陳俊錕，王力軍，沈 奇，郭鳳根，王仙萍，田世剛

（1．貴州省油菜研究所，貴州貴陽550008；2．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料所芝麻與特色油料研究室，湖北武漢430062；3．云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201）

基于ISSR標(biāo)記的10份紫蘇種質(zhì)資源的遺傳多樣性評價

陳俊錕1，王力軍2，沈 奇1，郭鳳根3＊，王仙萍1，田世剛1

（1．貴州省油菜研究所，貴州貴陽550008；2．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料所芝麻與特色油料研究室，湖北武漢430062；3．云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201）

為紫蘇屬植物的種群結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性和進化分類系統(tǒng)研究及種質(zhì)資源的保護與開發(fā)利用提供依據(jù)，筆者采用ISSR標(biāo)記對表型鑒選的10份具有典型植物學(xué)性狀、來源于不同生態(tài)區(qū)域的紫蘇屬植物種系分類進行研究。結(jié)果表明：采用ISSR引物進行擴增共獲得多態(tài)性條帶266個，平均多態(tài)性比率為56．74%。10份材料間遺傳距離為0．690 4～0．975 6，遺傳一致度為0．024 7～0．370 4。10份紫蘇種質(zhì)資源可分為2大類群，每個類群包括2個變種。

紫蘇屬植物；ISSR標(biāo)記；遺傳距離；聚類分析；進化分類

紫蘇（Perilla frutescens）又名蘇子、蘇麻、引子和荏，為唇形科（Labiatae）紫蘇屬（Perilla）1年生草本植物［1－2］。紫蘇是我國傳統(tǒng)的藥食兼用型植物，在醫(yī)藥、食品及保健等領(lǐng)域具有廣泛用途［3］。目前，國內(nèi)外學(xué)者對紫蘇屬植物分類系統(tǒng)上仍存在爭議。《中國植物志》將紫蘇屬植物定義為1種3變種，其中，紫蘇〔P．frutescens var．frutescens（L．）〕為原變種，紫蘇與白蘇的變異是因栽培而起，差別細微，應(yīng)將二者合并；其他3個變種為野生紫蘇（P．frutescens var．a(chǎn)cuta），耳齒變種（P．frutescens var．a(chǎn)uriculato－dentata）和回回蘇（P．frutescens var．crispa）［4］。劉月秀等［5－6］通過植物學(xué)性狀及核型分析將我國紫蘇屬植物鑒定為4個變種，將白蘇與紫蘇區(qū)分為2個不同的變種，即白蘇（P．frutescens var．frutescens）、紫蘇（P．frutescens var．frutescens）、回回蘇（P．frutescens var．crispa）和野生紫蘇（P．frutescens var．purpurascens）。郭鳳根等［7－10］運用同工酶電泳及45SrDNA FISH、ISSR標(biāo)記對云南境內(nèi)紫蘇進行研究，提出將其劃分為5個變種的說法，分別為野生紫蘇變種（P．frutescens var．purpurascens）、耳齒紫蘇變種（P．frutescens var．a(chǎn)uriculato－dentata）、白蘇變種（P．frutescens var．frutescens）、回回蘇變種（P．frutescens var．crispa）和紫蘇變種（P．frutescens var．a(chǎn)rguta）。胡彥［11］對我國34份紫蘇種質(zhì)資源的植物學(xué)形態(tài)及花粉粒形態(tài)進行觀察，支持紫蘇屬植物分為5個變種的劃分方法。Lee J K等［1］利用AFLP標(biāo)記鑒定東亞60份紫蘇種質(zhì)的遺傳關(guān)系認(rèn)為，紫蘇植物可分為（P．frutescens var．frutescens Britt．）（油用）及（P．frutescens var．crispaDecaisne）（藥用及菜用）2大類群，其分別具有近源的野生種。Nitta M等［2－3］采用RAPD標(biāo)記鑒定來源于韓國、日本、尼泊爾和越南等地的紫蘇；Park Y J等［12］采用SSR標(biāo)記鑒定來源于韓國及日本的104份紫蘇種質(zhì)資源，Lee M C等［13］用SCAR標(biāo)記鑒定紫蘇類群的多態(tài)性。但目前為止，紫蘇屬植物的分類系統(tǒng)仍無明確結(jié)論。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基于分子標(biāo)記的基因分型技術(shù)已作為重要的研究手段廣泛應(yīng)用于植物分類及遺傳多樣性鑒定［14－15］。當(dāng)前，分子標(biāo)記類型已經(jīng)發(fā)展到數(shù)十種，在重要物種中，已獲得大量可靠及穩(wěn)定的標(biāo)記，對植物進化、鑒選及育種等研究起到較大的推動作用［16－19］。對于紫蘇屬植物而言，涉及的標(biāo)記類型較為狹窄，目前僅有AFLP、RAPD、SSR、ISSR 和SCAR等幾類傳統(tǒng)的標(biāo)記類型運用于紫蘇研究，且涉及標(biāo)記數(shù)量較少，遠不能滿足目前研究及應(yīng)用的需要［8，20－21］。紫蘇分子標(biāo)記的開發(fā)仍是分類鑒定中亟需解決的關(guān)鍵問題［20－21］。ISSR（inter－simple sequence repeat）標(biāo)記是1994年由加拿大哥倫比亞大學(xué)大學(xué)提出的標(biāo)記類型。該標(biāo)記實驗操作簡單，遺傳多態(tài)性高，重復(fù)性好，目前已廣泛使用于植物進化，分類和遺傳多樣性研究［15］。筆者采用ISSR標(biāo)記對通過表型鑒選的10份具有典型植物學(xué)性狀并來源不同生態(tài)區(qū)域紫蘇屬植物種質(zhì)進行分類研究，以期為紫蘇屬植物的種群結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性和進化分類系統(tǒng)研究及種質(zhì)資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1材料與方法

