于利莉薛　敏王　嘉　韓　芳　鄭銀樺　吳秀峰　吳立新（.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，大連603；.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，國(guó)家水產(chǎn)飼料安全評(píng)價(jià)基地，北京0008）

?

大口黑鱸對(duì)飼料中丁基羥基茴香醚的耐受性評(píng)價(jià)

于利莉1，2薛敏2?王嘉2韓芳2鄭銀樺2吳秀峰2吳立新1
（1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，大連116023；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，國(guó)家水產(chǎn)飼料安全評(píng)價(jià)基地，北京100081）

摘要:本試驗(yàn)旨在通過(guò)生長(zhǎng)性能、血漿生化指標(biāo)、組織抗氧化指標(biāo)及肝臟、腸道組織學(xué)變化，評(píng)價(jià)大口黑鱸對(duì)飼料中丁基羥基茴香醚（BHA）的耐受性。以初始體重為（6.20±0.01）g的大口黑鱸為靶動(dòng)物，在基礎(chǔ)飼料中依次添加0（D0組，作為對(duì)照組）、150（D150組）、300（D300組）和1 500 mg/ kg（D1500組）的BHA，其中300和1 500 mg/ kg分別是最高推薦劑量（150 mg/ kg）的2和10倍，進(jìn)行為期10周的飼喂試驗(yàn)。每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾魚(yú)。結(jié)果表明：4組中以D150組的生長(zhǎng)性能最好，其余各組的終末均重、特定生長(zhǎng)率、增重率和攝食量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。各組肥滿(mǎn)度、臟體比和肝體比無(wú)顯著差異（P＞0.05）。對(duì)照組血漿中總膽固醇、甘油三酯含量及堿性磷酸酶活性顯著高于其余各組（P＜0.05）。D150和D300組血漿中高密度脂蛋白膽固醇/總膽固醇顯著高于對(duì)照和D1500組（P＜0.05）。D1500組血漿中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），與D150、D300組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。D150和D300組肝臟中超氧化物歧化酶活性顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），與D1500組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。飼料中添加1 500 mg/ kg BHA可以顯著提高肝臟中總抗氧化能力（P＜0.05）；飼料中添加150、300、1 500 mg/ kg BHA均顯著降低了血漿、心臟和肝臟中丙二醛的含量（P＜0.05）。對(duì)照、D150和D1500組大口黑鱸的肝臟、腸道都有不同程度的損傷，但D150和D1500組的損傷相對(duì)較少。上述結(jié)果表明，飼料中添加150 mg/ kg BHA對(duì)大口黑鱸具有一定的脂肪代謝促進(jìn)作用和抗氧化保護(hù)功能，且對(duì)大口黑鱸是安全的，安全系數(shù)為10倍。

關(guān)鍵詞:大口黑鱸；丁基羥基茴香醚；耐受性；生長(zhǎng)；血液指標(biāo)；抗氧化；組織學(xué)

大口黑鱸（Micropterus salmoides），又名加州鱸，原產(chǎn)于美國(guó)加利福尼亞州，于20世紀(jì)80年代引入我國(guó)，因其具有生長(zhǎng)迅速、抗病力強(qiáng)、肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富等優(yōu)點(diǎn)，已成為我國(guó)淡水養(yǎng)殖中的一種重要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)［1］。大口黑鱸作為典型的肉食性魚(yú)類(lèi)，對(duì)脂肪需求較高，對(duì)飼料氧化非常敏感［2］。而魚(yú)類(lèi)飼料中含有大量多不飽和脂肪酸，非常容易氧化變質(zhì)形成各種有毒產(chǎn)物，如氫過(guò)氧化物、脂肪酸烷氧基、醛類(lèi)等，從而損壞細(xì)胞的組成物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、DNA和小分子物質(zhì)，進(jìn)而影響細(xì)胞的完整性［3］。為了維持魚(yú)體健康，防止飼料的氧化變質(zhì)，必須采用有效的抗氧化系統(tǒng)，如內(nèi)源性自由基清除劑和外源性抗氧化劑。

