張金文，杜春海,張　杰(.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血管外科，河北 石家莊 050000；.河北省景縣人民醫(yī)院外科，河北 景縣 05500；.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院婦瘤科，河北 石家莊 0500)

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·論著·

雙酚A暴露對(duì)iNOS基因缺失實(shí)驗(yàn)鼠生殖能力的影響

張金文1，杜春海2,張杰3(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血管外科，河北 石家莊 050000；2.河北省景縣人民醫(yī)院外科，河北 景縣 053500；3.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院婦瘤科，河北 石家莊 050011)

[摘要]目的研究雙酚A(bisphenol A，BPA)對(duì)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS )基因缺失實(shí)驗(yàn)鼠(iNOS(-/-))生殖能力的影響。方法選取基因型實(shí)驗(yàn)鼠(iNOS(+/+))和iNOS(-/-)實(shí)驗(yàn)鼠分別配對(duì)，計(jì)算每窩子鼠的數(shù)量及性別比例，然后選取幼鼠強(qiáng)飼(oral gavage) BPA 100和200 μg·kg(-1)·d(-1),共13 d，統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)鼠的排卵數(shù)量。結(jié)果2種實(shí)驗(yàn)鼠生產(chǎn)仔鼠數(shù)量和仔鼠雌雄比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，iNOS(-/-)對(duì)照組和iNOS(+/+) 200 μg·kg(-1)·d(-1)實(shí)驗(yàn)組卵細(xì)胞數(shù)高于iNOS(+/+) 100 μg·kg(-1)·d(-1)實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)；iNOS(-/-)實(shí)驗(yàn)鼠200 μg·kg(-1)·d(-1)實(shí)驗(yàn)組排卵細(xì)胞數(shù)量明顯少于其他5組(P<0.05)。結(jié)論iNOS基因缺失未導(dǎo)致小鼠生育能力和子鼠雌雄比例的明顯異常；BPA暴露導(dǎo)致iNOS(+/+)和iNOS(-/-)實(shí)驗(yàn)鼠排卵數(shù)量下降，提示iNOS具有保護(hù)雌鼠在卵細(xì)胞成熟及排卵免受BPA負(fù)面的影響。

[關(guān)鍵詞]一氧化氮合酶；雙酚A；生育力；小鼠

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.03.022

誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)催化左旋精氨酸(L-arginine)產(chǎn)生一氧化氮(nitric oxide，NO)，作為一個(gè)重大的旁分泌調(diào)解器和生理調(diào)節(jié)劑在雌性生殖系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程和卵細(xì)胞發(fā)育成熟中起到重要的調(diào)節(jié)作用[1-4]。人類通過(guò)接觸含雙酚A(bisphenol A，BPA)日用品而受到影響。BPA暴露可引起減數(shù)分裂的異常[5]或干擾卵母細(xì)胞第二次減數(shù)分裂中紡錘體的形成，導(dǎo)致卵子的非整倍體[6]。在人類的卵泡液和羊水中可檢測(cè)到BPA[7-8]。BPA阻止卵細(xì)胞成熟﹑干擾囊胚形成、降低生育能力并導(dǎo)致復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)[9]。本研究采用BPA對(duì)iNOS-/-實(shí)驗(yàn)鼠和iNOS+/+實(shí)驗(yàn)鼠管飼，旨在觀察iNOS基因和BPA對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠卵細(xì)胞發(fā)育成熟能力的影響。報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取iNOS-/-(美國(guó))和iNOS+/+(德國(guó) )實(shí)驗(yàn)鼠，來(lái)自同窩出生仔鼠，實(shí)驗(yàn)鼠按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)[10]。iNOS-/-、iNOS+/+出生后20～22 d健康的雌鼠和雄鼠分別被關(guān)在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物設(shè)施內(nèi)，控制溫度(22°C)、光周期(12 h光照,12 h黑暗)，能夠自由獲得水和飼料。本研究經(jīng)當(dāng)?shù)貏?dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2iNOS-/-和iNOS+/+實(shí)驗(yàn)鼠生殖能力及仔鼠雌雄比例觀察出生后20～22 d iNOS-/-實(shí)驗(yàn)鼠和iNOS+/+實(shí)驗(yàn)鼠，分別選取一雌和一雄進(jìn)行配對(duì)交配，每組54對(duì)，于出生后1周統(tǒng)計(jì)產(chǎn)生仔鼠只數(shù)，并根據(jù)外生殖器形態(tài)計(jì)數(shù)雌雄比例。

1.3BPA管飼法BPA(CAS-Nr:80-05-7, Merck)溶于2 g/L乙醇中，然后用玉米油稀釋到0.01 g/L。乙醇在玉米油中的濃度是0.5%。雌性幼體 (生后20～22 d)的iNOS-/-和iNOS+/+實(shí)驗(yàn)鼠用管飼法灌注BPA 100和200 μg·kg-1·d-1，另每組設(shè)對(duì)照組管飼法灌注0.5%乙醇(玉米油稀釋)。

