謝睿，王海波，牟海軍，徐靖宇

（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，貴州遵義563099）

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I型鈉氫交換蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)酸堿平衡對胃癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響*

謝睿，王海波，牟海軍，徐靖宇

（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，貴州遵義563099）

摘要：目的觀察I型鈉氫交換蛋白（NHE1）通過調(diào)控胃癌細(xì)胞SGC-7901內(nèi)酸堿值（pH）對其遷移、侵襲的影響。方法采用共聚焦顯微鏡觀察比較用特異性阻斷劑5-（N-乙基-N-異丙基）阿米洛利（EIPA）阻斷胃癌細(xì)胞SGC-7901的NHE1功能前后胞內(nèi)pH值的變化，劃痕實驗觀察細(xì)胞遷移能力的改變，transwell侵襲實驗觀察細(xì)胞侵襲能力的改變。結(jié)果共聚焦實驗發(fā)現(xiàn)對照組細(xì)胞內(nèi)pHi為（7.2±0.12），EIPA阻斷劑組（5μm）為（7.01±0.23），EIPA阻斷劑組細(xì)胞內(nèi)的pH值明顯降低（P<0.05）；進一步劃痕和侵襲實驗證明加入不同濃度的EIPA（5、10和20μmol）后均能有效地抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的遷移和侵襲能力（P<0.05，P< 0.01），并且抑制的程度與EIPA的濃度呈劑量依賴性。結(jié)論阻斷NHE1可以降低胃癌細(xì)胞pH值，進而抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

關(guān)鍵詞：NHE1；胃癌；細(xì)胞遷移；pH；細(xì)胞侵襲

胃癌是世界上最為常見的惡性腫瘤之一，其死亡率位居癌癥死因第2位，我國屬于胃癌高發(fā)大國[1]。隨著近代醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，胃癌的預(yù)后雖已有改善，但5年生存率依然沒有明顯提高，究其原因與胃癌高轉(zhuǎn)移率、高復(fù)發(fā)率的特性密切相關(guān)。既往研究已證實，腫瘤酸性微環(huán)境（即外酸內(nèi)堿）參與了腫瘤的生存遷移等異常細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控過程[2-3]，失調(diào)的細(xì)胞內(nèi)、外酸堿值（potential of hydrogen，pH）是促使腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一個重要誘因，因此，近年來研究者們開始重視pH調(diào)控及其相關(guān)靶分子在腫瘤領(lǐng)域中的重要作用。鈉氫交換蛋白家族（Na+/H-exchangers，NHE)中的I型鈉氫交換蛋白（NHE1），是存在于哺乳動物細(xì)胞上調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外正常pH值的重要膜蛋白，其通過細(xì)胞內(nèi)的一個H+與細(xì)胞外的一個Na+離子進行電中性跨膜轉(zhuǎn)運達(dá)到調(diào)控PH的作用[4]，雖然已有文獻報道NHE1可能參與了乳腺癌、前列腺癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5-6]，但就NHE1與消化系統(tǒng)腫瘤特別是胃癌的相關(guān)性，目前主要集中在對其表達(dá)量變化（蛋白或轉(zhuǎn)錄水平）的研究，而對于通過調(diào)控NHE的蛋白活性（即功能）來揭示對胃癌細(xì)胞異常生物學(xué)行為影響的相關(guān)研究卻鮮見報道。鑒于NHE1亞型廣泛存在于多種組織細(xì)胞中，同時，本次前期研究已發(fā)現(xiàn)NHE1在胃癌具有蛋白表達(dá)量的變化，本實驗擬通過應(yīng)用NHE1特異性阻斷劑5-（N-乙基-N-異丙基）阿米洛利[5-（N-ethyl-N-isopropyl）amiloride（EIPA）]作用于胃癌細(xì)胞后，觀察其胃癌細(xì)胞內(nèi)pH（intracellular pH，pHi）的變化，以及該變化對胃癌細(xì)胞遷移、侵襲行為的影響，旨在從NHE1功能調(diào)控角度，為以NHE1為靶點治療胃癌提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

胃癌SGC-7901細(xì)胞株購于中科院上海細(xì)胞庫，實驗用BCECF/AM、Nigericin購于Intergone公司，EIPA（美國Sigma公司），1640培養(yǎng)基、小牛血清、胰酶購于美國GIBCO公司，二氧化碳CO2培養(yǎng)箱（型號3131，美國Thermo公司），倒置相差顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡均購于德國Leica公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)SGC-7901細(xì)胞置于含有10%胎牛血清、100 u/L青霉素、100μg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，5%的二氧化碳CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d用含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液消化并傳代。