丁基羥基茴香醚（butyl hydroxyanisole，BHA）是一種外源性酚類(lèi)抗氧化劑，主要通過(guò)抽氫反應(yīng)產(chǎn)生較穩(wěn)定的苯氧自由基來(lái)終止鏈?zhǔn)椒磻?yīng)［4］。BHA對(duì)熱比較穩(wěn)定，易溶于油脂，在弱堿條件下不易被破壞，與金屬離子作用不著色，有較強(qiáng)的抗菌力，可抑制黃曲霉菌的生長(zhǎng)［5］。據(jù)報(bào)道，100 mg/ kg BHA對(duì)阿霉素誘發(fā)的小鼠肝臟和心肌組織損傷具有顯著的保護(hù)作用［6］，0.2%和0.5%的BHA對(duì)醋氨酚所致小鼠肝損傷均具有顯著保護(hù)作用［7］。此外，適量的BHA還能延緩黃曲霉毒素誘發(fā)大鼠肝癌的過(guò)程，顯著降低肝癌誘發(fā)率，并推遲其他腫瘤的發(fā)生［8］。關(guān)于BHA的毒性作用說(shuō)法不一，Sgaragli等［9］研究表明，高劑量的BHA能夠損害生物膜系統(tǒng)，并且誘導(dǎo)人體紅細(xì)胞中高鐵血紅蛋白的形成。Kahl等［10］發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期攝入BHA會(huì)誘發(fā)大鼠前胃腫瘤。Verhagen等［11］報(bào)道BHA不僅會(huì)誘發(fā)大鼠前胃胃癌，而且會(huì)致使腺胃、小腸和直腸等組織產(chǎn)生癌變。此外，BHA的毒性與使用劑量密切相關(guān)，1 250 mg/ kg的BHA會(huì)引起大鼠前胃上皮細(xì)胞增生，5 000 mg/ kg的BHA會(huì)誘發(fā)大鼠前胃腫瘤，而10 000 mg/ kg的BHA則會(huì)誘發(fā)大鼠前胃胃癌［12］。但也有研究結(jié)果顯示，20 000 mg/ kg的BHA不會(huì)引起大鼠前胃胃癌［13］。目前，對(duì)BHA的研究大多集中在食品中其含量的檢測(cè)方法方面，對(duì)其在動(dòng)物飼料中應(yīng)用的研究較少。因此，本試驗(yàn)參考?xì)W盟對(duì)動(dòng)物飼料中BHA單獨(dú)添加或與其他抗氧化劑復(fù)合使用時(shí)的最高推薦劑量150 mg/ kg，以大口黑鱸為靶動(dòng)物，對(duì)BHA進(jìn)行耐受性評(píng)價(jià)試驗(yàn)，以確定BHA在水產(chǎn)飼料中添加的安全限量。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)用水產(chǎn)靶動(dòng)物為大口黑鱸，于2014年6月購(gòu)自佛山市三水白金水產(chǎn)種苗有限公司。正式試驗(yàn)開(kāi)始前，試驗(yàn)魚(yú)在養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)3周，暫養(yǎng)期間投喂基礎(chǔ)飼料。

1.2試驗(yàn)飼料

本試驗(yàn)依據(jù)農(nóng)業(yè)部《飼料原料和飼料添加劑水產(chǎn)靶動(dòng)物耐受性評(píng)價(jià)試驗(yàn)指南（試行）》進(jìn)行。在大口黑鱸的基礎(chǔ)飼料中分別添加0、150、300、1 500 mg/ kg的BHA，其中150 mg/ kg為最高推薦添加劑量，而300和1 500 mg/ kg分別是它的2和10倍，制成4種直徑為2.0 mm的硬顆粒料，自然晾干后備用。4種試驗(yàn)飼料依次命名為D0（對(duì)照）、D150、D300、D1500。飼料中的水分、粗灰分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪含量和總能分別采用105℃常壓干燥法、550℃灼燒法、凱氏定氮法、全脂肪測(cè)定法和氧彈儀燃燒法測(cè)定。試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1　試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets（DM basis）　%

續(xù)表1　

1.3試驗(yàn)分組及飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在國(guó)家水產(chǎn)飼料安全評(píng)價(jià)基地（北京，南口）室內(nèi)循環(huán)流水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行。隨機(jī)挑選體質(zhì)健康、個(gè)體均勻［平均體重（6.20±0.01）g］的大口黑鱸，分配到容積為0.26 m3的圓錐形養(yǎng)殖桶中。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)4個(gè)組，對(duì)應(yīng)飼喂4種試驗(yàn)飼料，每組6個(gè)重復(fù)（桶），每桶30尾魚(yú)。

試驗(yàn)魚(yú)每天表觀(guān)飽食投喂2次，投喂時(shí)間分別為08：00、16：00。定期檢測(cè)水質(zhì)，水質(zhì)條件保持在溶氧（DO）濃度＞7.0 mg/ L，氨氮（-N）濃度＜0.3 mg/ L，pH 7.5～8.5，水溫（23±1）℃。養(yǎng)殖試驗(yàn)從2014年7月15日到2014年9月23日，共70 d。

1.4樣品采集與指標(biāo)測(cè)定

1.4.1生長(zhǎng)指標(biāo)

養(yǎng)殖70 d后，分別對(duì)各桶魚(yú)稱(chēng)重并統(tǒng)計(jì)攝食量（feed intake，F(xiàn)I）、存活數(shù)，計(jì)算生長(zhǎng)指標(biāo)，各指標(biāo)計(jì)算公式如下：

1.4.2形體指標(biāo)

每桶隨機(jī)取3尾魚(yú)，測(cè)量體長(zhǎng)、體重、內(nèi)臟重、肝臟重，計(jì)算形體指標(biāo)，各指標(biāo)計(jì)算公式如下：

1.4.3血漿生化指標(biāo)

每桶隨機(jī)取6尾魚(yú)，三氯叔丁醇麻醉后尾靜脈取血，采用氟化鈉草酸鉀抗凝劑，在4℃、4 000 r/ min的條件下離心10 min，取上層血漿保存于-80℃冰箱中待測(cè)。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血漿生化指標(biāo)，所用試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.4.4抗氧化指標(biāo)

每桶隨機(jī)取5尾魚(yú)，采血制備血漿并取肝臟、心臟和肌肉，放在-80℃待測(cè)。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血漿及各組織中抗氧化指標(biāo)，所用試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.4.5組織切片

D0、D150和D1500組每桶隨機(jī)取2尾魚(yú)的肝臟和后腸組織，經(jīng)中性福爾馬林固定后，再經(jīng)酒精逐級(jí)脫水、透明、透蠟、包埋后，用組織切片機(jī)切片，最后用蘇木精-伊紅（HE）染色法染色，顯微鏡下觀(guān)察組織切片結(jié)構(gòu)。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SE）表示，所有數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），Duncan氏法多重比較檢驗(yàn)組間差異的顯著性，顯著性水平為P＜0.05。

