劉　杰,宋宇昊,馬　芮,王瑩瑩(南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,環(huán)境污染過程與基準教育部重點實驗室,天津市城市生態(tài)環(huán)境修復(fù)與污染防治重點實驗室,天津 300071)

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基于流式細胞特性的LNA和HNA細菌相關(guān)性研究

劉杰,宋宇昊,馬芮,王瑩瑩*(南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,環(huán)境污染過程與基準教育部重點實驗室,天津市城市生態(tài)環(huán)境修復(fù)與污染防治重點實驗室,天津 300071)

摘要：采用流式細胞技術(shù)分析了7種不同陸地環(huán)境介質(zhì)中LNA和HNA細菌的濃度變化及流式細胞特性特征.結(jié)果顯示,在水體和土壤等環(huán)境中都存在LNA和HNA細菌的分類,其中,土壤環(huán)境中LNA細菌濃度(107～108cells/g數(shù)量級)高于水環(huán)境中濃度(105～106cells/mL數(shù)量級),但其相對比重(29.80%～33.94%)低于水環(huán)境(除地下水外,21.60%)中LNA細菌(42.25%～65.92%),主成分分析(PCA)顯示水體和土壤環(huán)境介質(zhì)中LNA和HNA流式細胞參數(shù)具有明顯差異;相關(guān)分析表明,LNA與HNA細菌的流式細胞參數(shù)(綠色熒光信號FL1和側(cè)向散色信號SSC)之間具有顯著相關(guān)性(FL1:R2=0.711, P＜0.01, SSC:R2=0.762, P＜0.01),在不同生態(tài)系統(tǒng)中SSC變異大于FL1變異.結(jié)果表明,LNA和HNA細菌之間既不是各自對應(yīng)的某一特殊生理階段細菌,也不是兩個完全相互獨立的細菌群體,而是具有特殊共變關(guān)系的細菌.

關(guān)鍵詞：陸地生態(tài)；流式細胞技術(shù)(FCM)；低核酸含量(LNA)細菌；高核酸含量(HNA)細菌；DNA；熒光染色

? 責(zé)任作者, 教授, wangyy@nankai.edu.cn

近年來以DNA熒光染色技術(shù)為基礎(chǔ)、不依賴于培養(yǎng)的流式細胞技術(shù)(FCM)在水環(huán)境微生物研究領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[1-3],微生物被熒光染色后,在流式細胞儀FCM中,細菌被明顯分為低核酸含量(LNA)細菌和高核酸含量(HNA)細菌兩大類[4-7].這種依據(jù)DNA含量高低來進行的分類是一種流式細胞儀所特有現(xiàn)象,它通過DNA染色后的熒光密度和側(cè)向角散色信號來進行區(qū)分,其中熒光密度信號(FL1)表示細菌細胞DNA含量,側(cè)向散射角信號(SSC)表示細胞大小,此種分類現(xiàn)象不受其DNA核酸染料類型、實驗技術(shù)操作等影響,僅僅取決于細菌的群落結(jié)構(gòu)、細胞特性以及環(huán)境梯度[5],這種基于儀器方法的細胞分類迄今來沒有在其他方法中觀察到,但是仍被許多學(xué)者所引用[8].

