孫麗偉，江文靜，厲以強，孫洪芹，郭艷敏，杜陽，呂錫武

(1.東南大學(xué)能源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210018；2.江蘇省環(huán)境監(jiān)測中心，江蘇 南京 210036)

·環(huán)境預(yù)警·

利用MALDI-TOF MS技術(shù)簡便、快速檢測水華藍藻的方法研究

孫麗偉1，江文靜1，厲以強2，孫洪芹1，郭艷敏1，杜陽1，呂錫武1

(1.東南大學(xué)能源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210018；2.江蘇省環(huán)境監(jiān)測中心，江蘇 南京 210036)

以水華藍藻為研究對象，用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)對其進行測定分析并獲得了蛋白質(zhì)指紋圖譜。對銅綠微囊藻標(biāo)準(zhǔn)株(NIES-843)樣品通過3種前處理方法得到的質(zhì)譜圖進行對比，確定了質(zhì)譜分析的樣品前處理方法，建立了利用MALDI-TOF MS技術(shù)簡便、快速檢測水華藍藻的方法。對在水華中出現(xiàn)的4種不同藍藻進行MALDI-TOF MS分析，結(jié)果表明各種藍藻具有其特征性波譜，可據(jù)此對水華藍藻進行區(qū)分和鑒定。該方法快速、簡便、精確、可程序化，具有廣泛的應(yīng)用前景。

MALDI-TOF MS；水華藍藻；質(zhì)量指紋圖譜；快速檢測

我國水體富營養(yǎng)化日益嚴重，據(jù)環(huán)境保護部2015年環(huán)境狀況公告，全國大部分淡水湖泊、水庫均處于輕度或中度富營養(yǎng)化狀態(tài)。2007年太湖大面積暴發(fā)藍藻導(dǎo)致無錫市飲用水受污染的事件，造成了嚴重影響[1]。針對這一現(xiàn)狀，必須對發(fā)生水華的水體進行即時監(jiān)測，作出預(yù)警并制定有效的治理手段。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的富營養(yǎng)化水體水華監(jiān)測指南[2]，對藍藻的監(jiān)測是整個監(jiān)測程序的基本和中心要點。目前對藍藻水華的監(jiān)測方法主要包括遙感自動解譯技術(shù)[3]、熒光定量PCR技術(shù)[4]、浮游植物半定量活檢法[5]、16S rDNA寡核苷酸探針[6]等，但這些方法需要具備專業(yè)知識的人員才可實行，耗時數(shù)日，且精確性不夠。

針對上述方法的不足，將質(zhì)譜分析方法引入藍藻鑒定領(lǐng)域，即利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)對藍藻細胞進行直接測定。根據(jù)測定得到的特征波譜，以構(gòu)成細胞成分的多酯類或蛋白質(zhì)作為生物標(biāo)志物(Biomarker)，對微生物進行鑒定[7-8]。該法測定微生物主要利用核糖體蛋白為生物標(biāo)志物[9]，反映了分子進化過程和親緣關(guān)系，是物種分類的有力指標(biāo)。迄今為止，MALDI-TOF MS方法已在迅速、準(zhǔn)確識別細菌方面得到應(yīng)用，如鑒定乳酸菌、食源性酵母菌[10-11]和抗藥性黃色葡萄球菌[12]等。探索測定藍藻細胞的最佳前處理和測定條件，開發(fā)簡便、快速、精確地鑒定水華藍藻的新方法，并實現(xiàn)種、屬水平上對藍藻的鑒定，有助于為今后在更高水平的鑒定和在實際樣品中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藻株信息

本研究所用的測試藻株為構(gòu)成水華的優(yōu)勢藍藻種類，分別為微小平裂藻(MerismopediatenuissimaLemmermann，NIES-230)，爬行顫藻(OscillatoriaanimalisAgardhexGomont，NIES-206)，近親魚腥藻(AnabaenaaffinisLemmermann，NIES-1639)，銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa，NIES-843)。藻種來自日本國立環(huán)境研究所微生物保存庫。

菌株在MA培養(yǎng)基中[13]，以光暗比為12 h∶12 h的循環(huán)周期、光照密度為15 μmol /(m2·s)及溫度為20 ℃的條件培養(yǎng)4周。其中典型株 NIES-843被用于表征核糖體蛋白和優(yōu)化樣品前處理方法的研究。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 儀器

(1)高速冷凍離心機A(德國SIGMA 3-18K型)，(2)高速冷凍離心機B(美國Beckman Allegra 64R型)，(3)細胞破碎儀(Mini Bead-Beater，Biospec products 公司產(chǎn)品)，(4)質(zhì)譜儀(日本島津公司Axima CFR Plus型)。