2　結(jié)　果

2.1BHA對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)性能的影響

在飼料中添加BHA對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)性能的影響見(jiàn)表2。結(jié)果顯示：各組SR和FCR無(wú)顯著差異（P＞0.05）。D150組的終末均重、SGR、WGR和FI顯著高于D300、D1500組（P＜0.05），其余各組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.2BHA對(duì)大口黑鱸形體指標(biāo)的影響

飼料中添加BHA對(duì)大口黑鱸形體指標(biāo)的影響見(jiàn)表3。結(jié)果顯示：各組CF、VSI和HSI無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表2　BHA對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)性能的影響Table 2 Effects of BHA on growth performance of largemouth bass（Micropterus salmoides）（n＝6）

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)無(wú)字母或相同字母表示差異不顯著（P＞0.05），不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（P＜0.05）。下表同。

In the same row，values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference（P＞0.05），while with different small letter superscripts mean significant difference（P＜0.05）. The same as below.

表3　BHA對(duì)大口黑鱸形體指標(biāo)的影響Table 3 Effects of BHA on morphometric parameters of largemouth bass（Micropterus salmoides）（n＝18）

2.3BHA對(duì)大口黑鱸血漿生化指標(biāo)的影響

表4顯示：各組血漿中總蛋白（TP）、葡萄糖（GLU）和尿素氮（UN）含量均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。對(duì)照組血漿中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）含量及堿性磷酸酶（AKP）活性顯著高于其余各組（P＜0.05），其余各組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。D150、D300組血漿中高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）含量顯著高于D1500組（P＜0.05），與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。D150和D300組血漿中HDL-C/ TC顯著高于對(duì)照和D1500組（P＜0.05）。D1500組血漿中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），與D150、D300組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.4BHA對(duì)大口黑鱸抗氧化指標(biāo)的影響

2.4.1BHA對(duì)大口黑鱸肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

表5顯示：過(guò)氧化氫酶（CAT）活性各組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。對(duì)照組的丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性顯著高于D150和D300組（P＜0.05），與D1500組無(wú)顯著差異（P＞0.05）?？偪寡趸芰Γ═-AOC）以D1500組最高，顯著高于其余各組（P＜0.05），其余各組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）活性以D150組最低，顯著低于其余各組（P＜0.05），其余各組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表4　BHA對(duì)大口黑鱸血漿生化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of BHA on plasma biochemical indexes of largemouth bass（Micropterus salmoides）（n＝8）

表5　BHA對(duì)大口黑鱸肝臟抗氧化指標(biāo)的影響Table 5 Effects of BHA on antioxidant indexes in liver of largemouth bass（Micropterus salmoides）（n＝8）

2.4.2BHA對(duì)大口黑鱸肌肉抗氧化指標(biāo)的影響

表6顯示：SOD、GST、CAT活性及T-AOC各組間無(wú)顯著差異（P＞0.05），但D150、D300組的MDA含量顯著低于對(duì)照和D1500組（P＜0.05）。

表6　BHA對(duì)大口黑鱸肌肉抗氧化指標(biāo)的影響Table 6 Effects of BHA on antioxidant indexes in muscle of largemouth bass（Micropterus salmoides）（n＝8）

2.4.3BHA對(duì)大口黑鱸心臟抗氧化指標(biāo)的影響

表7顯示：T-AOC及CAT活性各組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。對(duì)照組的SOD活性顯著高于D150組（P＜0.05），與D300、D1500組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。MDA含量以對(duì)照組最高，顯著高于其余各組（P＜0.05）。

2.4.4BHA對(duì)大口黑鱸血漿抗氧化指標(biāo)的影響

表8顯示：SOD、CAT活性及T-AOC各組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。D150組的GST活性顯著低于對(duì)照和D300組（P＜0.05），與D1500組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSHPx）活性以D1500組最高，顯著高于其余各組（P＜0.05），其余各組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。MDA含量隨著B(niǎo)HA添加量的增加先顯著降低（P＜ 0.05），在D300組達(dá)到最低，之后在D1500組有所升高，但仍顯著低于對(duì)照和D150組（P＜0.05）。

表7　BHA對(duì)大口黑鱸心臟抗氧化指標(biāo)的影響Table 7 Effects of BHA on antioxidant indexes in heart of largemouth bass（Micropterus salmoides）（n＝8）

表8　BHA對(duì)大口黑鱸血漿抗氧化指標(biāo)的影響Table 8 Effects of BHA on antioxidant indexes in plasma of largemouth bass（Micropterus salmoides）（n＝8）

2.5大口黑鱸肝臟和后腸組織學(xué)觀(guān)察

2.5.1肝臟組織學(xué)觀(guān)察

如圖1所示，各組肝臟均出現(xiàn)不同程度的損傷。對(duì)照組（D0組）觀(guān)察了12尾魚(yú)，1尾正常，5尾出現(xiàn)肝臟細(xì)胞脂肪浸潤(rùn)，6尾肝纖維化，細(xì)胞崩解；D150組觀(guān)察了12尾魚(yú)，4尾正常，8尾出現(xiàn)不同程度肝纖維化，細(xì)胞崩解，出現(xiàn)肝臟細(xì)胞脂肪浸潤(rùn)；D1500組觀(guān)察了12尾魚(yú)，3尾正常，4尾出現(xiàn)肝臟細(xì)胞脂肪浸潤(rùn)，5尾肝纖維化。