關(guān)于LNA細菌是否具有生物活性,起初存在著較大爭論.研究認為,細胞生長活性與其核酸含量及體積具有顯著的正相關(guān),因此,通常認為HNA細菌具有代謝活性,而LNA細菌則不然[9].初期在FCM上觀察到LNA細菌的存在時,它被認為是死的或即將衰亡(沒有細胞代謝活性)的細菌,以致有學(xué)者提出將HNA細菌作為環(huán)境中活性細菌的指標[10-11],但隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)LNA細菌不僅具有活性,同時在環(huán)境中也具有重要生態(tài)作用[12]. Wang等[13]從細胞內(nèi)ATP角度分析發(fā)現(xiàn),在相同培養(yǎng)條件下,LNA細菌和HNA細菌具有相似的ATP單位體積濃度(1.2×10-15vs. 1.5×10-15gATP/ μm3); Longnecker等[4]從基質(zhì)利用和基因發(fā)育組成兩方面分析,證明了在海洋中LNA菌和HNA菌具有相同作用,在一些海洋環(huán)境中,LNA細菌的代謝活性和生長速率甚至要高于HNA細菌[14-15], LNA細菌的特殊膜結(jié)構(gòu)和蛋白代謝抗性機制使得其能夠適用某些外界環(huán)境壓力,如低營養(yǎng)環(huán)境[16-17]、氧化消毒[18];Bouvier等[19]發(fā)現(xiàn)LNA細菌比HNA細菌更能規(guī)避病毒感染,研究還發(fā)現(xiàn)LNA細菌能夠采用“休眠”策略以應(yīng)對不利環(huán)境,在寡營養(yǎng)環(huán)境中這種菌比重可達40%[20].上述特性使得LNA細菌在某些特定環(huán)境下,生存競爭能力要高于HNA細菌,成為環(huán)境中優(yōu)勢菌,因而在生物地球化學(xué)循環(huán)中擔(dān)當(dāng)著重要角色.然而,盡管對LNA細菌的活性已有所認同,但是LNA和HNA細菌的相互關(guān)系卻仍不清晰.

目前,LNA和HNA細菌的分類在海洋環(huán)境中已有大量報道[15,21-24],但是這些研究主要集中于細菌豐度以及在環(huán)境中比重,而對LNA細菌在陸地環(huán)境分布的認識有限[5,13],特別是在土壤等環(huán)境中的分布還處于空白,關(guān)于LNA細菌在不同環(huán)境介質(zhì)中的分布缺乏報道.此外,由于操作程序的不同(儀器、樣品固定和保存等差異)導(dǎo)致不同研究對象之間難以比較LNA和HNA細菌的特性,導(dǎo)致了以往的研究主要側(cè)重于比較其豐度,而且對LNA和HNA細菌流式細胞技術(shù)特性參數(shù)之間變化的認識也有限[5].為了彌補這一缺失,本文研究分析了不同類型的水體環(huán)境(地下水、河流、湖泊)以及土壤和污水處理廠等其他陸地環(huán)境中LNA細菌的分布,同時通過FCM特性參數(shù)探討了LNA和HNA細菌之間的相互關(guān)系.

1　材料與方法

1.1樣品的采集

水樣采集與保存參照《水質(zhì)采樣技術(shù)指導(dǎo)(HJ 494-2009)》[25],水樣分別來自松花江(98個樣點)、海河(9個樣點)、鄱陽湖(4個樣點)以及地下水(湖南,2個樣點).參照《土壤環(huán)境監(jiān)測技術(shù)規(guī)范(HJ/T 166 -2004)》[26]中方法采集農(nóng)田土壤(天津津南,4個樣點)、石油污染土(天津大港,4個樣點),去表層土、采集表層以下5～20cm深度土壤,此外,試驗采集了某污水處理廠中的活性污泥(5個樣點).試驗樣品用121℃、20min高溫滅菌的1L Schott玻璃瓶收集,所有樣品在常溫下采集,并于4℃環(huán)境下運回實驗室,在24h內(nèi)立即進行試驗.

1.2樣品的預(yù)處理

水樣采集后,如水中渾濁度較高則用20μm濾膜過濾顆粒物,否則無需過濾,直接進行后續(xù)實驗.

土壤及活性污泥在進行流式細胞技術(shù)測定前的預(yù)處理參照Foladori等[27]方法,用滅菌磷酸緩沖溶液PBS(3g/L K2HPO4, 1g/L KH2PO4, 8.5g/L NaCl, pH =7.2)按照1:10的比例稀釋,然后用細胞超聲波破碎儀分散顆粒物中的微生物,超聲破碎的功率及時間通過預(yù)實驗確定最佳條件(本實驗為2kJ/L, 10min),最后3000r/min離心10min取上清液.

1.3流式細胞技術(shù)測定

流式細胞儀的測定參照Liu等[28]方法.用0.22μm尼龍膜(PALL,美國)過濾后的二甲基亞砜將SYBR Green I標準母液(Invitrogen,美國)稀釋100倍作為DNA染色工作液.取菌液1mL,加入10μL DNA染色工作液,在室溫條件下避光染色15min.