1.2.2細(xì)胞內(nèi)pH測定預(yù)先將特殊的Glass Coverslip載玻片酒精浸泡并在紫外燈下照射15 min后置于6孔板內(nèi)接種細(xì)胞并培養(yǎng)48 h，實驗時用PSS液漂洗3次后，加入終濃度為5μmol/L的BCECF/AM（pH熒光探針），室溫避光孵育30 min，孵育結(jié)束，將BCECF-AM負(fù)載好的SGC-7901細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個特制的灌注室中，再用PSS液漂洗10 min，激光共聚焦顯微鏡下觀察，記錄細(xì)胞內(nèi)熒光值的變化，數(shù)據(jù)采集間隔時間為30 s，掃描時間為20 min。比較EIPA（5μmol）處理前后胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞內(nèi)pH值的變化。用含有尼日利亞菌素（Nigericin）的高鉀溶液催化細(xì)胞外K+和胞內(nèi)H+的跨膜交換，最終使得細(xì)胞內(nèi)外pH值相等，即通過高鉀溶液的pH值即換算出腫瘤細(xì)胞的pHi。

1.2.3細(xì)胞劃痕實驗取對數(shù)生長期SGC-7901細(xì)胞，常規(guī)消化細(xì)胞后計數(shù)，用無血清培養(yǎng)基1640稀釋細(xì)胞使其密度為2×105/ml，接種于48孔板內(nèi)，每孔500μl細(xì)胞懸液，放入37℃、5%二氧化碳CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁并單層平鋪長滿整個孔底部。劃痕給藥處理：取出48孔板，先用PBS清洗1次，用10μl槍頭稍微過火，呈“一”劃痕，再用PBS洗3次，徹底洗凈漂浮起來的細(xì)胞，用無血清的培養(yǎng)基配制不同濃度的EIPA刺激液加入孔板中，實驗分組：正常對照組（加入500μl無血清培養(yǎng)基）、EIPA不同濃度處理組（5、10和20μmol/L），每孔均加入總體積500μl的刺激液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每組設(shè)3個復(fù)孔，找出給藥前拍照的原位置進行拍照，實驗結(jié)果用Image-plus軟件測量，藥物刺激前后劃痕兩側(cè)細(xì)胞間距離的變化，每張圖片測量5個距離點，細(xì)胞遷移距離=藥物刺激前兩邊細(xì)胞的距離-藥物刺激后兩邊細(xì)胞的距離。每孔取5個視野拍照，每次實驗至少重復(fù)3次。

1.2.4細(xì)胞侵襲實驗將人工基底膜（Matrigel）（40μl/孔）均勻地鋪在Transwell小室膜上，37℃放置6 h，待吸盡基質(zhì)膠表面液體，下室加600μl 1640培養(yǎng)基，含30%胎牛血清，上室分別加入不同濃度EIPA處理液重懸的細(xì)胞懸液（細(xì)胞密度為5×105個/ml細(xì)胞）400μl/室，無血清1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。將小室置于12空板中于37℃培養(yǎng)箱孵育24 h。后用1% PBS漂洗3次；用4%甲醛溶液固定30 min，蘇木精染色，梯度乙醇溶液逐級脫水，鄰苯二甲醛透明后，置于載玻片上封固。在光學(xué)顯微鏡下隨機挑選5個視野（×200）下的穿膜細(xì)胞數(shù)，計算平均細(xì)胞侵襲數(shù)量，以穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞的侵襲力，實驗分為正常對照組（加入600μl無血清培養(yǎng)基）、EIPA不同濃度處理組（5、10和20μmol/L），每次實驗至少重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS11.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗做差異的顯著性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1EIPA抑制NHE1功能對胞內(nèi)pH的影響

首先測量靜息狀態(tài)對照組胃癌細(xì)胞SGC-7901 的pHi值，結(jié)果顯示對照組胃癌細(xì)胞pHi為（7.20± 0.12），而加入NHE1特異性抑制劑EIPA（5μmol）阻斷NHE1的功能后，pHi變?yōu)椋?.01±0.23），相對于對照組pHi值顯著降低（P<0.05，見圖1）。表明胃癌細(xì)胞的NHE1具有調(diào)控細(xì)胞內(nèi)pH的功能，并且通過EIPA抑制NHE1活性后會導(dǎo)致SGC-7901細(xì)胞內(nèi)的pH值明顯降低，細(xì)胞明顯酸化，胞外微環(huán)境偏堿。