2.5.2后腸組織學(xué)觀(guān)察

如圖2所示，對(duì)照組（D0組）觀(guān)察了12尾魚(yú)，9尾正常，3尾損傷，1尾腸上皮細(xì)胞損傷，1尾腸上皮細(xì)胞損傷并與固有層脫落，1尾上皮微絨毛輕微損傷；D150組觀(guān)察了12尾魚(yú)，11尾正常，1尾上皮細(xì)胞輕微損傷；D1500組觀(guān)察了12尾魚(yú)，11尾正常，1尾腸上皮細(xì)胞脫落。

3　討　論

3.1BHA對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)的影響

飼料在加工與存儲(chǔ)過(guò)程中容易發(fā)生氧化變質(zhì)形成各種有毒有害物質(zhì)，從而影響?hù)~(yú)類(lèi)生長(zhǎng)。為了維持魚(yú)體健康，防止飼料的氧化變質(zhì)，必須采用有效的抗氧化系統(tǒng)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼料中添加150 mg/ kg BHA能顯著提高大口黑鱸的生長(zhǎng)性能，這可能是由于150 mg/ kg的BHA能有效延緩飼料氧化，防止魚(yú)體受氧化脅迫。Hansen等［14］和Würtzen等［15］均報(bào)道400 mg/ kg的BHA會(huì)顯著降低妊娠母豬的增重率，還會(huì)引起肝臟和甲狀腺腫大。此研究結(jié)果表明高劑量的BHA可能會(huì)影響動(dòng)物的生長(zhǎng)，加重機(jī)體損傷。但本試驗(yàn)中D300 和D1500組的大口黑鱸的生長(zhǎng)性能與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異，說(shuō)明飼料中添加高劑量的BHA沒(méi)有抑制大口黑鱸攝食，這可能與不同動(dòng)物的耐受性或飼料中的脂肪來(lái)源和含量有關(guān)。

圖1　D0、D150和D1500組大口黑鱸肝臟組織學(xué)觀(guān)察Fig.1 Observation on hepatic histology of largemouth bass（Micropterus salmoides）in groups D0，D150 and D1500

3.2BHA對(duì)大口黑鱸血漿生化指標(biāo)的影響

血液生化指標(biāo)與魚(yú)類(lèi)機(jī)體代謝，營(yíng)養(yǎng)水平及疾病有著密切的聯(lián)系，它既能反映魚(yú)類(lèi)的正常生理狀態(tài)，也可用于評(píng)價(jià)其病理學(xué)變化，是衡量魚(yú)體是否處于相對(duì)健康狀態(tài)的一項(xiàng)重要指標(biāo)［16］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，BHA對(duì)各組大口黑鱸血漿中TP、GLU和UN含量均無(wú)顯著影響，說(shuō)明BHA的添加沒(méi)有對(duì)大口黑鱸機(jī)體蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)和糖代謝產(chǎn)生顯著影響。TC和TG是血液脂肪的組成成分，其含量的高低主要反映脂類(lèi)的吸收與代謝狀況［17］，本試驗(yàn)中，各BHA添加組血漿中TC和TG含量均顯著低于對(duì)照組，而且150和300 mg/ kg添加量的BHA可顯著提高大口黑鱸血漿中HDL-C含量和HDL-C/ TC，表明BHA的添加可顯著改善大口黑鱸血液脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，降低血脂含量，有利于維持魚(yú)體健康。AKP、AST和ALT活性主要反映動(dòng)物肝臟受損程度，正常生理?xiàng)l件下魚(yú)體血漿中AKP、AST和ALT活性很低，當(dāng)動(dòng)物肝細(xì)胞受損時(shí)其活性會(huì)顯著升高，升高程度與肝細(xì)胞受損程度相一致［18］。本試驗(yàn)中，BHA的添加顯著降低了大口黑鱸血漿中的AKP活性，且D1500組血漿中AST和ALT活性均顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明BHA的添加可有效緩解飼料脂肪氧化和大口黑鱸機(jī)體的氧化損傷，從而降低肝臟的氧化應(yīng)激，減輕肝臟氧化損傷。

3.3BHA對(duì)大口黑鱸肝臟、肌肉、心臟、血漿抗氧化功能的影響

當(dāng)受到氧化應(yīng)激時(shí)，動(dòng)物體內(nèi)的氧化與抗氧化作用失衡，從而引起機(jī)體內(nèi)高活性分子活性氧自由基激增，并且產(chǎn)生大量的氧化中間產(chǎn)物，若不及時(shí)清除多余的活性氧自由基，則會(huì)導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)脂質(zhì)過(guò)氧化損傷［19］。為了抵御自由基對(duì)生物體的損害作用，維持機(jī)體健康與代謝平衡，必須建立有效的防御機(jī)制［20］。機(jī)體防御機(jī)制一種是具有特異性的抗氧化酶系統(tǒng)，包括SOD、GSH-Px、GST、CAT等，另一種是非酶促系統(tǒng)，主要包括合成抗氧化劑、維生素、微量元素等［21］。