實驗所用儀器為CyFlow Space (Partec公司,德國)流式細胞儀,光源功率為50mW,發(fā)射波長488nm,采用絕對計數(shù)來測定微生物細胞數(shù),其線性范圍為2×102～1×105cells/mL,檢出限為200cells/mL,絕對計數(shù)誤差小于5%[29].實驗設(shè)定綠色熒光(FL1)為觸發(fā)參數(shù),其信號收集波長為(520±20) nm,紅色熒光(FL3)信號收集波長大于615nm,所有信號均被收集在綠/紅熒光二維散點圖上,信號收集軟件為FlowMax.儀器增益設(shè)置具體為地下水:SSC=280、FL1=360、FL3=700;鄱陽湖水:SSC=250、FL1=400、FL3=700;海河水SSC=369、FL1=380、FL3=750;松花江:SSC=300、FL1=390、FL3=600;土壤:SSC=280、FL1=360、FL3=750;石油污染土壤:SSC=280、FL1=320、FL3=750;活性污泥:SSC=320、FL1=280、FL3=700.實驗測定時,用滅菌Millipore水稀釋樣品或調(diào)節(jié)流速以確保測定過程中儀器的讀數(shù)小于500cells/s.在增益參數(shù)確定后,通過“門Gate”的設(shè)定將水樣中LNA細菌和HNA細菌進行分開,最后計算出環(huán)境中LNA和HNA細菌的比例.每個樣重復(fù)3次平行.

1.4數(shù)據(jù)處理與分析

使用方差分析(One-Way ANOVA)統(tǒng)計數(shù)據(jù)間的差異性,水質(zhì)數(shù)據(jù)標準化后,應(yīng)用Canoco軟件進行多元排序(主成分分析PCA)[30-31]分析LNA和HNA細菌組成在環(huán)境介質(zhì)中的變化.采用Origin 8.5和Microsoft excel軟件進行繪圖和相關(guān)性分析.

2　結(jié)果與分析

2.1細菌群落的FCM指紋圖譜

圖1　各環(huán)境樣品中典型LNA和HNA細菌流式細胞分類Fig.1　Flow cytometry plot of LNA and HNA bacteria in various environmental samples

細菌在進行流式細胞技術(shù)檢測時,通過電壓增益調(diào)節(jié)以及“Gate門”設(shè)定,按照FL1綠色熒光信號和SSC側(cè)向散射角信號對細菌群落組成進行分析.結(jié)果顯示,在各環(huán)境樣品中均具有LNA 和HNA細菌分類現(xiàn)象(圖1),所采樣的不同介質(zhì)中都能檢測出LNA細菌存在,大部分環(huán)境水樣都出現(xiàn)了LNA和HNA細菌兩團分類(FL1雙峰分配模型),如圖1中地下水和海河水體,在鄱陽湖水樣中出現(xiàn)了3團分類,而在松花江水樣中甚至出現(xiàn)多達5團.同時,實驗也發(fā)現(xiàn),在農(nóng)田土壤、石油污染土壤以及污水處理廠的活性污泥中出現(xiàn)高低核酸細菌的分類.

2.2LNA和HNA細菌的濃度變化

環(huán)境樣品中LNA和HNA細菌的平均濃度以及LNA細菌占總菌濃度百分比(LNA%)如圖2所示.不同環(huán)境中LNA細菌濃度具有極顯著差異(P＜0.01),在土壤等介質(zhì)中LNA細菌濃度(107～108cells/g數(shù)量級)明顯高于水體中LNA濃度(105～106cells/mL數(shù)量級).但是,除地下水(21.60%± 6.19%)具有最低LNA細菌比重外,水體中LNA細菌比重(鄱陽湖65.92%±6.31%,海河42.25%± 15.88%,松花江46.97%±17.3%)均高于固體介質(zhì)中LNA細菌比重(農(nóng)田土壤33.94%±12.53%,石油污染土29.80%±10.98%,活性污泥33.21%± 5.60%),其中鄱陽湖中LNA細菌比重最高.