1.2.2 試劑

(1)TMA-1緩沖液：含10 mmol/L的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(pH值=7.8)，30 mmol/L的氯化銨，10 mmol/L 的氯化鎂，以及 6 mmol/L的2-巰基乙醇；(2)含芥子酸基質(zhì)20 000 mg/L混合液：含50%乙腈和1%三氟乙酸。

1.3 3種不同的樣品前處理制備方法

1.3.1 完整細胞樣品的制備

由于銅綠微囊藻細胞中有上浮氣泡，所以首先運用輕微的超聲波法進行氣泡的破除處理。然后將細胞培養(yǎng)液置于15 mL的離心管中，在9 100 g強度下用離心機A離心10 min，棄上清液，將管底沉淀物移入1.5 mL離心管中，再次在20 400 g強度下離心10 min，分離后得到細胞沉淀物。將其再溶于10 μL的含芥子酸基質(zhì)混合液中，用于MALDI-TOF MS測定。

1.3.2 細胞溶解物樣品的制備

將細胞沉淀物(上一步收集到的濕重約20～40 mg的細胞)溶于160 μL TMA-1緩沖液中，然后移入含有160 mg氧化鋯-二氧化硅微粒(直徑1 μm)的管中，在細胞破碎儀中，以3 000 r/min破碎1 min。然后將上述細胞碎片和微粒的混合物用離心機A在5 800 g強度下離心25 min，收集上清液中的細胞溶解物并溶于10 μL的含芥子酸基質(zhì)混合液中，用于MALDI-TOF MS測定。

1.3.3 核糖體蛋白組分濃縮樣品的制備

將上一步中制備的細胞溶解液添加TMA-1緩沖液至最終體積為250 μL，用離心機B在 64 397 g強度下離心4 h。在離心管底部的沉淀物即為濃縮的核糖體蛋白組分，再將其溶于10 μL的含芥子酸基質(zhì)混合液中，用于MALDI-TOF MS測定。

1.4 MALDI-TOF MS法測定

將2 μL上清液樣品與基質(zhì)混合液滴于專用樣品板上，在室溫下自然晾干。儀器測定參數(shù)：采集質(zhì)核比(m/z)為2 000～40 000；激光點擊數(shù)500；采用N2為激光源(λ=337 nm，脈沖延長時間為3 ns，頻率10 Hz)；測定模式為陽離子線性模式。MALDI-TOF MS的詳細機理及使用方法見文獻[14-15]。

2 結(jié)果和討論

2.1 3種不同的前處理方法比較

圖1(a)(b)(c)是通過上述3種不同前處理方法得到的樣品質(zhì)譜圖。

圖1 3種樣品前處理方法質(zhì)譜圖

方法(a)和(b)幾乎沒有觀察到有效峰值[即圖1(c)所標(biāo)識的核糖體蛋白峰，下述2.2將會具體解釋]，而利用方法(c)得到的質(zhì)譜圖中，則觀察到了清晰有效的核糖體蛋白峰。其原因可能是銅綠微囊藻有一層獨特的細胞壁，內(nèi)外膜間有相對較厚的肽聚糖層以及膜外多糖纖維涂層[16]，這可以阻止細胞內(nèi)物質(zhì)的釋放，使核糖體蛋白組分的有效電離變得困難。另一原因可能是，相比于細菌，銅綠微囊藻生長速度較慢(倍增時間長)，在細胞溶解樣品中細胞體內(nèi)核糖體蛋白的濃度非常低，這導(dǎo)致了難以有效地檢測到核糖體蛋白。

研究通過濃縮原始核糖體蛋白而成功地檢測到核糖體蛋白峰，表明細胞破碎和離心分離這2步預(yù)處理對于從銅綠微囊藻細胞中觀察和識別核糖體蛋白是非常有效且成功的前處理方法，符合簡單、低成本(時間和人力)的要求。

2.2 NIES-843株的核糖體蛋白特征峰值的鑒定

NIES-843的完整基因組已被成功測序，其核糖體蛋白的氨基酸序列可以從公共的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索到(UniProtKB： http：//www.uniprot.org/)，每種核糖體蛋白的理論分子質(zhì)量可以通過序列的等電點和分子質(zhì)量工具計算得到(http：//www.expasy.org/compute_pi/)。從NIES-843 株檢測到的峰值，經(jīng)與計算值相比較，則可被鑒定為核糖體蛋白。