圖2　D0、D150和D1500組大口黑鱸后腸組織學(xué)觀(guān)察Fig.2 Observation on distal intestinal histology of largemouth bass（Micropterus salmoides）in groups D0，D150 and D1500

本研究結(jié)果顯示，BHA的添加對(duì)大口黑鱸肝臟中CAT活性無(wú)顯著影響，而對(duì)照組肝臟中SOD活性和MDA含量顯著高于D150和D300組，與D1500組無(wú)顯著差異。SOD是具有核基因編碼的一類(lèi)含有金屬元素的氧化還原酶類(lèi)，是唯一以超氧陰離子（）為底物的酶［22］，可催化轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫（H2O2）和氧氣（O2），從而清除，維持生物體自由基產(chǎn)生與消除的動(dòng)態(tài)平衡。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一，其含量的高低可間接反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。組織中SOD和MDA常常相互配合，共同反映生物體自由基的代謝狀態(tài)。本研究中，對(duì)照組肝臟中SOD活性顯著高于D150和D300組，這可能是由于大口黑鱸長(zhǎng)期攝入未添加外源性抗氧化劑的氧化飼料，導(dǎo)致細(xì)胞中氧自由基等生物活性物質(zhì)的濃度升高，即抗氧化酶的反應(yīng)底物濃度增加，從而提高了大口黑鱸肝臟中SOD的活性。本試驗(yàn)中D150組肝臟中GST活性顯著低于其余各組。GST是一類(lèi)與肝臟解毒有關(guān)的酶，在肝細(xì)胞中大量存在，具有消除體內(nèi)過(guò)氧化物及解毒雙重功能，同時(shí)GST活性的升高常常作為肝臟損傷的敏感指標(biāo)［23］。有研究顯示，BHA能顯著提高大鼠和小鼠肝臟中GST的活性［24］，本研究結(jié)果與之相反。肝損傷程度分至少3個(gè)層次，即脂肪浸潤(rùn)、肝纖維化、癌變。目前HE病理切片僅顯示組織形態(tài)的變化，并不能明確其和動(dòng)物生理水平的關(guān)系。因此，D150組肝臟中GST活性顯著低于其他組，主要與肝功能和機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的反應(yīng)相關(guān)。D1500組肝臟中T-AOC最高，說(shuō)明1 500 mg/ kg的BHA顯著提高了大口黑鱸肝臟的抗氧化能力。

本研究中，D150和D300組肌肉中MDA含量顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明BHA的添加可有效緩解大口黑鱸肌肉的脂質(zhì)過(guò)氧化。自由基對(duì)肌肉中的多不飽和脂肪酸具有很高的親和力，可引發(fā)脂質(zhì)氧化，形成不穩(wěn)定的氫過(guò)氧化物，并迅速降解成MDA等物質(zhì)，促使MDA含量升高［25］。據(jù)報(bào)道，BHA在添加量為120 mg/ kg時(shí)，對(duì)豬肉脂肪的抗氧化效果較好且添加量較?。?6］；Sebranek等［27］研究發(fā)現(xiàn)，2 500 mg/ kg的BHA對(duì)新鮮豬肉香腸具有顯著的抗氧化效果；Ahn等［28］研究發(fā)現(xiàn)，BHA比天然迷迭香萃取物更能有效抑制熟牛肉的氧化變質(zhì)。但本試驗(yàn)中D1500組肌肉中MDA含量較D150和D300組顯著升高，這可能是由于過(guò)量的抗氧化劑伴隨著自由基對(duì)機(jī)體的損傷加重，BHA添加劑量過(guò)高對(duì)肉質(zhì)的抗氧化效果反而會(huì)下降［29］。

小鼠心臟中的SOD和CAT活性顯著低于肝臟［30］，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致，但對(duì)照組心臟中SOD活性顯著低于D150組，可能原因是150 mg/ kg的BHA降低了心臟中MDA的含量，從而降低了大口黑鱸心臟的氧化應(yīng)激，機(jī)體不需要過(guò)多的SOD來(lái)清除自由基，從而導(dǎo)致SOD活性下降。相關(guān)研究結(jié)果顯示，阿霉素可導(dǎo)致小鼠心肌中MDA含量極顯著升高，而預(yù)先飼喂100 mg/ kg 的BHA能顯著抑制小鼠心肌中MDA含量的升高［6］，這與本試驗(yàn)中BHA的添加顯著降低了大口黑鱸心臟中MDA含量的結(jié)果相吻合。GST廣泛存在于哺乳動(dòng)物各組織中，在心肌細(xì)胞抗氧化損傷中占有重要地位［31］，可協(xié)同保護(hù)膜系統(tǒng)巰基不被自由基破壞。但心肌組織中GST活性很低，且GST同工酶檢測(cè)不出來(lái)，這些抗氧化酶的減少或缺失會(huì)使心肌細(xì)胞極易受到氧自由基的攻擊而產(chǎn)生損傷。本研究中，GST在大口黑鱸心臟中未檢出，可能由于GST在大口黑鱸心臟中不表達(dá)或?qū)Υ罂诤邝|心臟應(yīng)激反應(yīng)不敏感［32］。