圖2　不同環(huán)境樣品中LNA細菌和HNA細菌濃度Fig.2　Concentration of LNA and HNA bacteria in various environmental samples

2.3LNA和HNA細菌的FCM特性參數(shù)變化在流式細胞技術(shù)中FL1綠色熒光信號反映細菌DNA結(jié)構(gòu)特征,SSC側(cè)向散色角反映細胞形態(tài)特征.圖3顯示了各環(huán)境介質(zhì)中LNA細菌與HNA細菌的流式細胞FL1和SSC信號參數(shù)比值,在水體中FL1熒光信號比值(LNA:HNA)顯著高于固體環(huán)境中比值(P＜0.05),這說明在土壤等固體環(huán)境中LNA細菌的核酸量相對于水體環(huán)境中LNA細菌的含量更低;而除了地下水中SSC側(cè)向散色角信號比值(LNA:HNA)顯著高于其它環(huán)境介質(zhì)外(P＜0.01),其它環(huán)境介質(zhì)之間無顯著差異.

圖3　不同環(huán)境樣品中LNA細菌與HNA細菌流式細胞參數(shù)比值Fig.3　Parametric ratio of flow cytometry between LNA and HNA bacteria in various environmental samples

圖4　環(huán)境樣品流式細胞技術(shù)參數(shù)主成分分析Fig.4　Principal component analysis of various samples based on flow cytometric parameters

對各類環(huán)境樣品LNA和HNA細菌的流式細胞技術(shù)參數(shù)(LNA和HNA細菌濃度、信號參數(shù)比值等)進行主成分分析(PCA),結(jié)果顯示(圖4)樣品具有明顯的兩種聚類(水體和固體),這表明水體和固體中LNA和HNA細菌的濃度及流式細胞特性具有顯著差異.

2.4LNA和HNA細菌的FCM特性參數(shù)相互關(guān)系LNA細菌和HNA細菌的FL1綠色熒光具有極顯著的正相關(guān)(FL1LNA與FL1HNA:R2=0.711、P＜0.01)[圖5 (a)],表明這兩類細菌的流式細胞特性不是相互獨立的,而是在一個給定的樣本(系統(tǒng))中共變:即具有較高FL1HNA的樣品意味著也具有相對較高的FL1LNA,反之亦然;同時,細菌的SSC側(cè)向散色光也具有相同的變化規(guī)律(SSCLNA與SSCHNA:R2=0.762、P＜0.01)[圖5 (b)].然而,在單獨的細菌分團(HNA或LNA細菌)中,FL1和SSC之間的相關(guān)性較小(FL1LNA與SSCLNA: R2= 0.328、P＜0.01;FL1HNA與SSCHNA:R2=0.186、P＜0.01),如圖5(c) (d)所示,這表明FL1和SSC這兩個參數(shù)是不同的細菌生理特性指標,所以它們之間的耦合性相對較低,同時,這也說明,這兩個參數(shù)可能受不同因子的影響;另一方面,與HNA細菌相比,LNA細菌的FL1和SSC之間相關(guān)性相對較高(RLNA2=0.328vs. RHNA2=0.186),即,在LNA細菌中,細胞的FL1綠色熒光信號(反映細胞核酸結(jié)構(gòu))和SSC側(cè)向散色光信號(反映細胞尺寸大小)之間的相關(guān)性大于HNA細菌,這也說明LNA細菌的流式細胞特性參數(shù)受影響的因素較少.

圖5　HNA與LNA細菌以及單獨LNA和HNA細菌FL1綠色熒光和SSC側(cè)向散色光的相關(guān)性Fig.5　Correlations between HNA and LNA bacterial green fluorescence (FL1) and side scatter (SSC), and relationship between green fluorescence (FL1) and side scatter (SSC) in LNA and HNA bacteria

實驗分析中,用LNA與HNA之間的綠色熒光FL1和側(cè)向散色光SSC的比值(FL1LNA: FL1HNA和SSCLNA:SSCHNA)分別表示它們的變異,并進行相關(guān)性分析和比較,結(jié)果如圖6所示,在HNA和LNA細菌中,SSC側(cè)向散射的變異(SSCLNA:SSCHNA)要大于FL1綠色熒光的變異(FL1LNA:FL1HNA),其中,LNA細菌的SSC具有較大的變異[圖5 (c) (d)],以上均表明SSC和FL1之間不是共變關(guān)系.

