程立君++段相程++胡志芳++李世輝++趙艷娟++師睿

摘 要：經(jīng)試驗對天麻共生萌發(fā)菌MY-001的栽培種生產(chǎn)的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果顯示，既能降低生產(chǎn)成本又能提高生產(chǎn)效率的液體發(fā)酵條件為：液體菌種培養(yǎng)器的氣壓為0.020MPa，發(fā)酵液主要成分中紅糖、麥麩和蛋白胨的最佳比例為紅糖10g/L、麥麩15g/L、蛋白胨1g/L，萌發(fā)菌菌絲生物量隨時間的變化符合邏輯斯蒂增長模型，其觀測值與邏輯斯蒂方程擬合值的擬合度較高（R2=97.7%），發(fā)酵培養(yǎng)144h后生物量趨于穩(wěn)定，栽培種基質(zhì)最合適的比例為殼斗科植物樹葉60%、闊葉樹木屑30%和麥麩10%。

關(guān)鍵詞：天麻；萌發(fā)菌；液體發(fā)酵；工藝優(yōu)化

中圖分類號 S567 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）06-17-03

Optimizing the Gastrodia elata Seed-germinating Strains Production Process

Cheng Lijun1 et al.

（1College of Chemistry and Life Sciences，Zhaotong University，Zhaotong 657000，China）

Abstract：The best production process conditions for Gastrodia elata seed-germinating strain MY-001 were optimized. The results showed that the best liquid fermentation conditions were pressure of 0.020MPa，ermented liquid of brown sugar 10g/L，wheat bran 15g/L，peptone 1g/L. The number increasing ofhypha biomass over time accords with the Logisticgrowth model，the observations fit with the logistic equation fitting thehigher value（R2=97.7%），biomass tends to be stable after fermentation 144h. The optimum cultivation of the substrate were determined fagaceae plant leaves60%，broadleaf sawdust 30%，and wheat bran 10%.

Key words：Gastrodia elata；Germinating strain；Liquid fermentation；Process optimization

天麻（Gastrodia elata Blume）為名貴的傳統(tǒng)中藥，云南省昭通市是我國公認(rèn)的天麻道地藥材產(chǎn)地，特別是昭通市彝良縣小草壩所產(chǎn)的天麻，以優(yōu)良的品質(zhì)而馳名中外[1]。天麻屬蘭科多年生草本植物，無根、無綠色葉片，不能進(jìn)行光合作用營自養(yǎng)生活，其種子發(fā)芽必需依靠小菇屬（Mycena）一類萌發(fā)菌侵染后才能正常發(fā)芽[2-5]。筆者前期對昭通小草壩分離的萌發(fā)菌進(jìn)行了篩選和萌發(fā)對比實驗，并將篩選出的菌株在昭通實施了推廣[3]。隨著天麻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，為加快萌發(fā)菌的擴(kuò)繁，降低生產(chǎn)成本，同時為深入開發(fā)利用萌發(fā)菌奠定基礎(chǔ)，有必要對萌發(fā)菌的深層發(fā)酵條件進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 供試萌發(fā)菌菌株為MY-001由昭通學(xué)院提供；供試藥品磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉等均為化學(xué)純。液體發(fā)酵設(shè)備使用遼寧全禾生物科技有限公司生產(chǎn)的CQY-130型液體菌種培養(yǎng)器。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌絲生物量測定方法 將培養(yǎng)基配置（馬鈴薯200g、葡萄糖15g、紅糖10g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂1g、泡敵0.3mL、維生素B1 0.005g）后裝入培養(yǎng)器中，124℃滅菌30min，冷卻至25℃后接種1L液體母種，根據(jù)實驗要求設(shè)計的條件培養(yǎng)完成后，接出1L培養(yǎng)液，搖至菌球在培養(yǎng)液中均勻分布時量取100mL，抽濾、干燥稱取菌絲體的重量，每處理設(shè)3個重復(fù)。

1.2.2 氣壓對萌發(fā)菌MY-001菌絲生長的影響 分別設(shè)置液體菌種培養(yǎng)器內(nèi)的氣壓為0.020MPa、0.035MPa、和0.050MPa，參照1.2.1的方法，培養(yǎng)120h后，觀察菌球的形態(tài)，稱取菌絲體的重量，每處理設(shè)3個重復(fù)。

1.2.3 發(fā)酵液成分及比例對萌發(fā)菌MY-001菌絲生長的影響 根據(jù)前期的研究成果，以1L培養(yǎng)基馬鈴薯100g、葡萄糖15g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂1g、泡敵0.3mL、維生素B 0.005g為基礎(chǔ)，分別添加紅糖0、10g、20g，麥麩10g、15g、20g、25g及蛋白胨0、1g、2g，參照1.2.1的方法，培養(yǎng)120h后，稱量菌絲體的生物量，每處理設(shè)3個重復(fù)。