1.4卵母細(xì)胞收集雌性實(shí)驗(yàn)鼠在BPA(實(shí)驗(yàn)組)和溶劑組(對(duì)照組)管飼第11天肌內(nèi)注射5 U孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin，PMS, Sigma-Aldrich，USA)， 42～44 h后晚間肌內(nèi)注射5 U孕馬絨毛膜促性腺激素釋放激素(Sigma-Aldrich，USA)。15 h后從輸卵管收集已排出的卵細(xì)胞。收集每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的卵丘復(fù)合體，卵母細(xì)胞周圍的其他組織用透明質(zhì)酸酶去除(Sigma-Aldrich,USA. 400～1 000 units/mg)并計(jì)算卵細(xì)胞個(gè)數(shù)及每組老鼠卵細(xì)胞的平均排卵率。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用 SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料比較分別采用t檢驗(yàn)、F檢驗(yàn)和q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1iNOS-/-和iNOS+/+實(shí)驗(yàn)鼠仔鼠數(shù)量及仔鼠雌雄比例比較iNOS-/-和iNOS+/+組實(shí)驗(yàn)鼠生產(chǎn)仔鼠數(shù)量和仔鼠雌雄比例差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1　iNOS-/-和iNOS+/+實(shí)驗(yàn)鼠仔鼠數(shù)量及

2.2BPA對(duì)iNOS-/-和iNOS+/+實(shí)驗(yàn)鼠卵細(xì)胞產(chǎn)生量的影響iNOS-/-對(duì)照組和iNOS+/+200 μg·kg-1·d-1實(shí)驗(yàn)組卵細(xì)胞數(shù)高于iNOS+/+100 μg·kg-1·d-1實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)；iNOS-/-實(shí)驗(yàn)鼠200 μg·kg-1·d-1實(shí)驗(yàn)組排卵細(xì)胞數(shù)量明顯少于其他5組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2　BPA對(duì)iNOS-/-和iNOS+/+實(shí)驗(yàn)鼠

*P<0.05與iNOS+/+對(duì)照組比較#P<0.05與iNOS+/+100 μg·kg-1·d-1比較△P<0.05與iNOS+/+200 μg·kg-1·d-1比較☆P<0.05與iNOS-/-對(duì)照組比較▲P<0.05與iNOS-/-100 μg·kg-1·d-1比較(q檢驗(yàn))

3討論

BPA的化學(xué)名為2，2-二(4-羥基苯基) 丙烷，簡(jiǎn)稱二酚基丙烷，是一種酚類環(huán)境雌激素，在工業(yè)上又叫作聚碳酸酯，它是世界上使用最廣泛的工業(yè)化合物之一，主要用于生產(chǎn)聚苯醚樹(shù)脂、環(huán)氧樹(shù)脂、聚酯樹(shù)脂、不飽和聚砜樹(shù)脂等多種高分子材料。礦泉水瓶、嬰兒用瓶、罐頭內(nèi)包裝、食品包裝內(nèi)里、醫(yī)療器械、牙科填充劑以及其他數(shù)百種日用品中都含有BPA。2003～2004年，美國(guó)健康和營(yíng)養(yǎng)調(diào)查協(xié)會(huì)對(duì)6歲以上不同性別和年齡的2 517例調(diào)查者進(jìn)行了尿樣檢測(cè)，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)在92%以上調(diào)查者尿樣中檢測(cè)到BPA[11]。

BPA 是由2個(gè)不飽和酚環(huán)組成的聯(lián)苯復(fù)合物，包含2個(gè)處在對(duì)位的羥基，結(jié)構(gòu)類似于雌二醇(estradiol，E2)和己烯雌酚( diethylstilbestrol，DES)。BPA單體分子之間會(huì)發(fā)生聚合，以酯鍵結(jié)合在一起，當(dāng)這些聚合物在高溫下或與堿性/酸性物質(zhì)放在一起時(shí)，就會(huì)破壞BPA 分子之間的酯鍵，使之發(fā)生斷裂，游離出BPA 分子的單體。由于BPA 的結(jié)構(gòu)與E2和DES類似，因此它具有弱的雌激素活性，它可干擾機(jī)體的內(nèi)分泌系統(tǒng)。

Hunt等[5]給青春期雌性小鼠按體質(zhì)量喂服20、40、100 μg·kg-1·d-1BPA共7 d，發(fā)現(xiàn)在卵母細(xì)胞生長(zhǎng)的最后階段，短期、低劑量BPA暴露，導(dǎo)致卵母細(xì)胞減數(shù)分裂發(fā)生異常。BPA作為一個(gè)強(qiáng)有力的非整倍體誘發(fā)劑作用于哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞，誘導(dǎo)染色體分離發(fā)生錯(cuò)誤；BPA也能干擾卵母細(xì)胞第2次減數(shù)分裂中紡錘體的形成，導(dǎo)致卵子的非整倍體[9，11]。BPA暴露也會(huì)影響原始卵泡的啟動(dòng)募集。Rivera等[12]將出生后1～14 d的雌性羔羊進(jìn)行低劑量BPA 處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BPA 刺激了原始卵泡的啟動(dòng)募集，使卵巢中原始卵泡的數(shù)量顯著減少，增加了有腔卵泡的發(fā)育數(shù)量，提高了有腔卵泡的閉鎖率。BPA引起的卵泡發(fā)育進(jìn)程的改變，將會(huì)影響羔羊成年后的卵巢功能。Chao等[7]對(duì)新生鼠用BPA 處理，促進(jìn)了原始卵泡向初級(jí)卵泡的轉(zhuǎn)變，使得原始卵泡庫(kù)中原始卵泡的數(shù)量顯著減少，嚴(yán)重影響了成年鼠的生育能力，并發(fā)現(xiàn)BPA能增強(qiáng)卵巢雌激素受體(estrogen receptor，ER)在mRNA和蛋白水平的活性，干擾減數(shù)分裂Ⅰ期紡錘體準(zhǔn)確的組裝，導(dǎo)致 CD-1實(shí)驗(yàn)鼠卵細(xì)胞發(fā)育成熟受阻。