圖6　FL1和SSC變異(LNA:HNA)的相關(guān)性Fig.6　Relationship between variation (LNA:HNA) of green fluorescence (FL1) and side scatter (SSC)

3　討論

3.1流式細胞技術(shù)參數(shù)SSC和FL1的變異

以往研究僅注重于用流式細胞技術(shù)參數(shù)(FL1和SSC)來區(qū)分LNA和HNA細菌,較少分析其圖譜特征及變化.由于FL1和SSC均能反映細胞特性(如細胞核酸、形態(tài)、活性等),因此這些參數(shù)能作為重要的額外信息來解釋LNA和HNA細菌的重要性[5].本研究采樣包含多種生態(tài)系統(tǒng)(松花江、海河、湖泊、地下水和土壤等),各類環(huán)境樣品中雖然都有LNA和HNA細菌分類現(xiàn)象,但是用流式細胞技術(shù)描述這些樣品時,它們的參數(shù)卻具有多變性(甚至在相同的操作條件下)(圖3),對這些參數(shù)進行多元排序PCA分析,結(jié)果顯示(圖4),環(huán)境樣品被明顯地分為兩大類:水體和土壤固體,這表明流式參數(shù)具有生態(tài)系統(tǒng)的特異性.

細菌DNA核酸染色后的熒光激發(fā)主要與其胞內(nèi)核酸含量有關(guān),微生物物種基因大小和基因拷貝數(shù)共同影響細菌的熒光信號FL1[32],而染色體的拓撲形態(tài)也會隨細胞生理條件變化,從而影響熒光激發(fā)[33];通過SYBR Green I染色時,不僅能染色DNA,同時還可以染色RNA,因此這種熒光雙峰分布曾被認為可能是細菌處于不同的生理期[34],盡管有研究顯示RNA的影響很小[14],但是其含量也會潛在地影響熒光激發(fā),如一些細菌被病毒感染后,在其裂解后期會表現(xiàn)出較高熒光[35];也有部分研究認為細胞基因組與細胞尺寸大小具有聯(lián)系,因此FL1信號也與細胞生物體積具有一定關(guān)聯(lián)[36];另外,染色效果差異[34]及染料本身自發(fā)熒光也有可能引起FL1變化,盡管如此,但是上述潛在可能影響對環(huán)境細菌群落的FCM熒光差異貢獻很微小.

SSC變化機理較為復(fù)雜,研究認為葉綠素α、細菌生產(chǎn)和生態(tài)系統(tǒng)類型共同作用于側(cè)向散射角信號SSC[37],SSC表征細胞形態(tài)特征(細胞體積大小和細胞結(jié)構(gòu)),包括胞內(nèi)顆粒、細胞支架蛋白、細胞膜厚度、外膜化學(xué)組成、液泡形成等.細胞形態(tài)學(xué)和亞顯微結(jié)構(gòu)上的本質(zhì)差異使得細菌的光散射表現(xiàn)出規(guī)律性變化[38],即細菌在系統(tǒng)發(fā)育方面具有很大差異[39],細菌組成的變化對SSC具有明顯影響[28].因此,系統(tǒng)發(fā)育組成上的差異能夠部分解釋不同生態(tài)系統(tǒng)中SSC的差異,這也是為什么SSC比FL1具有較大差異的原因(圖6).