表1顯示的是NIES-843株通過前處理方法(c)得到的質(zhì)譜圖，檢測到的峰所對應(yīng)的m/z的值與核糖體蛋白的[M+H]+的計算峰值進行比較，結(jié)果有8個核糖體蛋白被鑒定，已在圖1(c)中被標(biāo)識出(有效的特征核糖體蛋白峰)。在之前的研究中，植物乳酸菌NCIMB 8826中的42種核糖體蛋白已經(jīng)通過MALDI-TOF MS測定成功地被表征出，這表明核糖體蛋白作為生物標(biāo)識物用于MALDI-TOF MS法鑒別藍藻是可行的。

表1 來自Microcystis aeruginosa(NIES-843)株的核糖體蛋白質(zhì)特征峰值的鑒定

續(xù)表

2.3 利用MALDI-TOF MS方法鑒別4種不同種屬的藍藻

圖2(a)(b)(c)(d)顯示的是4種藍藻藻株NIES-1639、NIES-230、NIES-206和NIES-843經(jīng)前處理方法(c)后用MALDI-TOF MS得到的m/z在6 000～10 000之間的質(zhì)譜圖。在此區(qū)間內(nèi)，各菌株分別有6～13個不同m/z值的離子峰。NIES-1639的特征離子峰主要分布在 6 500～9 500 之間，NIES-206的離子峰從 6 000開始，而NIES-843與其他3種相比，各峰的強度都較大。

因此，直接比對質(zhì)譜圖很容易發(fā)現(xiàn)不同藍藻菌株間的差異，藍藻門下的上述4種不同種屬的菌株間都沒有發(fā)現(xiàn)共同離子峰。而且，每種藍藻都顯示出具有本身特有的峰值組合，具備自身的特征“指紋”，根據(jù)測定得到的質(zhì)譜波譜，可以鑒別不同種屬的藍藻。

圖2 4種藍藻藻株質(zhì)譜圖

3 結(jié)語

利用MALDI-TOF MS測定藍藻細胞，將質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用到藍藻的鑒定，在環(huán)境科學(xué)研究領(lǐng)域內(nèi)具有一定的創(chuàng)新性。對來自國內(nèi)外藻種保存庫的標(biāo)準(zhǔn)藍藻進行測定，建立不同種屬藍藻的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。相對于傳統(tǒng)的藍藻檢測方法，該方法具有以下明顯優(yōu)勢：(1)快速簡便，被測樣品無須進行復(fù)雜的前處理和成分提取，從樣品準(zhǔn)備到測定完成，僅需要不超過10 min的時間；(2)鑒定精確，引進新的生物標(biāo)識物——核糖體蛋白質(zhì)的概念，藍藻細胞中約有55個核糖體蛋白質(zhì)的氨基酸序列可作為分類指標(biāo)，和16S rRNA方法中只有單個基因序列作為分類指標(biāo)相比，更加精確，可以實現(xiàn)在更高水平上對藍藻的種類進行鑒定；(3)測定過程程序化，方法中只包括樣品和基質(zhì)混合、加載樣品、質(zhì)譜儀測定3個基本步驟，可以實現(xiàn)操作程序化進而進行批量化測定。

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Method Investigation on Simple and Rapid Identification of Cyanobacteria Bloom by MALDI-TOF MS

SUN Li-wei1， JIANG Wen-jing1， LI Yi-qiang2， SUN Hong-qin1， GUO Yan-min1， DU Yang1， LV Xi-wu1

(1.SchoolofEnergyandEnvironment，SoutheastUniversity，Nanjing，Jiangsu210018，China；2.JiangsuEnvironmentalMonitoringCenter，Nanjing，Jiangsu210036，China)

Based on matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)， protein fingerprint spectrometry of cyanobacteria bloom were obtained. By comparison of three different pretreatment processes for Microcystisaeruginosa (NIES-843) samples， sample pretreatment for mass analysis was established， meanwhilea simple and rapid analysis method used MALDI-TOF MS for cyanobacteria bloom was developed and optimized. The results showed that there were characteristic spectra foreach strain of cyanobacteria and this method could be used to distinguish and identify different species of cyanobacteria. This analytical method was demonstrated to be simple， rapid， accurate and programmable， therefore， had the potential to be widely applicable in the field.

MALDI-TOF MS； Cyanobacteria bloom；Mass spectrum fingerprint； Rapid determination

2015-11-17；

2016-01-19

江蘇省環(huán)境監(jiān)測科研基金資助項目(1411)

孫麗偉(1964—)，女，副教授，博士，從事環(huán)境科學(xué)與工程研究工作。

X835

B

1674-6732(2016)04-0009-04