1.2.4 萌發(fā)菌MY-001菌絲生物量生長曲線 在以上篩選獲得的菌絲最佳條件下培養(yǎng)，48h后每隔12h參照1.2.1的方法，稱取菌絲體的重量，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，菌絲體生物量為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。數(shù)據(jù)分析用軟件SPSS13.0進(jìn)行。

1.2.5 栽培種基質(zhì)比例對萌發(fā)菌MY-001菌絲生長速度的影響 萌發(fā)菌栽培種培養(yǎng)基質(zhì)主要由殼斗科植物樹葉、闊葉樹木屑及麥麩混合組成，為節(jié)省生產(chǎn)成本同時方便野外種植時的使用，以殼斗科植物樹葉含量60%為基礎(chǔ)，參照表1中的比例調(diào)整木屑和麥麩。在17cm×33cm的聚丙烯食用菌袋中裝入定量的培養(yǎng)基質(zhì)，滅菌冷卻后，每袋接種20mL液體菌種，25℃培養(yǎng)7d后用記號筆在聚丙烯食用菌袋上劃出菌絲的生長線，并以此為基線，一個月后記錄菌絲生長速度和菌落生長特征，每處理設(shè)5個重復(fù)。

表1 培養(yǎng)基質(zhì)中樹葉、木屑和麥麩比例（%）

[序號＼&樹葉＼&木屑＼&麥麩＼&1#＼&60＼&20＼&20＼&2#＼&60＼&25＼&15＼&3#＼&60＼&30＼&10＼&4#＼&60＼&35＼&5＼&5#＼&60＼&40＼&0＼&]

2 結(jié)果與分析

2.1 氣壓對萌發(fā)菌MY-001菌絲生長的影響 液體菌種培養(yǎng)器的氣壓對萌發(fā)菌MY-001菌絲生物量的影響見表2。表2顯示，氣壓對菌絲生物量具有顯著影響，在低氣壓狀態(tài)時菌球生長狀況較好，具有明顯的毛刺，靜止后懸浮于培養(yǎng)液中，當(dāng)氣壓在0.020～0.035MPa時菌絲生物量之間不存在顯著差異，氣壓在0.020MPa時達(dá)到（0.53±0.03g）。

表2 氣壓對菌絲生長的影響

[培養(yǎng)器內(nèi)氣壓（MPa）＼&菌絲生物量

（g）＼&菌球生長形態(tài)＼&0.020＼&0.53±0.03A＼&菌球形態(tài)正常，具有明顯的毛刺，靜止后懸浮于培養(yǎng)液中，少量菌絲分散而不成球狀。＼&0.035＼&0.50±0.02AB＼&菌球形態(tài)均勻，具有明顯的毛刺，但分散菌絲較多。＼&0.050＼&0.49±0.03B＼&菌絲易老化，大量菌絲分散浮于發(fā)酵液表層。＼&]

注：菌絲生物量由平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（SE）表示；不同大寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

2.2 發(fā)酵液成分及比例對萌發(fā)菌MY-001菌絲生物量的影響 發(fā)酵液主要成分紅糖、麥麩和蛋白胨對萌發(fā)菌MY-001菌絲生物量的影響見表3。由表3可知，在液體菌種培養(yǎng)器中隨著紅糖、麥麩和蛋白胨的增加菌絲生物量也在增加，但為降低生產(chǎn)成本又不影響生長效果，最佳比例為紅糖10g/L、麥麩15g/L、蛋白胨1g/L。

表3 發(fā)酵液成分及比例對萌發(fā)菌MY-001菌絲生物量的影響

[紅糖

（g/L）＼&菌絲生物量

（g）＼&麥麩

（g/L）＼&菌絲生物量

（g）＼&蛋白胨

（g/L）＼&菌絲體重量

（g）＼&0＼&0.45±0.03A＼&10＼&0.56±0.03A＼&0＼&0.63±0.01A＼&10＼&0.53±0.04B＼&15＼&0.59±0.02AB＼&1＼&0.72±0.03B＼&20＼&0.55±0.03B＼&20＼&0.63±0.02B＼&2＼&0.74±0.02B＼&＼&＼&25＼&0.65±0.03B＼&＼&＼&]

注：菌絲生物量由平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（SE）表示；不同大寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

2.3 萌發(fā)菌MY-001菌絲生物量生長曲線 由圖1可知，萌發(fā)菌菌絲生物量生長隨時間的變化呈“S”型增長，84h以前為增長延遲期，84～144h為對數(shù)增長期，144h以后進(jìn)入穩(wěn)定期。因此，在萌發(fā)菌發(fā)酵工藝生產(chǎn)過程中，在發(fā)酵培養(yǎng)144h即可獲得較高的生物量。采用SPSS13.0進(jìn)行分析，平均生物量（Y）與發(fā)酵時間（X）的關(guān)系符合邏輯斯蒂曲線模型（F=426.203，P=0.000<0.01），數(shù)學(xué)模型為