在不同生態(tài)系統(tǒng)中,LNA和HNA細菌的濃度比例具有較大差異,這說明環(huán)境因子影響其共分布.同時,不同環(huán)境樣品之間流式細胞技術(shù)特性也具有較大變異,即FL1和SSC參數(shù)的數(shù)量級有較大變化(圖5),而在整個生態(tài)系統(tǒng)中這種變化特征具有一致性:HNA和LNA細菌的FL1(或SSC)具有極顯著的共變關(guān)系,因此這兩類細菌在流式細胞圖中一起(隨儀器參數(shù)改變而)移動,HNA和LNA細菌也具有相似的FL1(或SSC)離散程度,因而LNA和HNA細菌可以通過FL1和SSC兩個特性參數(shù)進行很好的區(qū)分.此外,FL1和SSC的較大變異也表明LNA和HNA細菌的分類不僅與具體的核酸量或細胞尺寸有關(guān),而且與微生物群落的內(nèi)在結(jié)構(gòu)相關(guān),即在不同生態(tài)系統(tǒng)或環(huán)境梯度下表現(xiàn)出不同的差異,LNA和HNA細菌可能同時受相似的環(huán)境因子影響,或完全取決于不同的環(huán)境因子[5].LNA(HNA)細菌FL1和SSC之間相關(guān)性的離散程度較大(R2較小)還表明這兩類細菌都具有較高的形態(tài)和基因功能多樣性[5], Bouvier等[5]研究指出FL1和SSC受不同因素影響,細菌的FL1主要受細胞的活性和生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)力影響,其次是生態(tài)系統(tǒng)的類型,而SSC則剛好相反,它首先與環(huán)境類型的特性相關(guān),然后才與系統(tǒng)的生產(chǎn)力有關(guān).

3.2LNA和HNA細菌的相互關(guān)系

HNA和LNA細菌的分類已經(jīng)被廣泛認同,并引起了生態(tài)學(xué)家的重視,然而其生態(tài)意義仍然處于爭論階段.本研究結(jié)果顯示無論是地下水、河流和湖泊的水生態(tài)系統(tǒng)還是土壤等環(huán)境中都有DNA雙峰(FL1信號)模型分布,HNA和LNA細菌之間具有極顯著相關(guān)性(圖5),在流式細胞中被明顯地分為兩類(以上)(圖1),這種分類與所處何種DNA水平無關(guān),它只在不同生態(tài)系統(tǒng)或環(huán)境梯度中表現(xiàn)出變化,就目前所知,這種現(xiàn)象沒有出現(xiàn)在環(huán)境中的其他類型微生物或多細胞動物中.關(guān)于這種現(xiàn)象的最初解釋是,HNA代表細菌中最高活性的部分,而LNA則是那些滅活的、休眠的或具有非常低活性的細菌[10],這源于原位研究得出的總細菌活性與HNA細菌動力學(xué)之間具有顯著相關(guān)性的結(jié)論[11]以及流式分選研究得出的大部分營養(yǎng)被分配到HNA細菌的結(jié)果[10,40].但是近來研究表明LNA細菌的比生長速率與HNA細菌相當(dāng),甚至有些還高于HNA細菌[4,14,39,41-42],因而關(guān)于LNA和HNA細菌代表不同細胞活性的解釋過于簡單也不能夠解釋上述問題.

圖7　自然環(huán)境中HNA和LNA細菌之間四種可能相互聯(lián)系的假設(shè)示意[5]Fig.7　Illustrated outline of the four potential scenarios that may be envisioned concerning the nature of the HNA and LNA bacteria[5]

從已有研究來看,HNA和LNA細菌之間的相互關(guān)系有4種假設(shè)[5]:(1)HNA是活的、生長中的細菌,而LNA則是非活性、休眠、受損或死亡的HNA細菌[圖7(a)];(2)與(1)情形相反,LNA細菌由處于多種不同生理狀態(tài)的細菌組成,包括健康、活性、非活性、休眠和受損傷的細菌,所有這些狀態(tài)細菌具有相似DNA水準,而HNA只是那些活性LNA細菌處于迅速分裂期,此時它們正進行DNA復(fù)制或獲得了多個基因拷貝[圖7(b)];(3)極端假設(shè)理論:HNA和LNA是兩種完全不同的微生物群落,它們各自具有本身獨立的生理特性,HNA和LNA之間很少或甚至沒有相互作用[圖7(c)];(4)折中假設(shè):HNA和LNA之間是動態(tài)轉(zhuǎn)變的,但它們的組成仍具有明顯差異[圖7(d)].