人類BPA暴露可能與女童性早熟發(fā)病有關(guān)[13]。BPA 暴露可能是影響職業(yè)女性血清催乳素水平的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[14]。Machtinger等[8]發(fā)現(xiàn)在體外BPA能干擾人卵細(xì)胞的成熟，破壞卵細(xì)胞紡錘體構(gòu)成及染色體在卵細(xì)胞赤道板上的排列，導(dǎo)致卵細(xì)胞染色體畸形發(fā)生。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BPA暴露100 μg·kg-1·d-1可減少 iNOS-/-和iNOS+/+實(shí)驗(yàn)鼠排卵細(xì)胞的數(shù)量；在BPA暴露200 μg·kg-1·d-1劑量， iNOS-/-200 μg·kg-1·d-1組較iNOS-/-100 μg·kg-1·d-1組和iNOS+/+兩實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)鼠排卵細(xì)胞的數(shù)量的減少差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

iNOS誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO在雌性生殖系統(tǒng)具有促進(jìn)卵泡形成、排卵、受精卵著床及孕期維護(hù)的作用[4]。采用抑制NO合成的措施可以影響豬的排卵[1]。內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因敲除小鼠的性周期紊亂，其排卵率、卵巢形態(tài)學(xué)和類固醇生成也受到干擾[15]。本研究結(jié)果顯示，iNOS基因敲除實(shí)驗(yàn)鼠的繁殖能力和仔鼠雌雄比例差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果與Huo等[16]報(bào)道的iNOS-/-實(shí)驗(yàn)鼠沒(méi)有明顯的的生育表型結(jié)果相一致。提示iNOS催化合成的NO不能直接或間接地控制卵細(xì)胞的基因表達(dá)，或iNOS基因敲除被復(fù)雜基因調(diào)控與補(bǔ)償有關(guān)。

已證實(shí)BPA暴露導(dǎo)致小鼠染色體聯(lián)會(huì)異常[17]，干擾人類染色體準(zhǔn)確分離和DNA的修復(fù)[18]。 Hunt等[5]發(fā)現(xiàn)BPA暴露青春期雌性小鼠明顯增加卵子的非整倍體。本研究BPA 100 μg/kg的暴露可使iNOS+/+實(shí)驗(yàn)鼠和iNOS-/-實(shí)驗(yàn)鼠得到的排卵母細(xì)胞減少，但是卵細(xì)胞減少的數(shù)量與各自的對(duì)照組獲得卵細(xì)胞數(shù)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與相關(guān)報(bào)道iNOS-/-實(shí)驗(yàn)鼠的排卵未受影響相似[19-20]。本研究只有BPA 200 μg·kg-1·d-1的iNOS-/-實(shí)驗(yàn)鼠的排卵數(shù)量明顯減少，表明iNOS可能保護(hù)雌鼠在卵細(xì)胞成熟以及排卵免受BPA負(fù)面的影響。

本研究結(jié)果顯示， iNOS-/-和iNOS+/+組每窩仔鼠數(shù)量和雌雄比例水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但是BPA暴露能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)鼠排卵量下降，并且iNOS-/-組排卵量明顯低于iNOS+/+組。提示可能與iNOS基因缺失致使蛋白PLK1和蛋白R(shí)AN低表達(dá)及染色體集合失敗有關(guān)[21]。

總之，BPA暴露可導(dǎo)致小鼠排卵數(shù)量下降，并且iNOS基因缺失致使排卵下降更明顯。所以，杜絕人類使用含有BPA的日用品，對(duì)保護(hù)女性卵細(xì)胞正常發(fā)育和減少胚胎發(fā)育畸形具有重要意義；同時(shí)也可利用基因敲出技術(shù)，研究不同基因和不同環(huán)境因素影響下對(duì)哺乳類動(dòng)物卵細(xì)胞成熟發(fā)育影響過(guò)程中的具體機(jī)制。

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(本文編輯：趙麗潔)

[中圖分類號(hào)]R339.221

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]B

[文章編號(hào)]1007-3205(2016)03-0328-04

[作者簡(jiǎn)介]張金文(1960-)，男，河北景縣人，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事血管外科疾病診治研究。

[收稿日期]2015-11-18；[修回日期]2015-12-16