2.2EIPA抑制NHE1功能對胃癌細(xì)胞遷移能力的影響

與對照組遷移的距離（45.0±2.4）μm比較，加入不同濃度（5、10和20μmol）的阻斷劑EIPA作用24 h后能夠明顯抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的遷移能力[5μmol組：（38.0±4.5）μm；10μmol組：（30.0± 4.3）μm；20μmol組：（26.0±2.6）μm]，并且SGC-7901細(xì)胞遷移能力的抑制程度與EIPA的濃度呈劑量依賴性，結(jié)果見圖2、附表。

2.3EIPA抑制NHE1功能對胃癌細(xì)胞侵襲的能力影響

與對照組侵襲的細(xì)胞數(shù)量（100.75±9.42）個比較，加入不同濃度（5、10和20μmol）的阻斷劑EIPA 24 h作用后能夠明顯抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的侵襲能力（P <0.05）[5μmol組：（75.75±7.87）個；10μmol組：（46.5±4.35）個；20μmol組：（34.5±6.60）個]，并且SGC-7901細(xì)胞侵襲能力的抑制程度與EIPA的濃度呈劑量依賴性。結(jié)果見圖3、圖4。

圖1　對照組及EIPA組胃癌細(xì)胞的pHi曲線及統(tǒng)計圖

圖2　對照組及不同濃度的EIPA刺激24h后胃癌細(xì)胞的遷移距離

附表　對照組及不同濃度的EIPA刺激后胃癌細(xì)胞遷移距離統(tǒng)計表（n=4，μm，±s）

附表　對照組及不同濃度的EIPA刺激后胃癌細(xì)胞遷移距離統(tǒng)計表（n=4，μm，±s）

注：與對照組比較，1）P<0.05；2）P<0.01

分組　　對照組　5μmol組　10μmol組　20μmol組遷移距離　45.0±2.4　38.0±4.51）　30.0±4.32）　26.0±2.62）

圖3　不同濃度的EIPA刺激對胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響

圖4　對照組及不同濃度的EIPA刺激后胃癌細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計圖

3　討論

多年來研究者們一直致力于胃癌發(fā)生發(fā)展的機制研究，以期為根治胃癌及改善胃癌預(yù)后尋找到新的治療途徑。但是胃癌的發(fā)生、發(fā)展是多基因、多步驟的過程，常規(guī)的化療、放療、免疫方法只能殺死原位的腫瘤細(xì)胞，卻無法完全控制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程，而腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移往往又是腫瘤復(fù)發(fā)的根本原因，因此，針對腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制研究刻不容緩。近年來的研究表明，腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和侵潤均涉及復(fù)雜的細(xì)胞行為變化，而這些變化與細(xì)胞自身所處的腫瘤微環(huán)境特別是微環(huán)境的酸堿度密切相關(guān)。

既往研究發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞胞內(nèi)堿性環(huán)境會促進細(xì)胞更加頻繁的新陳代謝，而外部酸性環(huán)境卻能增強腫瘤細(xì)胞遷移、侵潤轉(zhuǎn)移能力。究其原因一方面腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移在很大程度上主要依賴于一系列蛋白酶，如金屬蛋白酶、巰基蛋白酶、絲氨酸蛋白酶及酸性蛋白酶等，他們可以去降解一系列組織屏障，在酸性環(huán)境下這些酶的活性可被增強，從而為癌細(xì)胞的侵襲創(chuàng)造條件[7-8]。另一方面，腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲主要的驅(qū)動力是板狀偽足，而板狀偽足主要是由肌動蛋白構(gòu)成，它能夠突入細(xì)胞外基質(zhì)，進而組裝成微絲網(wǎng)格，構(gòu)成細(xì)胞骨架形成的驅(qū)動力。但在前述過程中，cofilin肌動蛋白和凝溶膠gelsolin蛋白的參與都是微絲組裝和解離過程中的關(guān)鍵物質(zhì)，而這兩種蛋白在細(xì)胞遷移中均對pH敏感，cofilin在堿性pH中的活性高于酸性，而高濃度的質(zhì)子可以激活gelsolin[9]。由此可見細(xì)胞內(nèi)外的pH變化的確是調(diào)控細(xì)胞侵襲、遷移能力的重要因素，所以腫瘤酸性微環(huán)境（即外酸內(nèi)堿）更有利于腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移。那么pH的平衡的調(diào)控機制是什么呢？進一步的研究表明胞外酸環(huán)境的形成主要依賴于胞內(nèi)過量氫離子的外排行為，而NHE家族中的NHE1亞型作為胞膜上重要的氫離子交換器已被證實在細(xì)胞內(nèi)外pH的調(diào)控機制中扮演重要角色。

