響,研究顯示可在多種水體中檢測到其殘留[3-4],在農(nóng)作物種植區(qū)附近的水域中其殘留量往往更高,水稻田出水中毒死蜱殘留最高達(dá)26.07μg/L[5].毒死蜱對于多數(shù)水生生物屬于高毒性物質(zhì),并且可以通過生物富集和生物放大作用對水體食物鏈產(chǎn)生影響,最終威脅人類的健康[6-7].

斑馬魚(Danio rerio)具有體型小、易于管理、產(chǎn)卵量大、早期胚胎便于觀察等特點(diǎn),已成為毒理學(xué)研究領(lǐng)域的模式生物[8-10].目前斑馬魚被廣泛應(yīng)用于發(fā)育毒理學(xué)、內(nèi)分泌干擾和生殖毒理學(xué)、神經(jīng)毒理學(xué)、納米毒理學(xué)等毒理學(xué)研究中,成為揭示化學(xué)品對人類健康和環(huán)境的影響及其機(jī)制的重要模式生物,并促進(jìn)了新技術(shù)和新分析方法的發(fā)展[11].

環(huán)境污染物能夠破壞機(jī)體氧化與抗氧化之間的平衡,從而導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)活性氧(ROS)等自由基產(chǎn)生過多,細(xì)胞自身無法及時(shí)清除,并產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物,進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體氧化損傷[12-15].機(jī)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)包括酶促系統(tǒng)(CAT、SOD、GSH 等) 和非酶促系統(tǒng)(維生素類、生物堿類等)[16].已有研究報(bào)道,毒死蜱會(huì)引起鯉魚肝臟損傷及抗氧化系統(tǒng)的異常[17].高劑量毒死蜱能誘導(dǎo)小鼠肺組織細(xì)胞的抗氧化能力下降,造成肺組織的病理損傷[18].毒死蜱對蚯蚓SOD和CAT活性具有顯著抑制作用,同時(shí)會(huì)造成脂質(zhì)過氧化[19].本研究通過對氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)量及酶活性的檢測,探究毒死蜱對斑馬魚胚胎的毒性作用機(jī)制.

1　材料與方法

1.1材料

AB品系斑馬魚購自國家斑馬魚資源中心(CZRC,China Zebrafish Resource Center).

毒死蜱(Chlorpyrifos,CPF)購自于成都化夏化學(xué)試劑有限公司,其純度≥97%;谷胱甘肽—S轉(zhuǎn)移酶(GST)測定試劑盒(比色法)、過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒(可見光法)、丙二醛(MDA)測定試劑盒(TBA法)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒(羥胺法)、總蛋白(TP)測定試劑盒(帶標(biāo)準(zhǔn):考馬斯亮藍(lán)法)購自南京建成生物研究所.反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)(Takara);SYBR Premix Ex Taq II試劑盒(Takara).

1.2斑馬魚的養(yǎng)殖

AB品系野生型斑馬魚在獨(dú)立養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行養(yǎng)殖,自來水經(jīng)過活性炭過濾,紫外燈滅菌,在系統(tǒng)中自動(dòng)循環(huán),水溫控制在(28±0.5)℃,光周期14(光):10(暗).每天喂食2～3,食物為豐年蟲幼蟲.

胚胎收集方法.提前一個(gè)晚上將成年種魚按照雌雄2:1的比例裝入交配盒中,并用隔板將雌雄魚分開,第2d早上光照開始時(shí)(10h后)將隔板抽出,半個(gè)小時(shí)后收集胚胎.挑選發(fā)育正常的0.5～ 1.0hpf(孵化后小時(shí))的胚胎,隨機(jī)分裝于6孔塑料板中(10個(gè)胚胎/孔),每孔培養(yǎng)液體積為10mL.

1.3暴露方法

選用甲醇作為助溶劑.在處理液中,甲醇的濃度為0.025%.前期的研究表明,毒死蜱處理液中低濃度(＜0.1%)的甲醇不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果(數(shù)據(jù)未給出).設(shè)置6個(gè)毒死蜱暴露濃度,分別為0.25、0.50、0.75、1.00、1.25和1.50mg/L,每個(gè)濃度組中有20個(gè)胚胎,并設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù).6孔板的每個(gè)孔中加入10個(gè)發(fā)育正常的3hpf胚胎,加入10mL處理液.將胚胎置于恒溫培養(yǎng)箱中,溫度(28±0.5)℃,光周期14(光):10(暗).采用半靜態(tài)的試驗(yàn)方法,暴露總時(shí)間為96h,每24h更換一次溶液,并及時(shí)挑出死卵.