其中,假設(shè)方案1和方案2是基于:在細菌分裂階段DNA含量會因為復(fù)制出現(xiàn)周期性增加或減少[33]、處于高活性狀態(tài)時細胞具有高DNA含量[43]、在饑餓狀態(tài)時DNA裂解[44]、由于天敵捕獲或其它因子而細胞失活[43]、不同程度的多倍體[33]及基因大小短時間的適應(yīng)性改變[45]等理論.在復(fù)雜的細菌群落環(huán)境中,以上所有反應(yīng)都有可能同時并以不同速率發(fā)生,最終導(dǎo)致細胞核酸熒光的連續(xù)光譜.但是這也有一個相矛盾的情況,即在本研究大多數(shù)樣品中存在兩類(以上)不同核酸含量的細菌,而這兩類(以上)細菌具有不連續(xù)的細胞特性.如果LNA細菌來源于非活性或裂解的HNA細菌(方案1),那么有:1)LNA細菌的流式細胞參數(shù)與HNA細菌的參數(shù)將是共變關(guān)系,兩者之間的變化范圍及離散程度應(yīng)一致;2)在流式細胞儀中這兩者應(yīng)該是連續(xù)躍遷,而不是被明顯地分開;3)不管HNA細菌中FL1程度如何,在不同樣品中LNA細菌的DNA含量應(yīng)該收斂到一個相同低水平.相反的,如果HNA細菌來源于LNA細菌的自身復(fù)制(方案2),那么有:1)HNA細菌將共變于LNA細菌,而不會比LNA細菌更均勻;2)HNA和LNA細菌之間應(yīng)該也是連續(xù)躍遷;3)HNA和LNA之間的距離應(yīng)該在DNA復(fù)制或基因拷貝數(shù)以內(nèi).而本研究結(jié)果均不支持這2種推論:HNA和LNA細菌的FL1具有顯著的共變關(guān)系,但是在大分部樣品中很清晰地分開;在不同樣品中LNA細菌的熒光特性沒有收斂,而是在不同樣品中具有很大差異;HNA和LNA細菌之間的FL1距離(FL1LNA:FL1HNA小于0.24)超過了自然環(huán)境中細菌DNA的復(fù)制程度[41],且在不同生態(tài)系統(tǒng)中這種距離具有較大差異.

假設(shè)方案3用HNA和LNA細菌在組成上具有本質(zhì)差異來解釋細菌群落核酸熒光的雙峰分配模型,這種推論假設(shè)HNA和LNA細菌具有各自獨特的結(jié)構(gòu)和功能特性,從而導(dǎo)致了DNA含量和側(cè)向散色的變異.這方面報道仍然是相互矛盾,結(jié)合流式分選、原位熒光檢測及分子指紋圖譜分析,有研究指出HNA和LNA細菌在組成上沒有明顯區(qū)別[4,40],然而也有研究發(fā)現(xiàn)某些系統(tǒng)發(fā)育組或分支是LNA(如SAR11和SAR86分支)和HNA(如Roseobacter, γ-Proteobacteria, Bacteroidetes)的特有菌或優(yōu)勢菌[39,42,46].這種推理不能解釋這兩種完全獨立但是在流式細胞特性上卻又具有顯著共變關(guān)系的現(xiàn)象.正如前文所述:SSC的差異可能反映細菌組成變化,在不同的生態(tài)系統(tǒng)中SSC具有較大的差異,但是在給定的環(huán)境樣品中SSC的差異相對較少(圖4).因此,本研究表明推論方案3并不成立.