1．1供試材料

1．1．1紫蘇種質(zhì)10份紫蘇種質(zhì)資源由貴州省油菜研究所提供，包括貴州5份，日本1份，湖南1份，湖北2份，黑龍江1份。該供試材料為貴州省油菜研究所2010—2013年收集到的200余份紫蘇種質(zhì)資源，經(jīng)過2年田間種植及性狀調(diào)查，從中挑選出的具有典型植物學(xué)性狀且來源于不同生態(tài)區(qū)域的材料。

1．1．2ISSR引物 供試的27條ISSR引物來源于加拿大哥倫比亞大學(xué)Ziekiewicz設(shè)計并公布的ISSR引物序列。

1．1．3試劑dNTPs、MgCl2、Taq DNA聚合酶等購自上海生工生物工程公司。

1．2試驗方法

1．2．1紫蘇植物學(xué)性狀調(diào)查 供試紫蘇種質(zhì)資源于2013年3月播種于貴州省油菜研究所試驗田，5月上旬按行窩距50cm×30cm移栽定植，正常水肥管理。參照文獻［22］的方法并根據(jù)田間觀察需要對紫蘇種質(zhì)資源植物學(xué)性狀進行調(diào)查。調(diào)查按照苗期葉色（分正面、背面、葉脈、心葉及莖色分別記載），現(xiàn)序期性狀（按形狀、大小、絨毛、鋸齒、褶皺、耳齒及苞葉分別記載），花色性狀（按花冠及雄蕊顏色分別記載），種子性狀（按顏色及大小記載）進行記載。

1．2．2紫蘇DNA的提取 采用CTAB法提取材料DNA。

1．2．3ISSR－PCR擴增體系及電泳 根據(jù)加拿大Ziekiewicz報道ISSR引物序列，并參照文獻［15，23－24］報道的在唇形科中主要使用的ISSR引物合成引物對10份紫蘇種質(zhì)資源進行擴增。ISSR反應(yīng)體系為（10μL）：1μL 10×buffer，0．4μL dNTP Mixture（10mM），2μL Primer（10μM），0．1μL Taq（5U／μL），1μg DNA模板，ddH2O補足10μL。擴增條件：94℃3min；94℃30s；引物最適退火溫度30s；72℃60s；步驟2～4進行38個循環(huán)擴增；72℃7min。擴增產(chǎn)物取2μL進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。

1．2．4紫蘇種質(zhì)資源的聚類分析 利用NTSYS－pc（2．1）對所獲得的原始數(shù)據(jù)矩陣進行處將原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化（STD）后，計算紫蘇種質(zhì)資源及各居群間的歐氏距離數(shù)理（Euclidean distance），采用非加權(quán)組平均法（UPGMA）進行Q型種質(zhì)聚類，繪制聚類圖。

1．3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

根據(jù)ISSR擴增條帶有無分別以1和0表示，構(gòu)成原始數(shù)據(jù)矩陣。用POPGENE計算不同地區(qū)的遺傳多樣性指數(shù)等指標(biāo)，分析不同材料之間Nei’s遺傳距離和遺傳一致度。

