蔡璇（肇慶出入境檢驗檢疫局，廣東肇慶526060）

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響應(yīng)面法優(yōu)化當(dāng)歸總黃酮提取工藝研究

蔡璇
（肇慶出入境檢驗檢疫局，廣東肇慶526060）

摘要：以乙醇-水為提取劑，總黃酮提取量為考察指標(biāo)，通過醇提取法提取當(dāng)歸中的總黃酮成分。通過單因素試驗分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間、提取溫度對總黃酮提取量的影響，在此基礎(chǔ)上利用Design-Expert軟件Box-Behnken中心組合設(shè)計法設(shè)計響應(yīng)面分析料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間和提取溫度4個因素對總黃酮提取量的影響，并通過方差分析回歸建立數(shù)學(xué)模型。料液比1∶11（g/mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)70 %，提取時間2.5 h，提取溫度60℃，在此條件下，總黃酮提取量達(dá)到0.0228mg/g。結(jié)果表明：Box-Behnken設(shè)計結(jié)合響應(yīng)面分析法可以很好地對當(dāng)歸總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

關(guān)鍵詞：當(dāng)歸；黃酮；提??；響應(yīng)面法

當(dāng)歸是傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根，其化學(xué)成分主要有黃酮類、苯酚類、香豆素類、有機(jī)酸類、氨基酸類及多糖類等。當(dāng)歸的一類重要活性物質(zhì)就是黃酮類化合物，具有抑制NO生成、抗氧化和抑菌殺菌等作用[1-3]。

本文根據(jù)醇提取法，采用單因素試驗分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間、提取溫度對總黃酮提取量的影響，對當(dāng)歸中總黃酮的提取與含量測定進(jìn)行初步研究，同時選擇響應(yīng)面法優(yōu)化其最適提取方法的工藝條件，旨為進(jìn)一步開發(fā)和利用當(dāng)歸總黃酮提供理論參考。

1　材料與儀器

1.1材料

當(dāng)歸（甘肅產(chǎn)）：購于肇慶大參林藥店，粉碎后備用。

1.2儀器與試劑

UV/VIS 916型分光光度計：澳大利亞GBC；FY135中草藥粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；SB25-120超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；HH-S2系列恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；DHG-907013數(shù)顯電熱恒溫干燥箱：上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

蘆丁對照品：中國藥品生物制品檢定所提供，批號：100080-200707；其它試劑均為分析純；試驗用水為雙蒸水。

1.3方法

1.3.1當(dāng)歸中類黃酮物質(zhì)的提取與樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取當(dāng)歸2 g置于100 mL圓底燒瓶中，以一定的料液比加入乙醇-水溶液進(jìn)行回流提取，共進(jìn)行3次提取后，合并3次提取液，過濾后收集濾液為樣品溶液。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg置于50 mL量瓶中，加60 %乙醇水溶液溶解，定容即得。

精密移取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6 mL分別置于10 mL容量瓶中，各加入60%乙醇溶液至5mL，加入5%的亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置6 min，加入10 %硝酸鋁溶液0.3 mL，再放置6 min，加入1.0 mol/L氫氧化鈉溶液4.0 mL，加蒸餾水定容至刻度。于分光光度計上在λ= 508.73 nm處測定其吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，黃酮含量ρ為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3當(dāng)歸總黃酮含量的測定

準(zhǔn)確吸取樣品溶液適量，按照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法測定吸光度，根據(jù)回歸方程計算質(zhì)量濃度（C），再根據(jù)質(zhì)量濃度計算出當(dāng)歸中黃酮的提取量[8]。

當(dāng)歸總黃酮提取量/（mg/g）=樣品中總黃酮含量（mg）×乙醇體積（mL）/樣液體積（mL）×稱取藥材粉末質(zhì)量（g）

1.3.4當(dāng)歸總黃酮提取條件的優(yōu)化方法

選取料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、溫度4個可能影響提取效果的因素做單因素試驗，以確定相關(guān)因素對當(dāng)歸提取物中總黃酮含量的影響，為響應(yīng)面試驗提供各因素的取值范圍，利用響應(yīng)面的試驗結(jié)果確定當(dāng)歸總黃酮的最佳提取條件。