自1989年首次克隆出人類NHE1cDNA以來[10]，到目前已知NHE基因家族中有9個亞型，它們具有相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，NHE1是NHE家族中表達(dá)最為廣泛的亞型，幾乎所有的組織質(zhì)膜上均有表達(dá)，被認(rèn)為是一個“管家基因”。人類NHE1包含12個外顯子和11個內(nèi)含子，整個cDNA全長5Kb。既往的報道證實NHE1是調(diào)控細(xì)胞外酸堿微環(huán)境的重要因子，其通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的一個H+與細(xì)胞外的一個Na+離子進行電中性跨膜轉(zhuǎn)運來影響細(xì)胞內(nèi)外的pH平衡。在NHE1與疾病相關(guān)性的研究中，已發(fā)現(xiàn)NHE1抑制劑處理后的人類白血病細(xì)胞,其細(xì)胞內(nèi)pH明顯降低，進而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[11]。同時，Lagana 等[12]發(fā)現(xiàn)用MSV轉(zhuǎn)化犬腎上皮連續(xù)細(xì)胞系，采用乙基異丙基氯毗咪處理后，細(xì)胞中NHE1的活性被明顯抑制，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白應(yīng)力纖維解聚合細(xì)胞骨架肌動阮重新分布，細(xì)胞偽足縮會，細(xì)胞運動被抑制。由此可見NHE1的確具有影響細(xì)胞遷移、侵襲的能力，近年來的研究還證實NHE1與前列腺癌、乳腺癌、大腸癌等腫瘤的進展、轉(zhuǎn)移均有著密切的關(guān)系[5-6]。那么，在胃癌細(xì)胞中NHE1是否也能影響細(xì)胞pH，進而影響胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為呢？本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組胃癌細(xì)胞SGC-7901胞內(nèi)的pHi為7.20，采用NHE1特異性的阻斷劑EIPA阻斷NHE1的功能后，細(xì)胞內(nèi)pH下降到7.01（P <0.05），提示NHE1在胃癌細(xì)胞的確具有調(diào)控細(xì)胞內(nèi)pH的功能，阻斷了NHE1后的活性后細(xì)胞內(nèi)的H+會因為無法外泵而導(dǎo)致胞內(nèi)pH降低，形成一種外堿內(nèi)酸，不利于癌細(xì)胞遷移、侵襲的微環(huán)境。本研究想證實細(xì)胞內(nèi)的pH改變是否的確對胃癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力具有影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)NHE1阻斷劑EIPA處理，胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞的遷移、侵襲能力較對照組（PBS）均明顯降低，這表明NHE1受體的確通過調(diào)控胃癌細(xì)胞內(nèi)pHi變化影響進而腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，抑制NHE1的活性能夠明顯抑制胃癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力。本實驗發(fā)現(xiàn)，至少在細(xì)胞水平，胃癌細(xì)胞NHE1很可能是胃癌發(fā)生、發(fā)展中重要的調(diào)控機制，開發(fā)一種新的NHE臨床抑制劑有可能為許多疾病的治療提供新思路和新途徑。

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（張蕾編輯）

Effect of NHE1-regulated intracellular pH on invasion and migration of gastric cancer cells*

Rui Xie,Hai-bo Wang,Hai-jun Mu,Jing-yu Xu
(Department of Gastroenterology,the Affiliated Hospital,Zunyi Medical College,Zunyi,Guizhou 563099,China)

Abstract:objective To observe the effect of Na+/H+exchanger 1 (NHE1)-regulated intracellular pH on the invasion and migration of gastric cancer cell line SGC-7901.Methods The gastric cancer cell line SGC -7901 was treated with the NHE1 specific inhibitor 5-(N-ethyl-N-isopropyl) Amiloride (EIPA),the intracellular pH of SGC-7901 was measured using confocal fluorescence microscope.The migration of SGC-7901 cells was examined by scratch test.The invasion of SGC -7901 cells was examined by transwell chamber invasive test.Results The intracellular pH in the control group was (7.2±0.12),it significantly reduced to (7.01±0.23) in the 5-μmol EIPA group.EIPA of different concentrations (5 μmol,10 μmol and 20 μmol) could inhibit the invasion and migration of SGC-7901 cells in a dose-dependent manner.Conclusions NHE1 plays an important role in the regulation of intracellular pH.Blockage of NHE1 could restrain the invasion and migration of gastric cancer cells.

Keywords:NHE1; gastric cancer; cell migration; pH; cell invasion

[通信作者]徐靖宇，E-mail：xujingyu-gzzy@126.com

*基金項目：貴州省衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)基金項目（No：gzwjkj2014-2-165）

收稿日期：2015-10-07

文章編號：1005-8982（2016）06-0006-05

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.06.002

中圖分類號：R975.6

文獻標(biāo)志碼：A