Y=[10.87+126.75×0.951x]，產(chǎn)孢量的實際觀測值與數(shù)學(xué)模擬值能夠較好的重合（圖1），模型確定系數(shù)R2達(dá)97.7%，所獲得的參數(shù)能通過t檢驗（t=3.418，P=0.007<0.01）。

<＼＼Pc10＼工作盤 （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農(nóng)學(xué)通報雜志＼2016-6農(nóng)學(xué)通報內(nèi)文＼s84-1.eps>

圖1 菌絲生物量觀測值與邏輯斯蒂方程擬合值的比較

2.4 栽培種基質(zhì)比例對萌發(fā)菌MY-001菌絲生長速度的影響 栽培種基質(zhì)的不同比例對萌發(fā)菌MY-001菌絲生長速度的影響見表4。表4顯示，基質(zhì)主要成分殼斗科植物樹葉、闊葉樹木屑和麥麩各占60%、25%和15%時菌絲生長速度最快，達(dá)（0.52±0.02）cm/d，但考慮到降低生產(chǎn)成本又不顯著影響菌絲生長效果，當(dāng)殼斗科植物樹葉、闊葉樹木屑和麥麩各占60%、30%和10%時，菌絲日均生長速度為（0.48±0.05）cm/d，與1#相比不存在顯著差異，但成本較低。

表4 栽培種基質(zhì)比例對萌發(fā)菌MY-001菌絲生長速度的影響

[序號＼& 基質(zhì)成分比例（%） ＼&菌絲日均生長速度

（cm/d）＼&差異顯著性＼&樹葉＼&木屑＼&麥麩＼&1#＼&60＼&20＼&20＼&0.51±0.04＼&A＼&2#＼&60＼&25＼&15＼&0.52±0.02＼&A＼&]

（下轉(zhuǎn)176頁）

（上接18頁）

[序號＼& 基質(zhì)成分比例（%） ＼&菌絲日均生長速度

（cm/d）＼&差異顯著性＼&樹葉＼&木屑＼&麥麩＼&3#＼&60＼&30＼&10＼&0.48±0.05＼&AB＼&4#＼&60＼&35＼&5＼&0.43±0.03＼&B＼&5#＼&60＼&40＼&0＼&0.33±0.05＼&B＼&]

注：菌絲生物量由平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（SE）表示；不同大寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

3 討論與結(jié)論

目前在各天麻產(chǎn)區(qū)菌種的需求量日益擴(kuò)大，隨著生物發(fā)酵工程技術(shù)的發(fā)展，由于液體發(fā)酵具有生產(chǎn)成本低、時間短、生產(chǎn)快、污染少等特點，將取代傳統(tǒng)、樸素的固體制種技術(shù)成為趨勢[6]。本研究通過對天麻共生萌發(fā)菌MY-001的深層發(fā)酵條件工藝的優(yōu)化，篩選合適的發(fā)酵條件對產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。研究結(jié)果顯示，既能降低生產(chǎn)成本又能提高生產(chǎn)效率的液體發(fā)酵條件為：液體菌種培養(yǎng)器的氣壓為0.020MPa；發(fā)酵液主要成分紅糖、麥麩和蛋白胨最佳比例為紅糖10g/L、麥麩15g/L、蛋白胨1g/L；萌發(fā)菌菌絲生物量隨時間的變化符合邏輯斯蒂增長模型，其觀測值與邏輯斯蒂方程擬合值的擬合度較高（R2=97.7%），發(fā)酵培養(yǎng)144h后生物量趨于穩(wěn)定；栽培種基質(zhì)中使用殼斗科植物樹葉的天麻種子萌發(fā)效果較好，能促進(jìn)種子的萌發(fā)[2]，因此選用殼斗科植物的樹葉作為主要成分，經(jīng)篩選最合適的比例為殼斗科植物樹葉60%、闊葉樹木屑30%和麥麩10%。

參考文獻(xiàn)

[1]李德勛，張觀敏，馬躍新.昭通天麻的原植物調(diào)查與鑒定[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐，2005，19（1）：29-31.

[2]徐錦堂.中國天麻栽培學(xué)[M].北京：北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1993：1-99.

[3]楊世林，蘭進(jìn)，徐錦堂.天麻的研究進(jìn)展[J].中草藥，2000，3（1）：66-69.

[4]徐錦堂，郭順星，范黎，等.天麻種子與小菇屬真菌共生萌發(fā)的研究[J].菌物系統(tǒng)，2001，20（1）：137-141.

[5]郭順星，王秋穎.促進(jìn)天麻種子萌發(fā)的石斛小菇優(yōu)良菌株特性及作用[J].菌物系統(tǒng)，2001，20（3）：408-412.

[6]林靜，趙萍，何莉莉，等.食用菌液體菌種培養(yǎng)器的設(shè)計[J].農(nóng)機(jī)化研究，2007（9）：105-108. （責(zé)編：張宏民）