2結(jié)果與分析

2．1紫蘇種質(zhì)資源的植物學(xué)性狀

從表1可知，10份紫蘇種質(zhì)資源材料的植物學(xué)性狀存在差異。其中，Pf2及Pf9的葉色全紫，Pf8為全綠，其余均為正綠背紫。葉形包括卵圓、心形及不規(guī)則形。葉片大小及絨毛均有差異。2份材料（Pf8及Pf9）呈現(xiàn)較深的鋸齒和褶皺，其余較平滑。Pf3及Pf5呈現(xiàn)顯著的苞葉?；ㄉ托廴镱伾謩e呈現(xiàn)白、粉紅和紫紅。種子顏色分別呈現(xiàn)灰白、褐、紅褐和灰褐。種子大小也呈現(xiàn)較大差異。表明，10份材料是具有紫蘇典型植物學(xué)性狀代表的材料，并覆蓋不同生態(tài)區(qū)域，具有較強代表性，可用作ISSR引物篩選和紫蘇分類鑒定。

2．2ISSR標(biāo)記引物擴增及多態(tài)性

從表2可知，經(jīng)ISSR標(biāo)記引物擴增共篩選出27對多態(tài)性強、重復(fù)性好的引物用于10份紫蘇代表性材料進行PCR擴增。2 7對ISSR引物在供試10份材料中共獲得擴增條帶496條。其中，具有多態(tài)性條帶共266條，平均每條引物獲得多態(tài)性條帶9．48條，平均多態(tài)性比率為56．74%。

表1 10份紫蘇種質(zhì)資源的植物學(xué)性狀Table 1 The botanical characters of the 10 Perillagermplasm resources

表2 10份紫蘇屬植物的ISSR標(biāo)記引物及擴增多態(tài)性Table 2 ISSR primer and amplification polymorphism

2．3紫蘇的遺傳多樣性

從表3可知，10份紫蘇種質(zhì)資源的遺傳距離為0．690 4～0．975 6，平均遺傳距離為0．848 5；遺傳一致度為0．024 7～0．370 4，平均遺傳距離為0．170 6。親緣關(guān)系最遠的是Pf2與Pf9號材料，其遺傳距離數(shù)值最大，為0．975 6，遺傳一致度數(shù)值最小，為0．024 7。親緣關(guān)系最近的是Pf2與Pf4號材料，其遺傳距離數(shù)值最小，為0．690 4，遺傳一致度數(shù)值最大，為0．370 4。

表3 10份紫蘇種質(zhì)資源遺傳一致度及遺傳距離Table 3 Genetic distance（below diagonal）and genetic coherence（above diagonal）of the 10 Perillagermplasm resources

圖1 10份紫蘇種質(zhì)資源的聚類Fig．1 Cluster analysis chart of the 10 Perilla germplasm resources

2．4紫蘇種質(zhì)資源的聚類

從圖1可知，利用UPGMA法構(gòu)建10份紫蘇種質(zhì)資源的遺傳關(guān)系聚類圖，其遺傳相似性在0．55水平上，10份紫蘇種質(zhì)資源可分為2個類群；在遺傳距離0．68水平上，2個類群又可分別分為2組。其中，I－1主要性狀為株高較高，葉片較大，莖葉絨毛重，香氣淡，葉片兩面綠或正綠背紫，種子大，以油用型紫蘇為主。I－2主要性狀為植株較矮，葉片較小，分枝及葉多，香味濃郁，葉片兩面紫或正綠背紫，葉脈紫，種子小，小堅果堅硬，以藥用食用紫蘇為主。II－1植株較矮，性狀表現(xiàn)：1）心葉心型或不規(guī)則，果萼苞葉大；2）為葉正綠背深紫色，葉脈深紫色。二者的共同特點為種子大，小堅果較脆；植株抗性差，病害重；多作油用型紫蘇，但產(chǎn)量及抗性等性狀需要改良。II－2性狀為葉片邊緣具狹而深的鋸齒，葉型不規(guī)則，表面多有皺折，葉兩面皆綠或紫，種子小，小堅果堅硬，多做藥用食用類紫蘇。

2．5紫蘇種系的分類

根據(jù)10份紫蘇種質(zhì)資源的植物學(xué)特征及分子標(biāo)記聚類結(jié)果對其種系分類（各變種）歸納如下：紫蘇屬植物可分為2大類群。但根據(jù)分子標(biāo)記聚類結(jié)果應(yīng)對該類群劃分進行相應(yīng)調(diào)整。第1類群包括紫蘇原變種（P．frutescens var．frutescens）及紫蘇變種（P．frutescens var．purpurascens）；第2類群包括野生紫蘇變種（P．frutescens var．a(chǎn)rguta）及回回蘇變種〔P．frutescens（L．）Britt．var．crispa〕（圖2）。