1.3.5當(dāng)歸總黃酮提取響應(yīng)面法優(yōu)化分析

本試驗采用Design-Expert 7軟件中的Box-Behnken設(shè)計原理設(shè)計響應(yīng)面試驗。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間和提取溫度4個因素作為試驗因素，以黃酮提取量為響應(yīng)值設(shè)計試驗。試驗因素及水平見表1。

2　結(jié)果與討論

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及回歸方程

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

表1當(dāng)歸Box-Behnken的中心組合因素水平表Table 1 The level of the central composition of Angelica sinensis Box-Behnken

圖1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Rutin standard curve

并進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=11.994ρ+0.029 8，其中A為吸光度，ρ為蘆丁溶液濃度；r2=0.999 9，結(jié)果顯示，蘆丁在0.024 g/L～0.052 g/L內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2單因素試驗結(jié)果

2.2.1料液比對總黃酮提取量的影響

料液比對總黃酮提取量的影響見圖2。

圖2料液比對總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of material liquid ratio on total flavonoids extraction

從圖2可知，在一定范圍內(nèi)，藥材的黃酮提取量隨料液比的增大而呈上升趨勢，但料液比增大到一定程度后，黃酮提取量逐漸趨于飽和。當(dāng)歸在料液比為1∶13（g/mL）時總黃酮提取量達(dá)到最大，故料液比選擇1∶11、1∶13、1∶15（g/mL）進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化。

2.2.2乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取量的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取量的影響見圖3。

圖3乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on total flavonoids extraction

由圖3可知，藥材的總黃酮提取量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而逐漸增大，當(dāng)達(dá)到一定峰值時，黃酮的提取量反而下降。這種現(xiàn)象可能是由于脂溶性雜質(zhì)增多，與黃酮類化合物競爭和乙醇結(jié)合，從而導(dǎo)致黃酮類化合物提取率下降。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60 %時總黃酮提取量達(dá)到峰值，故選擇50 %、60 %和70 %進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化。

2.2.3提取時間對總黃酮提取量的影響

提取時間對總黃酮提取量的影響見圖4。

圖4提取時間對總黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of extraction time fraction on total flavonoids extraction

由圖4可以看出，藥材的黃酮提取量在一定范圍內(nèi)，隨提取時間的延長而有所增大，但當(dāng)延長到一定時間后黃酮的提取量反而下降，可能是由于提取時間過長，黃酮物質(zhì)被破壞，導(dǎo)致提取量下降。從圖可知，提取時間為2 h時，總黃酮提取量達(dá)到最大，故選擇1.5、2 h和2.5 h進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化。

2.2.4提取溫度對總黃酮提取量的影響

提取溫度對總黃酮提取量的影響見圖5。

圖5提取溫度對總黃酮提取量的影響Fig.5 Effect of temperature on total flavonoids extraction

由圖5可以看出，藥材的黃酮提取量隨溫度的提高而有所上升，但當(dāng)溫度到達(dá)一定時，黃酮的提取量會有所下降，可能是溫度過高，黃酮物質(zhì)的穩(wěn)定性受到一定影響，且雜質(zhì)的溶出量也會增加，導(dǎo)致提取量下降。當(dāng)提取溫度為50℃時，總黃酮提取量達(dá)到最大，故選擇40、50℃和60℃進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化。

2.3當(dāng)歸總黃酮水浴法提取條件的優(yōu)化

2.3.1數(shù)學(xué)模型的建立

本試驗Box-Behnken中心組合設(shè)計的試驗方案和結(jié)果見表2，其中1～24為析因試驗，24～29為中心試驗。

表2當(dāng)歸Box-Behnken中心組合設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 The central composite design scheme and results of Angelica sinensis Box-Behnken

采用響應(yīng)面分析法分析試驗結(jié)果，得以總黃酮提取量為響應(yīng)值的回歸方程為：

y/（mg/g）=0.016-7.908×10-4A+8.484×10-4B+4.267× 10-4C+1.732×10-3D-1.087×10-3AB-4.72×10-4AC+6.495× 10-4AD-1.223×10-3BC+4.139×10-4BD+2.651×10-3CD+ 2.297×10-4A2-3.321×10-4B2+1.921×10-3C2-7.648×10-4D2