1.4斑馬魚胚胎形態(tài)學(xué)觀察

進(jìn)行CPF暴露處理后,每24h對斑馬魚胚胎進(jìn)行一次鏡檢觀察.統(tǒng)計(jì)分析胚胎畸形率和死亡率,并計(jì)算96h半致死濃度(96h-LC50).

1.5氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)分析

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)設(shè)立3個(gè)CPF濃度組,分別是0.24、0.47、0.94mg/L (1/5LC50、2/5LC50、4/5LC50).毒死蜱暴露96h后,每個(gè)濃度的胚胎分別取20枚保存,各3份.收集胚胎,液氮速凍,-80℃保存.

使用TRIzol試劑提取總RNA,260nm下估算總RNA濃度,質(zhì)量則通過260/280比率評估.使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳對RNA的質(zhì)量進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證.

樣品總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA.各目標(biāo)基因引物由上海生工公司合成(表1),經(jīng)驗(yàn)證所有引物擴(kuò)增效率均良好(90%～110%).qRT-PCR程序?yàn)?95℃ 30s、95℃ 5s、60℃ 45s、55℃ 10s.基因表達(dá)的差異倍數(shù)通過2-ΔΔCt方法計(jì)算.每個(gè)濃度組3個(gè)生物學(xué)重復(fù).

表1　氧化應(yīng)激相關(guān)基因和β-actin的引物Table 1　Primer sequences of antioxidant response-related genes and β-actin

1.6氧化應(yīng)激相關(guān)生化指標(biāo)檢測

設(shè)立3個(gè)CPF濃度組,分別是0.24、0.47、0.94mg/L (1/5LC50、2/5LC50、4/5LC50),每個(gè)濃度組3個(gè)平行,每個(gè)平行60個(gè)胚胎.CPF暴露96h 后,收集胚胎,液氮速凍,-80℃保存.

5%組織勻漿液的制備.按照重量(g):體積(mL)=1:19的比例加入19倍生理鹽水,首先使用超聲破碎儀冰水浴破碎斑馬魚胚胎,離心取上清,得到5%組織勻漿液.

使用南京建成生物研究所酶活檢測試劑盒,檢測各項(xiàng)生化指標(biāo),包括總超氧化物歧化酶(T-SOD)活力、過氧化氫酶(CAT)活力、谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GST)活力、丙二醛(MDA)含量和總蛋白(TP)含量.

1.7統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS20.0通過Levene檢驗(yàn)方法檢測數(shù)據(jù)的方差齊性,并進(jìn)行one-way ANOVA數(shù)據(jù)分析.P＜0.05作為統(tǒng)計(jì)顯著性的標(biāo)準(zhǔn),所有值表示方法均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE).

2　結(jié)果與討論

2.1結(jié)果

圖1　毒死蜱暴露96h對胚胎的致畸作用Fig.1　Teratogenetic effect of CPF on embryos after a 96exposure

圖2　毒死蜱暴露96h胚胎死亡率Fig.2　Effects of CPF on embryonic mortality after a 96exposure

2.1.1毒死蜱對斑馬魚胚胎發(fā)育影響本研究中,采用梯度濃度的毒死蜱(0.25、0.50、0.75、1.00、1.25和1.50mg/L)對斑馬魚胚胎進(jìn)行處理. 在96h觀察到的主要的幼魚畸形包括心包水腫、尾部彎曲和卵黃囊畸形(圖1b、c),并統(tǒng)計(jì)了這三種常見的畸形在毒死蜱0.25、0.50、0.75、1.00 和1.25mg/L處理組中的比例(圖1d),1.5mg/L處理組胚胎死亡率過高,沒有進(jìn)行畸形率的統(tǒng)計(jì).通過非線性曲線擬合得到毒死蜱96h半致死濃度為1.18mg/L (圖2).