圖2 紫蘇屬植物代表性小種照片F(xiàn)ig．2 Photos of representative species of Perilla plants

3結(jié)論與討論

采用27對ISSR標(biāo)記對供試材料進行擴增共獲得多態(tài)性條帶266條。表明，ISSR標(biāo)記在紫蘇屬植物中遺傳多態(tài)性高，重復(fù)性好，是一類較好的可應(yīng)用于紫蘇屬植物分型研究的標(biāo)記類型。對紫蘇的ISSR分子標(biāo)記可為紫蘇屬植物材料的分類研究提供可應(yīng)用的分子標(biāo)記。

筆者收集貴州省及國內(nèi)外紫蘇種質(zhì)資源200余份，根據(jù)其植物學(xué)特征鑒選10份代表性材料進行ISSR擴增，并結(jié)合中國植物志及國內(nèi)學(xué)者對變種劃分的結(jié)果與Lee J K等［1］的結(jié)果相似，即紫蘇屬植物可分為2大類群，2大類群分別包含2個變種。種間親緣關(guān)系標(biāo)記聚類結(jié)果，第1類群包括紫蘇原變種（P．frutescens var．frutescens）及紫蘇變種（P．frutescens var．purpurascens）；第2類群包括野生紫蘇變種（P．frutescens var．a(chǎn)rguta）及回回蘇變種〔P．frutescens（L．）Britt．var．crispa〕。這與國際上報道的對紫蘇類群中栽培種（紫蘇原變種）及野生種（回回蘇）的定義較為相似。

根據(jù)ISSR聚類研究結(jié)果將貴州地區(qū)紫蘇資源歸于I類，而其他地區(qū)紫蘇資源歸于II類，體現(xiàn)了資源地域性的差異。該結(jié)果可能與供試樣品的人為選擇及數(shù)量不足有關(guān)，有待通過已發(fā)展的標(biāo)記對更多資源進行鑒定獲得更全面的結(jié)果。但就目前的研究結(jié)果看，貴州地區(qū)分布資源主要以I類為主，尤其在油用紫蘇資源方面，貴州地區(qū)資源具有植株高大，豐產(chǎn)性好，含油量高及抗性強等優(yōu)良性狀。研究結(jié)果對貴州紫蘇在紫蘇屬植物的進化地位評價及資源綜合開發(fā)利用方面具有指導(dǎo)意義。

［1］LEE J K，OHNISHI O．Genetic relationships among cultivated types of Perillafrutescens and their weedy types in East Asia revealed by AFLP markers［J］．Genetic Resources and Crop Evolution，2003，50：65－74．

［2］NITTA M，LEE J K，KOBAYASHI H，et al．Diversification of multipurpose plant Perilla frutescens［J］．Genetic Resources and Crop Evolution，2005，52：663－670．

［3］譚美蓮，嚴(yán)明芳，汪 磊，等．國內(nèi)外紫蘇研究進展概述［J］．中國油料作物學(xué)報，2012，34（2）：225－230．

［4］中國科學(xué)院《中國植物志》編委會．中國植物志唇形科紫蘇屬：第66卷［M］．北京：科學(xué)出版社，1977．

［5］劉月秀，張衛(wèi)明．紫蘇屬植物的分類及資源分布［J］．中國野生植物資源，1998，17（3）：1－4．

［6］張 旭，吳 衛(wèi)，鄭有良，等．紫蘇屬植物染色體數(shù)目和核型分析［J］．西北植物學(xué)報，2008，28（10）：1972－1977．

［7］郭鳳根，陳 娟，王仕玉，等．云南紫蘇資源的酯酶同工酶分析［J］．中國農(nóng)學(xué)通報，2005，21（5）：101－103．

［8］王仕玉，郭鳳根．基于ISSR標(biāo)記的云南紫蘇資源的遺傳多樣性研究［J］．中國油料作物學(xué)報，2012，34（4）：372－376．

［9］DIAO Y，MIAO Y，LIN X，et al．Comparative Analysis of Five Varieties in Perilla frutescens（L．）Britton by 45SrDNA FISH and 5SrDNA［J］．Sequences Russian Journal of Genetics，2009，45（4）：440－444．

［10］郭鳳根，王仕玉．云南境內(nèi)紫蘇種下變異的研究［J］．木本植物研究，2000，23（3）：270－274．

［11］胡 彥．中國紫蘇屬植物種源評價及紫蘇多倍體育種的初步研究［D］．北京：北京林業(yè)大學(xué)，2010．

［12］PARK Y J，KYUNG A D，MA H．Evaluation of genetic diversity and relationships within an on－farm collection of Perilla frutescens（L．）Britt．Using microsatellite markers［J］．Genetic Resources and Crop Evolution，2008，55：523－535．

