熊建寧，胡立春，王亞兵，段雪飛（廣東省佛山市南海區(qū)第三人民醫(yī)院肝膽外科，廣東佛山528244）

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microRNA-10b及靶基因HOXD10在肝癌細胞中的表達及侵襲能力的影響*

熊建寧，胡立春，王亞兵，段雪飛
（廣東省佛山市南海區(qū)第三人民醫(yī)院肝膽外科，廣東佛山528244）

摘要：目的探討microRNA-10b（miR-10b）及其靶基因同源異性盒基因HOXD10在肝癌細胞中的表達及轉染miR-10b對肝癌細胞侵襲性能力的影響。方法分析HOXD10基因在3種肝癌細胞株Huh7、HepG2、SMMC-7721中的基礎表達量，篩選出HOXD10基礎表達量高的HepG2作為后續(xù)研究對象。設計合成外源性miR-10b序列，用脂質體瞬時轉染肝癌細胞株，設置miR-10b轉染組、無關序列轉染組（陰性對照組）和未處理組（對照組）。用RT-PCR及Western blot檢測肝癌細胞轉染miR-10b后HOXD10基因及蛋白表達量的變化，細胞侵襲實驗研究轉染miR-10b對肝癌細胞侵襲能力。結果在基因水平和Western blot分析蛋白水平HOXD10基因表達量2-ΔΔCT分別是（1.24±0.23）、（1.00±0.02），P>0.05差異無統(tǒng)計學意義。在蛋白分析HepG2細胞灰度計算值是值分別是653.492和1 968.742，蛋白水平表達降低。HOXD10基因在肝癌細胞株HepG2的表達量顯著高于Huh7和SMMC-7721；miR-10b成功轉染HepG2后，HOXD10基因表達水平與對照組比較無明顯變化，但HOXD10蛋白表達量與對照組比較下降及侵襲性也增強。結論miR-10b可能通過抑制靶基因HOXD10表達發(fā)揮作用，促進肝癌細胞的侵襲。

關鍵詞：肝癌細胞；microRNA-10b；HOXD10；侵襲

研究發(fā)現腫瘤發(fā)生、發(fā)展與microRNA的關系越來越密切。microRNA-10b（miR-10b）在乳腺癌、胰腺癌、膠質瘤等腫瘤組織中均有異常表達，并且與腫瘤的侵襲性和遠處轉移密切相關[1]。HOXD10 （HomeoboxD10）被認為可能是miR-10b的靶基因，屬于同源異型盒基因家族中的一員，位于2號染色體，是細胞分化、個體發(fā)育生長的關鍵基因位點。目前HOXD10基因與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關系研究，主要集中在乳腺癌、血液病、食道癌、膠質瘤等方面，與肝癌相關的研究較少[2]。本研究擬通過設計合成外源性miR-10b轉染肝癌細胞株，轉染成功后，驗證HOXD10基因及蛋白表達量的變化，探討轉染miR-10b對肝癌細胞侵襲能力的影響。

1　材料與方法

1.1材料和試劑

肝癌細胞株HepG2由廣東省醫(yī)學科學院醫(yī)學研究所細胞中心保存。RPMI 1640、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（Hyclone公司），Trizol試劑（美國Invitrogen公司），轉染試劑Lipofectamine 2000（Invtrigen公司），一抗1∶1 000，二抗1∶5 000（美國Southern Biotech公司），體外侵襲實驗裝置（美國BD公司），Transwell侵襲小室（美國Millipore公司）。

1.2生物信息學分析

TargetScan[http://www.targetscan.org/],picTar[http://pictar.org/],miRanda[http://www.microrna.org/microrna/]3種生物學軟件分析miR-10b可能調控的靶基因，選取HOXD10為目的基因。引物及miR-10b序列由廣州銳博生物科技有限公司合成。

1.3試驗方法

肝癌細胞用DMEM、RPMI 1640完全培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，收集對數生長期的細胞進行實驗。細胞瞬時轉染，選擇HepG2細胞脂質體轉染miR-10b mimics24h用QPCR檢測。PCR分析mRNA表達量，通過逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）方法克隆非翻譯區(qū)（3'-UTR）引物序列為：HOXD10-正向引物：5'-CCGAAGTGCAGGAGAAGGAA；HOXD10-負向引物：5'-GTGTAAGGGCACCTCTTCTTTCTG，測序正確后常規(guī)方法轉染HepG2細胞，同時在細胞內檢測HOXD10表達量。Western blot分析：用BCA法。體外細胞侵襲實驗：細胞轉染miR-10b后HepG2接種至侵襲裝置，培養(yǎng)24 h后經吉姆薩染色對穿膜細胞計數。