本試驗(yàn)中，BHA的添加對(duì)大口黑鱸血漿中SOD、CAT活性及T-AOC無(wú)顯著影響，但顯著降低了大口黑鱸血漿中MDA含量。這可能是BHA的添加提高了機(jī)體內(nèi)源性抗氧化酶的活性，有效緩解了大口黑鱸機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化，從而減少了血漿中氧化產(chǎn)物的水平［6］。D150組血漿中GST活性顯著低于對(duì)照和D300組。BHA是Ⅱ相酶的單功能誘導(dǎo)劑，對(duì)GST具有誘導(dǎo)作用［33］，能夠提高機(jī)體GST活性，達(dá)到清除自由基，對(duì)有害物質(zhì)解毒的效果，當(dāng)肝細(xì)胞受損害時(shí)，GST常常很早釋放到血液中。本試驗(yàn)中，飼料中添加150 mg/ kg的BHA顯著降低了大口黑鱸血漿中GST的活性，原因可能是攝食添加150 mg/ kg BHA飼料的大口黑鱸的肝臟受損程度較輕，所以釋放到血漿中的GST也較少，這也與肝臟組織切片中顯示的150 mg/ kg的BHA可有效緩解大口黑鱸肝臟損傷的結(jié)果相吻合。GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過(guò)氧化氫分解的酶，其活性中心為硒半胱氨酸。GSH-Px有5種同工異構(gòu)酶，每種異構(gòu)酶的活性隨組織的不同表達(dá)量也不同［34］，它們均可以谷胱甘肽（GSH）為底物，將H2O2和烷烴氫過(guò)氧化物還原，可以起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。本試驗(yàn)中D1500組血漿中GSH-Px活性最高，可能原因是高劑量的BHA對(duì)GSH具有顯著誘導(dǎo)作用，促進(jìn)GSH-Px與底物GSH和H2O2反應(yīng)生成水和氧化型谷胱甘肽（GSSG）。

3.4BHA對(duì)大口黑鱸肝臟、后腸組織學(xué)的影響

本研究針對(duì)對(duì)照、D150和D1500組的大口黑鱸肝臟、后腸組織進(jìn)行了病理學(xué)分析。從大口黑鱸的肝臟組織切片可以看出，對(duì)照、D150和D1500組的肝臟均出現(xiàn)了不同程度的損傷，尤其是未添加外源性抗氧化劑的對(duì)照組，出現(xiàn)肝臟纖維化、脂肪浸潤(rùn)、大量脂肪空泡和細(xì)胞崩解等病變。在后腸組織切片中，對(duì)照、D150和D1500組的后腸組織也均有損傷，對(duì)照組出現(xiàn)腸上皮細(xì)胞損傷，部分上皮細(xì)胞與固有層分離，上皮微絨毛損傷等病變，但D150和D1500組上述病變有所減輕，說(shuō)明BHA可有效緩解腸道組織損傷。各組大口黑鱸的肝臟和腸道均發(fā)生了不同程度的病變，這可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)是模擬野外大口黑鱸養(yǎng)殖過(guò)程中飼料儲(chǔ)存條件（室溫，儲(chǔ)存期3個(gè)月），由于飼料長(zhǎng)期在夏季高溫高濕的環(huán)境下放置，會(huì)發(fā)生不同程度的氧化變質(zhì)所致。大口黑鱸對(duì)脂質(zhì)氧化非常敏感［2］，長(zhǎng)期攝食氧化油脂會(huì)導(dǎo)致其組織受損；也有可能是因?yàn)榇罂诤邝|對(duì)人工配合飼料的適應(yīng)性不足，導(dǎo)致養(yǎng)殖后期出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢，誘發(fā)肝臟、腸道病變等。關(guān)勝軍等［35］研究表明，投喂人工配合飼料20 d后，大口黑鱸出現(xiàn)了生長(zhǎng)緩慢，肝臟病變等現(xiàn)象，這與本試驗(yàn)結(jié)果相吻合。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼料中添加150 mg/ kg的BHA可有效緩解肝臟、后腸組織損傷，但飼料中僅添加BHA仍未能完全抵御大口黑鱸由氧化油脂所造成的組織損傷。

4　結(jié)　論

飼料中添加150 mg/ kg的BHA對(duì)大口黑鱸具有一定的脂肪代謝促進(jìn)作用和抗氧化保護(hù)功能，且對(duì)大口黑鱸是安全的，安全系數(shù)為10倍。

參考文獻(xiàn):

［1］ 丁慶秋，陳宇航，曹雙俊，等.大口黑鱸的營(yíng)養(yǎng)需求研究進(jìn)展［J］.養(yǎng)殖與飼料，2013（11）：38-43.

［2］ YUAN Y，CHEN Y J，LIU Y J，et al.Dietary high level of vitamin premix can eliminate oxidized fish oil-induced oxidative damage and loss of reducing capacity in juvenile largemouth bass（Micropterus salmoides）［J］.Aquaculture Nutrition，2014，20（2）：109-117.

［3］ HALLIWELL B，AESCHBACH R，L?LIGER J，et al. The characterization of antioxidants［J］. Food and Chemical Toxicology，1995，33（7）：601-617.

［4］ 魏金濤，齊德生，張妮婭.飼料抗氧化劑作用機(jī)理及其活性評(píng)價(jià)方法研究進(jìn)展［J］.飼料工業(yè)，2007，28 （2）：7-10.

［5］ WILLIAMS G M，TANAKA T，MAEURA Y. Doserelated inhibition of aflatoxin B1induced hepatocarcinogenesis by the phenolic antioxidants，butylated hydroxyanisole and butylated hydroxytoluene［J］.Carcinogenesis，1986，7（7）：1043-1050.