［13］LEE M C．Analysis of population structure and fatty acid composition in Perilla（P．frutescens var．frutescens）Germplasm［M］．Korea：Korea crops to the spring 2012academic conference，2012．

［14］蔡順順，張興翠．四川、重慶不同紫蘇遺傳多樣性的SRAP研究［J］．西南師范大學(xué)學(xué)報，2013，38（3）：101－106．

［15］周延清，楊清香，張改娜．生物遺傳標(biāo)記與應(yīng)用［M］．北京：化工工業(yè)出版社，2008：159－168．

［16］YU J M，BUCKLER E S．Genetic association mapping and genome organization of maize［J］．Current Opinion in Biotechnology，2006，17：155－160．

［17］ZHANG L Y，MARCHAND S，TINKE N A，et al．Population structure and linkage disequilibrium in barley assessed by DArT markers［J］．Theoretical and Applied Genetics，2009，119：43－52．

［18］HUANG X H，WEI X H，SANG T．Genome－wide association studies of 14agronomic traits in rice landraces［J］．Nature Genetics，2010，42（11）：961－965．

［19］HWANG E Y，SONG Q J，JIA G F，et al．Genomewide association study of seed protein and oil content in soybean［J］．BMC Genomics，2014，15（1）：1－12．

［20］NITTA M，LEE J K，OHNISHI O．Asian perilla cronps and their weedy forms：their cultivation，utilization and genetic relationship［J］．Economia Botany，2003，57（2）：145－153．

［21］LEE M H，YANG K W，HA T J，et al．Development of SCAR marker for identification of the Perillaspecies［J］．Korean Journal of Breeding Science，2011，43 （4）：197－204．

［22］沈 奇，王仙萍，田世剛，等，紫蘇種質(zhì)資源的考察標(biāo)準(zhǔn)及其性狀描述［J］．貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（1）：17－20．

［23］宋振巧．丹參種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究［D］．泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008．

［24］樂云辰，吳亞妮，張艷玲，等．不同薄荷品種遺傳關(guān)系的ISSR分析［J］．上海交通大學(xué)學(xué)報，2008，26（1）：29－32．

（責(zé)任編輯：王 海）

Genetic Diversity Assessment of 10 Perilla Germplasm Resources based on ISSR Marker

CHEN Junkun1，WANG Lijun2，SHEN Qi1，GUO Fenggen3＊，WANG Xianping1，TIAN Shigang1
（1．Guizhou Rapeseed Institute，Guiyang，Guizhou550008；2．Oil Crops Research Institute Sesame and Special Oil Crops Research Office，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Wuhan，Hubei 430062；3．College of Agronomy and Biotechnology，Yunnan Agriculture University，Kunming，Yunnan 650201，China）

For studying on population structure，genetic diversity and evolution classification system of Perillaplants and provide references for protection and exploitation of the Perilla germplasm resources，10 Perilla germplasm resource materials possessing various phenotypic characters from different areas were selected to done PCR amplification by using ISSR marker primers．Results：A total of 266 polymorphic bands were finally acquired．The average polymorphic rate was 56．74%．The variation range of genetic distance from 10materials was 0．690 4～0．975 6，and variation range of genetic coherence was 0．024 7～0．370 4．The Perilla materials were classified into two groups，two variants included in each group．

Perillaplants；ISSR marker；genetic distance；cluster analysis；taxonomy

S542＋．9；Q37

A

1001－3601（2016）12－0492－0010－05

2016－07－03；2016－11－28修回

國家自然科學(xué)基金項目“紫蘇屬植物進化與種群結(jié)構(gòu)研究以及貴州紫蘇資源遺傳多樣性評價”（31360067）；貴州省科學(xué)技術(shù)基金項目“貴州紫蘇屬植物SSR標(biāo)記開發(fā)與資源鑒選”［黔科合J字（2014）2020］；貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院專項資金項目“紫蘇資源品質(zhì)研究中近紅外光譜分析模型的創(chuàng)建和應(yīng)用”［黔科合農(nóng)科院院專項（2011）017］；貴州省科技廳省農(nóng)科院聯(lián)合基金項目“轉(zhuǎn)錄組及脂肪酸代謝共表達分析揭示紫蘇α－亞麻酸合成及調(diào)控機理”［黔科合LH字（2015）7062］

陳俊錕（1972－），男，農(nóng)藝師，從事油料作物遺傳與育種研究。E－mail：1521510633＠qq．com

＊通訊作者：郭鳳根（1964－），男，教授，博士生導(dǎo)師，從事植物資源的評價與利用研究。E－mail：yngfg＠sina．cn