2.1.2毒死蜱對斑馬魚胚胎氧化應(yīng)激相關(guān)基因的影響農(nóng)藥污染物可以改變機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)中相關(guān)基因的表達(dá)量,因此本研究選取斑馬魚的9個(gè)抗氧化相關(guān)基因作為參考,從轉(zhuǎn)錄水平揭示毒死蜱對斑馬魚胚胎氧化應(yīng)激效應(yīng)的發(fā)生機(jī)制.熒光定量PCR結(jié)果顯示(圖3),相對于空白對照組,0.24mg/L和0.47mg/L CPF處理組中基因Cu/Zn-sod表達(dá)顯著下調(diào)(0.54、0.22倍),并且呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系(圖3a).Mn-sod的表達(dá)量在高濃度CPF處理組中同樣顯著下調(diào),并呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系(圖3b).cat的表達(dá)在0.47mg/L和0.94mg/L CPF處理組中顯著下調(diào)(0.51、0.12倍),并且呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系(圖3c).gstp2表達(dá)在0.24mg/L和0.47mg/L CPF處理組中顯著上調(diào)(1.58、1.88倍),但在最高濃度組與對照組相比并無顯著差異,呈現(xiàn)倒“U”形的劑量-效應(yīng)關(guān)系(圖3d).在3個(gè)CPF處理組中,nrf2基因表達(dá)顯著上調(diào)(6.18、7.72、11.55倍),并且呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系(圖3e).keap1基因的表達(dá)在CPF處理組與對照組中無顯著差異(圖3f).ucp2的表達(dá)在0.47mg/L和0.94mg/L CPF處理組中顯著下調(diào)(0.68、0.34倍),并且呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系(圖3g).在0.47mg/L和0.94mg/L CPF處理組中,cox1顯著下調(diào)(0.65、0.38倍),并且呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系(圖3h).bcl2的表達(dá)在0.47mg/L和0.94mg/L CPF處理組中顯著下調(diào)(0.7、0.31倍),并且呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系(圖3i).

圖3　毒死蜱對氧化應(yīng)激相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響Fig.3　Effects of CPF on relative mRNA levels of antioxidant response-related genes與對照相比,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001

2.1.3毒死蜱對氧化應(yīng)激酶活性的影響農(nóng)藥污染物可以改變機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)中相關(guān)基因的表達(dá)量,進(jìn)而改變機(jī)體內(nèi)抗氧化酶的活性,同時(shí)也會(huì)造成脂質(zhì)過氧化.由圖4可見,經(jīng)0.24、0.47、0.94mg/L CPF處理后,胚胎總SOD活力分別是對照組的102%、81.3%、71.8%,0.94mg/L CPF處理組總SOD活力與對照組相比顯著降低,并呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系;處理組CAT活力分別是對照組的86.8%、76.7%、56.5%,CPF處理組CAT活力與對照組相比顯著降低,并呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系;處理組GST活力分別是對照組的136.7%、140.1%、119.5%;0.24、0.47、0.94mg/L CPF處理組MDA含量分別是對照組的305.4%、461.9%、558.1%,3個(gè)處理組與對照組相比顯著升高,并呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系.

2.2討論

本研究中,采用梯度濃度的毒死蜱對斑馬魚胚胎進(jìn)行處理,毒死蜱暴露96h后可以觀察到,毒死蜱誘導(dǎo)胚胎產(chǎn)生了3種常見畸形心包水腫、尾部彎曲和卵黃囊畸形(圖1b、圖1c).經(jīng)統(tǒng)計(jì),3種畸形的畸形率的比例都隨著處理濃度的提高而顯著升高,呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系.由圖1d可看出,高濃度毒死蜱對斑馬魚胚胎有嚴(yán)重的致畸作用.同時(shí)毒死蜱也會(huì)對胚胎產(chǎn)生致死作用,致死率隨著處理濃度的提高而升高(圖2).

本研究通過檢測毒死蜱暴露96h斑馬魚胚胎抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)及酶活力來研究毒死蜱對斑馬魚胚胎氧化應(yīng)激的影響.SOD和CAT是抵御氧化損傷的第一道防線,其中Cu/Zn-sod 和Mn-sod是編碼超氧化物歧化酶(SOD)的基因,SOD的主要功能是清除氧自由基生成 H2O2和O2[20-22].過氧化氫酶(CAT)能夠清除體內(nèi)產(chǎn)生的過多的H2O2,將其分解成O2和H2O,編碼基因是cat[20].在本研究中,高濃度毒死蜱暴露96h能夠下調(diào)Cu/Zn-sod、Mn-sod和cat的表達(dá),并呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系(圖3a、圖3b、圖3c),這說明高濃度的毒死蜱會(huì)誘導(dǎo)胚胎產(chǎn)生氧化應(yīng)激,導(dǎo)致胚胎體內(nèi)產(chǎn)生過多的ROS無法及時(shí)清除,抑制了這3個(gè)基因的表達(dá).酶活檢測的結(jié)果也顯示,高濃度毒死蜱能夠顯著抑制SOD和CAT活力,并呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系(圖4a、圖4b).