［6］ 王立新，林三仁.2（3）-叔丁基-4-羥基茴香醚對(duì)阿霉素誘發(fā)小鼠毒性的保護(hù)作用及其抗氧化機(jī)制［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1998，33（11）：807-811.

［7］ 程燕，王立新，林三仁.叔丁基羥基茴香醚對(duì)小鼠醋氨酚中毒性肝損傷的保護(hù)作用［J］.胃腸病學(xué)，2000，5（2）：109-111.

［8］ 嚴(yán)瑞琪，陳志英，蘇建家，等.叔丁基對(duì)羥基茴香醚（BHA）和核黃素（VB2）對(duì)黃曲霉毒素（AFT）誘發(fā)大鼠腫瘤的影響［J］.癌癥，1983，2（4）：232-235.

［9］ SGARAGLI G，CORTE L D，PULITI R，et al.Oxidation of 2-t-butyl-4-methoxyphenol（BHA）by horseradish and mammalian peroxidase systems［J］. Biochemical Pharmacology，1980，29（5）：763-769.

［10］ KAHL R，KAPPUS H.Toxicology of the synthetic antioxidants BHA and BHT in comparison with the natural antioxidant vitamin E［J］. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und Forschung，1993，196（4）：329-338.

［11］ VERHAGEN H，F(xiàn)URNéE C，SCHUTTE B，et al. Dose-dependent effects of short-term dietary administration of the food additive butylated hydroxyanisole on cell kinetic parameters in gastro-intestinal tract［J］. Carcinogenesis，1990，11（9）：1461-1468.

［12］ ITO N，F(xiàn)UKUSHIMA S，TAMANO S，et al.Dose response in butylated hydroxyanisole induction of forestomach carcinogenesis in F344 rats［J］.Journal of the National Cancer Institute，1986，77（6）：1261-1265.

［13］ LAURIAULT V，GRASSO P，POWELL C J.Butylated hydroxyanisole（BHA）does not cause forestomach hyperplasia by inhibiting the release of gastric mucus［J］.Toxicology，1990，64（3）：281-290.

［14］ HANSEN E V，MEYER O，OLSEN P.Study on toxicity of butylated hydroxyanisole（BHA）in pregnant gilts and their foetuses［J］.Toxicology，1982，23（1）：79-83.

［15］ WüRTZEN G，OLSEN P. BHA study in pigs［J］. Food and Chemical Toxicology，1986，24（10/11）：1229-1233.

［16］ SILVEIRA-COFFIGNY R，PRIETO-TRUJILLO A，ASCENCIO-VALLE F.Effects of different stressors in haematological variables in cultured Oreochromis aureus S［J］.Comparative Biochemistry and Physiology Part C：Toxicology＆Pharmacology，2004，139（4）：245-250.

［17］ 王宗偉，牟曉玲，楊國(guó)偉，等.日糧營(yíng)養(yǎng)素水平對(duì)東北肉鵝生長(zhǎng)性能及血液生化指標(biāo)的影響（1～28日齡）［J］.核農(nóng)學(xué)報(bào)，2009，23（5）：891-897.

［18］ NYBLOM H，BERGGREN U，BALLDIN J，et al. High AST/ ALT ratio may indicate advanced alcoholic liver disease rather than heavy drinking［J］. Alcohol and Alcoholism，2004，39（4）：336-339.

［19］ HALLIWELL B，GUTTERIDGE J M C.Oxygen toxicity，oxygen radicals，transition metals and disease ［J］.Biochemical Journal，1984，219（1）：1-14.

［20］ PUGH S Y，DIGUISEPPI J L，F(xiàn)RIDOVICH I.Induction of superoxide dismutases in Escherichia coli by manganese and iron［J］. Journal of Bacteriology，1984，160（1）：137-142.

［21］ 黃權(quán)，蘇琳.動(dòng)物體內(nèi)氧化應(yīng)激與抗氧化劑應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)獸藥雜志，2013，47（5）：66-69.

［22］ WINSTON G W，DI GIULIO R T D.Prooxidant and antioxidant mechanisms in aquatic organisms［J］. A-quatic Toxicology，1991，19（2）：137-161.

［23］ SEN A，KIRIKBAKAN A. Biochemical characterization and distribution of glutathione S-transferases in leaping mullet（Liza saliens）［J］.Biochemistry：Moscow，2004，69（9）：993-1000.

［24］ BENSON A M，BATZINGER R P，OU S Y L，et al. Elevation of hepatic glutathione S-transferase activities and protection against mutagenic metabolites of benzo （a）pyrene by dietary antioxidants［J］. Cancer Research，1978，38（12）：4486-4495.

［25］ FERNáNDEZJ，PéREZ-áLVAREZJA，F(xiàn)ERNáNDEZ-LóPEZ J A.Thiobarbituric acid test for monitoring lipid oxidation in meat［J］.Food Chemistry，1997，59（3）：345-353.

［26］ 張根生，任媛媛，石慧，等.兩種抗氧化劑協(xié)同增效劑對(duì)豬脂肪抗氧化性的影響［J］.肉類(lèi)研究，2012，26 （5）：10-13.

［27］ SEBRANEK J G，SEWALT V J H，ROBBINS K L，et al. Comparison of a natural rosemary extract and BHA/ BHT for relative antioxidant effectiveness in pork sausage［J］. Meat Science，2005，69（2）：289-296.