1.4統(tǒng)計學方法

所有實驗數據用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，進行正態(tài)性分析及獨立樣本t-test，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1HOXD10在3種肝癌細胞中表達及構建高表達miR-10b

Huh-7細胞，HepG2細胞，SMMC-7721細胞HOXD10基因經PCR比較基礎表達量2-ΔΔCT分別是1.00、228.71和1.55，見表1、圖1。蛋白分析HepG2細胞灰度計算值是930.22，Huh-7是406.00，SMMC-7721是249.00，見圖2。通過基因和蛋白實驗結果篩選出表達量高的HepG2細胞符合下一步實驗要求。miR-10b逆轉錄后表達量為（9 772.22± 437.99），與陰性對照組比較，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義，說明構建高表達miR-10b成功，見表2、圖3。

表1　HOXD10基因在3種肝癌細胞相對表達量（±s）

表1　HOXD10基因在3種肝癌細胞相對表達量（±s）

組別Huh7 HepG2 SMMC-7721基礎表達量2-ΔΔCT1.00±0.00 228.71±0.12 1.55±0.01

圖1　HOXD10在肝癌Huh7、HepG2以及SMMC-7721細胞表達量比較

圖2　HOXD10在肝癌Huh7、HepG2以及SMMC-7721細胞蛋白表達

2.2轉染后HOXD10在肝癌細胞中基因及蛋白表達

HepG2肝癌細胞中轉染miR-10b的HOXD10實驗組與陰性對照組，在基因水平和Western blot分析蛋白水平HOXD10基因表達量2-ΔΔCT分別是（1.24±0.23）和（1.00±0.02），P>0.05差異無統(tǒng)計學意義。見表3、圖4。在蛋白分析HepG2細胞灰度計算值分別是1 968.742和653.492，蛋白水平表達降低，見圖5。

2.3體外細胞侵襲實驗

體外細胞侵襲實驗穿膜細胞計數結果顯示：HepG2轉染miR-10b過表達后（112.38±11.27），與陰性對照組（75.25±6.35）比較細胞侵襲能力增加（P<0.05）。見表4。

表2　轉染MiR-10b基因在3種樣品中相對表達量（±s）

表2　轉染MiR-10b基因在3種樣品中相對表達量（±s）

注：NC：過表達miR-10b的陰性對照組；miR-10b組：過表達miR-10b組；miR-10b組與NC組比較，t=-35.705，P=0.000

未處理組NC組組別miR-10b組基礎表達量2-ΔΔCT9 772.22±437.99 0 1.21±0.01

圖3　miR-10b在3種樣品中的表達水平

表3　轉染后肝癌細胞株HOXD10基因相對表達量（±s）

表3　轉染后肝癌細胞株HOXD10基因相對表達量（±s）

注：NC：過表達miR-10b的陰性對照組；miR-10b組：過表達miR-10b組；miR-10b組與NC組比較，t=6.245，P=0.220

組別miR-10b組基礎表達量2-ΔΔCT1.24±0.23未處理組NC組1.47±0.22 1.00±0.12

圖4　miR-10b在轉染后HOXD10表達

圖5　Western blot分析轉染后蛋白表達

表4　細胞侵襲實驗穿膜細胞計數（±s）

表4　細胞侵襲實驗穿膜細胞計數（±s）

注：未處理組：HepG2；NC：過表達miR-10b的陰性對照組；miR-10b組：過表達miR-10b組；F=6.726，P=0.006組間差異有統(tǒng)計學意義，miR-10b組與NC組比較，P=0.043