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)具有Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的雙重功能,能夠保護(hù)機(jī)體免受環(huán)境污染物的損害,已被廣泛用作檢測環(huán)境污染物的生物指示物[23-26].在本研究中,毒死蜱能夠提高GST活力(圖4c),GST的編碼基因gstp2的表達(dá)檢測結(jié)果顯示,低濃度毒死蜱能夠顯著上調(diào)的表達(dá),表明毒死蜱誘導(dǎo)胚胎產(chǎn)生解毒反應(yīng),但最高濃度毒死蜱并沒有顯著誘導(dǎo)gstp2的表達(dá)(圖3d),這可能是由于毒死蜱濃度過高,超過了胚胎的解毒能力,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生過多的ROS,抑制了基因的表達(dá).但在本研究中GST的活力在處理組與對照組中差異并不顯著,說明其對CPF脅迫并不敏感,但基因gstp2卻可作為CPF污染的潛在生物指示物.

圖4　毒死蜱對抗氧化酶活性和MDA含量的影響Fig.4　Effects of CPF on antioxidant enzyme activities and MDA content與對照相比,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001

轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子(nrf2),是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子,受胞質(zhì)接頭蛋白(keap1)的調(diào)控,通過與抗氧化反應(yīng)元件ARE相互作用,能夠上調(diào)抗氧化蛋白和II相解毒酶的表達(dá),keap1-nrf2/ARE通路是細(xì)胞抗氧化反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)者[27-28].在毒死蜱脅迫下,斑馬魚胚胎體內(nèi)nrf2表達(dá)量顯著提高,同時(shí)keap1下調(diào),能夠誘導(dǎo)nrf2的積聚及活性增強(qiáng)(圖3e、圖3f),從而上調(diào)抗氧化蛋白和II相解毒酶(GST等)的表達(dá),誘導(dǎo)斑馬魚胚胎產(chǎn)生抗氧化反應(yīng).

過量ROS可侵害生物膜中的不飽和脂肪酸,引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng).丙二醛是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一,它的高低間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的程度[29].毒死蜱處理組胚胎MDA含量顯著高于對照組,并呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系(圖4d),說明毒死蜱誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生過多的ROS,引起脂質(zhì)過氧化,侵害機(jī)體細(xì)胞,可能引起細(xì)胞凋亡.

cox1是細(xì)胞色素c氧化酶亞基I基因,細(xì)胞色素氧化酶是線粒體內(nèi)呼吸鏈電子傳遞的終末復(fù)合物,是線粒體氧化能力的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物質(zhì)[30].毒死蜱能夠顯著下調(diào)其表達(dá)(圖3h),對細(xì)胞色素c 氧化酶產(chǎn)生抑制作用,說明毒死蜱可以抑制呼吸鏈,能夠減少ROS的產(chǎn)生和ATP的生成,同時(shí)電子傳遞和氧化磷酸化障礙能夠引起細(xì)胞凋亡.ucp2是解偶聯(lián)蛋白2的編碼基因,解偶聯(lián)蛋白2可以使氧化磷酸化過程解偶聯(lián),從而使ATP合成減少,這可導(dǎo)致細(xì)胞功能下降,降低機(jī)體對損傷的耐受性;同時(shí)也能抑制呼吸鏈ROS的產(chǎn)生.而在機(jī)體正常生理?xiàng)l件下,90% ROS來自線粒體呼吸鏈,因此可保護(hù)組織和細(xì)胞,避免產(chǎn)生過多ROS對機(jī)體造成損傷.所以它對機(jī)體的作用既有利也有弊[31].毒死蜱能夠誘導(dǎo)ucp2顯著下調(diào)(圖3g),從而促進(jìn)氧化磷酸化過程,有利于機(jī)體抵抗毒死蜱的氧化損傷作用.

bcl2編碼蛋白主要功能是抑制細(xì)胞凋亡[32],在毒死蜱脅迫下,其表達(dá)量顯著下調(diào)(圖3i),由此可見,毒死蜱破壞了機(jī)體內(nèi)細(xì)胞凋亡的平衡.正常的細(xì)胞凋亡可以清除體內(nèi)受損或者已經(jīng)完成特定使命的細(xì)胞,是對機(jī)體的保護(hù).而在毒死蜱脅迫下,斑馬魚胚胎體內(nèi)MDA顯著上升,引起脂質(zhì)過氧化,并且cox1下調(diào),造成電子傳遞和氧化磷酸化障礙,在這些凋亡信號的刺激下,抑制凋亡基因bcl2的表達(dá)下調(diào),凋亡平衡機(jī)制遭到破壞,可能會(huì)引起斑馬魚胚胎細(xì)胞凋亡過度,從而對胚胎造成損傷.