綜上所述,HNA和LNA細菌既不代表活性細胞或失活細胞,也不是完全相互獨立的.結(jié)果說明HNA和LNA細菌存在于所有細菌微生物群落中是因為其復(fù)雜的細菌變化過程,HNA和LNA之間可能相互“遷移”(方案4),這一結(jié)論與前人研究具有相似性,HNA和LNA之間具有動態(tài)關(guān)聯(lián)性,這種聯(lián)系不止是單向,而且在細菌激活生長以及失活受到損傷或死亡時都會起作用[5,14].本文結(jié)果還顯示,HNA和LNA細菌具有自身內(nèi)在特性,HNA和LNA的分類并不僅僅局限于水體浮游細菌,而且在土壤等環(huán)境中也有出現(xiàn).Bouvier等[5]認為HNA和LNA細菌分類可能是原核生物的一種普遍適應(yīng)性過程,Islas等[47]等分析了已知的641種不同原核生物DNA含量,結(jié)果顯示獨立生存的原核生物基因大小分布也具有雙峰分布(在2000kb和4000～5000kb處有兩個峰).通過對實驗結(jié)果及文獻分析,表明HNA細菌并不就是活性細菌,而LNA細菌也不是非活性細菌.同時,HNA和LNA細菌之間并不是絕對相互對立,而是可能具有一定動態(tài)聯(lián)系,它們共同出現(xiàn)在一個較大范圍的DNA含量和細胞尺寸之中,這可能是生物進化所引起的一個生態(tài)共性,這也暗示細菌的雙峰分布可能具有重要作用,然而,關(guān)于這種原核生物基因雙峰分布現(xiàn)象的進化意義仍不清楚,這可能根源于原核生物具有普遍的HNA和LNA分類,或者反過來,它們有著特殊而不同的生態(tài)位和生態(tài)功能,因而需要進一步研究分析這種分類的根本原因以及它們在生態(tài)系統(tǒng)和環(huán)境微生物食物鏈中的作用.

4　結(jié)論

4.1在水體環(huán)境和土壤等介質(zhì)中都存在LNA 和HNA細菌分類,其中,土壤環(huán)境中LNA細菌濃度高于水環(huán)境中濃度,但是其相對比重低于水環(huán)境中LNA細菌;主成分分析(PCA)結(jié)果表明,水體和土壤環(huán)境的LNA和HNA細菌流式細胞特性具有明顯差異.

4.2LNA細菌與HNA細菌具有特殊共變關(guān)系,其流式細胞特性參數(shù)(FL1和SSC)顯著相關(guān);在LNA細菌中,FL1與SSC的相關(guān)性大于HNA細菌中的相關(guān)性;在不同生態(tài)系統(tǒng)中SSC的變異大于FL1的變異.

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Correlation of LNA and HNA bacteria based on flow cytometric characteristics.

LIU Jie, SONG Yu-hao, MA Rui, WANG Ying-ying*(Key Laboratory of Pollution Processes and Environmental Criteria (Ministry of Education), Tianjin Key Laboratory of Environmental Remediation and Pollution Control, College of Environmental Science and Engineering, Nankai University, Tianjin 300071, China). China Environmental Science, 2016,36(3)：865～874

Abstract：In the present study, bacterial concentration and FCM characteristics of LNA and HNA were analyzed in seven different terrestrial environments. Results showed clear separation between LNA and HNA bacteria in both aquatic and soil environments. The LNA abundance in soil (107～108cells/g) was higher than that of freshwater (105～106cells/mL) while the proportion of LNA in soil (29.80%～33.94%) was lower than that of freshwater (42.25%～65.92%), but not underground water (21.60%). Principal component analysis (PCA) indicated that the flow cytometric characteristics of LNA and HNA had distinct differences between freshwater and soil. Correlation analysis further revealed that both green fluorescence (FL1) and side scatter (SSC) signals between LNA and HNA bacteria had a significant correlation (FL1:R2=0.711, P＜0.01; SSC:R2=0.762, P＜0.01), i.e. co-variation between LNA and HNA. The variance of SSC was higher than that of FL1 in different ecosystems. The results demonstrated that LNA and HNA bacteria were neither physiologically related nor completely independent communities, but rather have a close co-variation.

Key words：terrestrial ecosystems；flow cytometry (FCM)；low nucleic acid content (LNA) bacteria；high nucleic acid content (HNA) bacteria；DNA; fluorescence staining

作者簡介：劉杰(1987-),男,湖南益陽人,博士,主要研究方向為環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)、土壤生態(tài)修復(fù)等.發(fā)表論文18篇.

基金項目：國家自然基金項目(31322012)

收稿日期：2015-06-11

中圖分類號：X172

文獻標識碼：A

文章編號：1000-6923(2016)03-0865-10