［28］ AHN J，GRüN I U，F(xiàn)ERNANDO L N. Antioxidant properties of natural plant extracts containing polyphenolic compounds in cooked ground beef［J］.Journal of Food Science，2002，67（4）：1364-1369.

［29］ 尹守錚.外源抗氧化劑對(duì)肉雞機(jī)體氧化還原狀態(tài)和生產(chǎn)性能的影響［D］.碩士學(xué)位論文.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

［30］ DOROSHOW J H，LOCKER G Y，MYERS C E.Enzymatic defenses of the mouse heart against reactive oxygen metabolites：alterations produced by doxorubicin［J］. Journal of Clinical Investigation，1980，65 （1）：128-135.

［31］ R?TH E，MARCZIN N，BALATONYI B，et al.Effect of a glutathione S-transferase inhibitor on oxidative stress and ischemia-reperfusion-induced apoptotic signalling of cultured cardiomyocytes［J］.Experimental＆Clinical Cardiology，2011，16（3）：92-96.

［32］ 劉金桃，艾立川，王嘉，等.大口黑鱸對(duì)飼料中乙氧基喹啉的耐受性評(píng)價(jià)［J］.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2015，27 （4）：1152-1162.

［33］ PROCHASKA H J，TALALAY P.Regulatory mechanisms of monofunctional and bifunctional anticarcinogenic enzyme inducers in murine liver［J］.Cancer Research，1988，48（17）：4776-4782.

［34］ ARTHUR J R.The glutathione peroxidases［J］.Cellular and Molecular Life Sciences，2000，57（13/14）：1825-1835.

［35］ 關(guān)勝軍，吳銳全，謝駿，等.兩種飼料對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)、消化道指數(shù)和消化酶活性的影響［J］.飼料工業(yè)，2007，28（2）：32-36.

（責(zé)任編輯菅景穎）

Tolerance Evaluation of Butyl-Hydroxyanisole in Diets of Largemouth Bass（Micropterus salmoides）

YU Lili1，2XUE Min2?WANG Jia2HAN Fang2ZHENG Yinhua2WU Xiufeng2WU Lixin1
（1. College of Fisheries and Life Science，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China；2. National Aquafeed Safety Assessment Station，F(xiàn)eed Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）

Abstract：A 10-week growth trail was conducted to evaluate the tolerance of largemouth bass（Micropterus salmoides）on butyl-hydroxyanisole（BHA）based on the changes of growth performance，plasma biochemical indexes，tissue antioxidant indexes and histology of liver and intestine. Four experimental diets were prepared with BHA supplemental levels at 0（D0 group，as control group），150（D150 group），300（D300 group）and 1 500 mg/ kg（D1500 group），in which 150 mg/ kg was designed as the maximum recommended level，otherwise the 300 and 1 500 mg/ kg were 2 and 10 fold levels of the maximum recommended level，respectively.The largemouth bass were chosen as the target animal，and each diet was fed to 6 replicates with 30 largemouth bass with the initial body weight of（6.20±0.01）g. The results showed as follows：fish in D150 group showed the best growth performance，and no significant differences in final average body weight，weight gain rate，special gain rate and feed intake were observed among other groups（P＞0.05）. The condition factor，hepatosomatic index and viscerasomatic index in all groups had no significant differences（P＞0.05）. Plasma total cholesterol（TC），triglyceride（TG）contents and alkaline phosphatase（AKP）activity in control group were significantly higher than those in other groups（P＜0.05）. Plasma high density lipoprotein cholesterol （HDL-C）/ TC in D150 and D300 groups was significantly higher than that in control and D1500 groups（P＜0.05）. Plasma aspartate aminotransferase（AST）and alanine aminotransferase（ALT）activities in D1500 group were significantly lower than those in control group（P＜0.05），but had no significant differences with those in D150 and D300 groups（P＜0.05）. Liver superoxide dismutase（SOD）activity in D150 and D300 groups was significantly lower than that in control group（P＜0.05），but had no significant difference with that in D1500 group（P＜0.05）. Supplementation of 1 500 mg/ kg BHA could significantly enhance the liver total anti-oxidant ability（T-AOC）（P＜0.05），and malondialdehyde（MDA）content in plasma，heart and liver were significantly decreased in each BHA supplemental groups（P＜0.05）. Different degrees of liver and intestinal histological damage were observed in control，D150 and D1500 groups，but fish fed diets with 150 and 1 500 mg/ kg BHA relieved the symptom. The results show that the supplementation of 150 mg/ kg BHA can enhance the fat metabolism and antioxidant protection of largemouth bass，and a 10 fold of safety margin is obtained in the present study.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2016，28（3）：747-758］

Key words：largemouth bass（Micropterus salmoides）；butyl hydroxyanisole；tolerance；growth；blood indexes；antioxidant；histology

Corresponding author?，professor，E-mail：xuemin@cass.cn

通信作者:?薛 敏，研究員，博士生導(dǎo)師，E-mail：xuemin@cass.cn

作者簡(jiǎn)介:于利莉（1990—），女，江蘇鹽城人，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)。E-mail：yulili060590@163.com

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金（31101907，31372539，31572631）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（201203015）；北京市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（SCGWZJ 20161103-1）；國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2014CB138600）

收稿日期:2015-09-15

doi：10.3969/ j.issn.1006-267x.2016.03.015

中圖分類(lèi)號(hào):S963

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1006-267X（2016）03-0747-12