式中：y為總黃酮提取量，A為料液比，B為乙醇體積分?jǐn)?shù)，C為提取時間，D為提取溫度。

2.3.2單因素試驗結(jié)果數(shù)學(xué)模擬

運用軟件對表2中的29個響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析，得到方差分析表，見表3。

表3當(dāng)歸黃酮提取回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of the extraction of the flavonoids from Angelica sinensis

從表3可知，以總黃酮提取量為響應(yīng)值時，模型P 為0.479 2>0.05，表明該二次方程模型不顯著，失擬項F值為0.006 0<0.01，回歸模型不能較好的描述各因素與響應(yīng)值之間的真實關(guān)系。各因素及其交互因素、二次項的P值均大于0.05，表明4個提取因素在進(jìn)行總黃酮提取量優(yōu)選時沒有優(yōu)選到最佳條件，需進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化。

2.3.3響應(yīng)面法優(yōu)化當(dāng)歸總黃酮水浴法提取條件

采用Design-Expert 7軟件分析當(dāng)歸提取總黃酮中各因素兩兩交互作用對總黃酮提取率影響繪制響應(yīng)曲面圖，見圖6，得到從當(dāng)歸中提取總黃酮的最佳工藝條件為料液比1∶11（g/mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)70 %，提取時間2.5 h，提取溫度60℃。

圖6當(dāng)歸各因素兩兩交互作用對總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface map of the effect of the interaction between the two two elements and the extraction rate of total flavonoids

2.4驗證試驗

在響應(yīng)面優(yōu)化后的最佳條件下，即當(dāng)歸在料液比1∶11（g/mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)70 %，提取時間2.5 h，提取溫度60℃條件下，進(jìn)行3次平行試驗，總黃酮平均提取量達(dá)到0.021 7 mg/g，RSD為2.21 %，模型對其總黃酮提取量的預(yù)測值為0.022 8 mg/g，真實值與預(yù)測值的誤差為-4.94 %。

4　結(jié)論

通過單因素試驗分別考察料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、提取溫度對當(dāng)歸總黃酮提取量的影響，在此基礎(chǔ)上，采用Design-Expert軟件的Box-Behnken中心組合設(shè)計方法設(shè)計響應(yīng)面試驗，建立數(shù)學(xué)模型，得到了較優(yōu)的提取工藝條件，并結(jié)合響應(yīng)面分析得到的數(shù)學(xué)模型，預(yù)測更優(yōu)的工藝條件，在進(jìn)行驗證試驗后，得到總黃酮最佳提取工藝條件。

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Optimization of Extraction Process of Total Flavonoids from Angelica Sinensis by Response Surface Method

CAI Xuan
（Zhaoqing Entry-exit Inspection and Quarantine，Zhaoqing 526060，Guangdong，China）

Abstract：Using ethanol- water as extracting agent，total flavonoids extraction amount as the indexes，through the ethanol extraction method to extract from Angelica sinensis total flavonoids. The effects of ethanol volume fraction，ratio of material to liquid，extraction time and extraction temperature were investigated by single factor experiment. The Design-Expert software Box-Behnken center combination design method was used to design response surface analysis. The statistical analysis and mathematical modeling were also applied for analysis the data. The results showed that the optimal extraction parameters would be the material liquid ratio of 1∶11（g/mL），ethanol volume fraction of 70 %，extraction time of 2.5 h，and extraction temperature of 60℃. Under these conditions，totalflavonoidsextractionamount reached 0.022 8 mg/g. Box-Behnken design combined with response surfaceanalysismethod can be used to optimize the extraction processof total flavonoidsfrom Angelica sinensis.

Key words：Angelica sinensis；flavonoids；extraction；response surface method

作者簡介：蔡璇（1979—），女（漢），工程師，碩士，研究方向：商品理化分析。

基金項目：廣東省肇慶市科技創(chuàng)新計劃項目（2014G110）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.026