根據(jù)本研究結(jié)果,抗氧化酶SOD和CAT及抗氧化相關(guān)基因Cu/Zn-sod、Mn-sod、cat等都可成為CPF脅迫下斑馬魚胚胎氧化應(yīng)激檢測的潛在生物指示物.但是在低濃度CPF脅迫下, SOD、CAT和GST的活性差異并不顯著.由此可見,在CPF脅迫下抗氧化酶活性及其相關(guān)基因的表達(dá)的改變并不完全一致,顯然抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)對CPF脅迫更加敏感.MDA作為氧化損傷的指示物,在本研究中其在斑馬魚胚胎中的含量受CPF濃度的影響,并具有濃度-效應(yīng)關(guān)系.

3　結(jié)論

通過對毒死蜱脅迫下斑馬魚胚胎形態(tài)學(xué)的觀察,以及氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)和抗氧化酶含量的檢測,發(fā)現(xiàn)較高濃度的毒死蜱對斑馬魚胚胎有嚴(yán)重致畸和致死作用,并且毒死蜱能夠誘導(dǎo)斑馬魚胚胎產(chǎn)生氧化應(yīng)激,誘導(dǎo)nrf2高表達(dá),從而促進(jìn)gstp2的表達(dá).同時(shí)高濃度毒死蜱能夠抑制部分抗氧化酶(SOD、CAT)的活性及其相關(guān)基因(Cu/Zn-sod、Mn-sod、cat)的表達(dá),引起MDA含量升高,造成脂質(zhì)過氧化.CPF也能夠誘導(dǎo)呼吸鏈相關(guān)基因cox1、氧化磷酸化相關(guān)基因ucp2和抗凋亡基因bcl2表達(dá)顯著下調(diào).結(jié)果表明毒死蜱會(huì)誘導(dǎo)斑馬魚胚胎產(chǎn)生氧化應(yīng)激,造成脂質(zhì)過氧化,導(dǎo)致斑馬魚胚胎氧化損傷.

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Oxidative stress effects of chlorpyrifos on zebrafish embryos.

ZHANG Jia-yu, LIU Li-li, LI Guo-chao, YU Kai-min, LV Peng, YAN Yan-chun*(Graduate School, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China). China Environmental Science, 2016,36(3)：927～934

Abstract：We elucidated the effects of chlorpyrifos exposure on the morphology, oxidative stress and oxidative damage in zebrafish (Danio rerio) embryos. After exposed to concentration gradient of chlorpyrifos solution for 96hours, the rates of deformities and death were dramatically higher than those in the control groups, and the median lethal concentration of CPF was calculated to be 1.18mg/L after a 96h exposure. The expression levels of oxidative stress-related genes, antioxidant enzyme activities and malondialdehyde (MDA) content were investigated. In CPF treatment groups, the antioxidant enzyme (SOD, CAT) activities and the expression levels of their encoding genes (Cu/Zn-sod, Mn-sod, cat) significantly decreased, compared with the control groups. At low concentrations of chlorpyrifos, antioxidant enzyme activities were not affected significantly, while the expression levels of their encoding genes were more sensitive to chlorpyrifos. Chlorpyrifos could induce the expression of nrf2, which played an important role in increased expression of a group of genes encoding antioxidant and phaseⅡdetoxification enzymes, but the kinetics of GST and gstp2 were not consistent with each other. The down-regulation of expression levels of ucp2 and cox1 made contributions to reducing ROS generated by the respiratory chain in CPF treatment groups. Meanwhile, in CPF treatment groups, the expression level of bcl2 was significantly down-regulated, suggesting that the balance of apoptosis was destroyed. MDA content was significantly higher in CPF treatment groups than that in control, indicating that chlorpyrifos could cause oxidative damage in zebrafish embryos.

Key words：chlorpyrifos；zebrafish embryo；oxidative stress；oxidative damage

作者簡介：張家禹(1990-),男,遼寧大連人,碩士研究生,主要從事微生物分子生物學(xué)與基因工程研究.

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31170119),中國農(nóng)科科學(xué)院基礎(chǔ)研究基金項(xiàng)目(0042014006,0042012003,0042011006)

收稿日期：2015-06-25

中圖分類號：X171.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-6923(2016)03-0927-08