NC組miR-10b組75.25±6.35 112.38±11.27組別未處理組細胞計數79.38±4.16

3　討論

miRNA在轉錄后基因表達和生物行為發(fā)展過程起著重要調控作用，大多數人類癌癥與miRNA發(fā)揮抑癌基因或癌基因作用有關[3]。腫瘤發(fā)生在染色體易變位點上，即染色體上易發(fā)生丟失、移位或重復的部位，是微小RNA表達異常與某些腫瘤關系密切的原因[4]。肝細胞癌中2號染色體短臂發(fā)生突變，而miR-10b恰位于該突變部位。Ma等[5]發(fā)現miR-10b高表達和腫瘤細胞的血管侵襲相關；特異性增加miR-10b表達量可促進腫瘤細胞的侵襲。Laderio等[6]報道109例肝臟樣本肝細胞癌29例、肝良性病變局灶性結節(jié)性增生5例，癌旁組織93例，其中miR-10b表達量顯著高于良性病變和未發(fā)生腫瘤病變的肝臟組織，同時把miR-10b看做肝臟腫瘤細胞侵襲性、轉移的相關因素；說明在肝癌組織中miR-10b表達上調，可抑制某些靶基因表達而發(fā)揮癌基因作用。HOXD10基因同樣位于2號染色體，是細胞分化、個體發(fā)育生長的關鍵基因位點[7]。受到miR-10b及其他多種負性調控作用，HOXD10在多數惡性腫瘤表達缺失，從而增強腫瘤細胞的侵襲能力[8]。Myers等[9]研究表明持續(xù)表達的HOXD10基因，對乳腺腫瘤細胞新生血管的生成起到一定的抑制作用。Carrio等[10]在HOXD10抑制腦膠質瘤細胞的侵襲和轉移研究中同樣發(fā)現，高表達HOXD10可以抑制新生毛細血管形成，從而抑制正常腦細胞向腫瘤細胞分化，因此，HOXD10被認為是抑癌基因。上調miR-10b可以抑制mRNA編碼HOXD10翻譯過程，導致增加有潛在轉移性質的基因RHoC，并且發(fā)現隨著進展期乳腺癌腫瘤侵襲程度增加，HOXD10表達卻逐漸消失[11]。HOXD10過表達可以抑制RHoC蛋白的表達，進而可以阻止miR-10b誘導的腫瘤細胞發(fā)生侵襲轉移[12]。Liao等[13]試驗60例不同肝細胞肝癌TNM分期中miR-10b表達情況與肝癌細胞轉移能力相關，得出miR-10b負調控HOXD10在轉錄后水平通過HOXD10相關基因RhoC/uPAR/MMPs促進肝癌細胞轉移和侵襲。

總結分析得出實驗采用微小RNA瞬時轉染方法，可以提高miR-10b基因在轉染細胞HepG2細胞中的表達量，在靶基因基礎表達量高的前提下，通過RT-PCR和Western blot方法研究在肝癌細胞中HOXD10基因和蛋白的表達情況，結果發(fā)現HOXD10在mRNA水平變化小而蛋白水平表達是降低的，說明miR-10b是通過轉錄后翻譯階段來調節(jié)靶基因的表達，該靶基因可能起到抑制癌基因作用，過表達miR-10b增加了HepG2細胞侵襲能力。miR-10b過表達與肝細胞癌的侵襲關系密切，為進一步研究肝癌細胞的多種生物學特征提供實驗依據。

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（張蕾編輯）

Expression of miR-10b and target gene HOXD10 in liver cancer cell lines and its impact on tumor invasion*

Jian-ning Xiong,Li-chun Hu,Ya-bing Wang,Xue-fei Duan
(Department of Hepatobiliary Surgery,the Third People's Hospital of Nanhai,Foshan,Guangdong 528244,China)

Abstract:Objective To investigate the expression of miR-10b and its targeted gene HOXD10 in hepatic carcinoma cell lines and its influence on tumor invasion.Methods Basic expression of HOXD10 gene in the three hepatic carcinoma cell lines (Huh7,HepG2 and SMMC-7721) was determined.Mature mimics of miR-10b were chemically synthesized and transiently transfected into higher HOXD10-expression cell line HepG2 cells via lipofectamine 2000.Cells were also transfected with empty vectors and unrelated fragment to serve as negative controls.The invasion of HepG2 cells was investigated by Transwell assay.The expressions of HOXD10 were detected by RT-PCR and Western blot.Results The expression levels of gene and protein at 2-Δ Δ CTwere (1.24±0.23) and (1.00±0.02) without significant difference (P > 0.05).In protein analysis of HepG2 cells,gray value was calculated to be 653.492 and 1968.742 respectively,and protein expression levels were reduced.Target gene HOXD10 was over-expressed in HepG2 cells and the ability of tumor invasion increased.Conclusions Synthesized miRNA-10b can regulate the expression of target gene HOXD10 and promote the invasion of the hepatic carcinoma cells.

Keywords:hepatic carcinoma cell; miRNA-10b; HOXD10; invasion

[通信作者]胡立春，E-Mmail：spring@126.com，Tel：13702984975

*基金項目：廣東省佛山市衛(wèi)生和計劃局醫(yī)學科研課題（No：2015343）

收稿日期：2015-10-25

文章編號：1005-8982（2016）06-0011-04

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.06.003

中圖分類號：R735.7

文獻標識碼：A