太文杰，陳生科，甘秀海

（貴州師范學院化學與生命科學學院，貴州 貴陽 550018）

山苦荬中總黃酮的提取及抗氧化活性研究

太文杰，陳生科，甘秀海

（貴州師范學院化學與生命科學學院，貴州 貴陽 550018）

在單因素試驗基礎上，采用響應面法優(yōu)化山苦荬總黃酮的提取工藝并提取總黃酮，同時考察山苦荬樣品中總黃酮對DPPH自由基的清除能力。結果表明：山苦荬總黃酮最佳提取工藝為液料比27∶1、乙醇濃度58wt.%、提取溫度61℃，該條件下總黃酮的提取率為116.55 mg·g-1；另外，山苦荬總黃酮對DPPH自由基具有較好的清除能力。

山苦荬；總黃酮；響應面法；抗氧化活性

山苦荬Ixerischinensis（Thunb.）Nakai為菊科（Compositae）苦苣菜屬（Soncbus）的全草，別名七托蓮、小苦麥菜、小苦荬等，為多年生草本植物，主要分布于我國東北、華北等地。本品味苦，性涼、澀、鈍、稀，具有清熱解毒、排毒、止痛等功效，用于治療痢疾、腹痛及肺出血等疾病[1]。

山苦荬中含有倍半萜內(nèi)酯[2]、三萜[3]類化合物。另外還含有較多的黃酮類化合物，張垠等[4-5]從山苦荬中分離得到了熊果酸、β-谷甾醇、蒲公英萜醇乙酸酯、蒲公英萜醇、芹菜素、木犀草素及木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷。2012年，吳七十三等[6]從山苦荬中分離得到芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷乙酸酯、5, 3', 4'-三羥基-7-甲氧基黃酮、5-羥基-7, 4'-二甲基黃酮、5, 7, 4'-三甲氧基黃酮等化合物。山苦荬具有多種藥理活性，包括抗炎保肝作用[7]，抗病毒、抗白血病作用[8]，治療糖尿病作用[9]等。由化學成分研究可知，山苦荬中含有多種黃酮類化合物，羅偉強等[10]對其莖的總黃酮提取方法進行了初步研究，但關于其全株總黃酮的提取及生物活性的研究未見相關報道。響應面法在提取工藝的優(yōu)化中得到了廣泛的應用，具有使用簡單、精密度高、預測性好等優(yōu)點[11]。與此同時，黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗菌及抗氧化等多種生理活性，極具開發(fā)價值，在心血管疾病、內(nèi)分泌疾病、腫瘤等疾病方面及食品添加劑和保健品方面均得到廣泛的應用。DPPH清除能力評價方法是被廣泛認可的抗氧化活性測定方法，具有快速、準確等優(yōu)點[12]。為了開發(fā)山苦荬藥材資源，本實驗在單因素實驗基礎上通過響應面法優(yōu)化了山苦荬總黃酮的提取工藝，在所得的最佳提取工藝條件下，提取獲得山苦荬總黃酮，并采用可見分光光度法測定了山苦荬中總黃酮的含量，同時測定了山苦荬總黃酮對DPPH自由基的清除能力，以期為山苦荬資源綜合開發(fā)與利用提供科學依據(jù)。

1 材料與設備

1.1 儀器722s可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；XFB-200型中藥粉碎機（長沙市中南制藥機械廠）；BSA1240S型電子分析天平（北京賽多利斯科學儀器公司）；HH-8型電熱恒溫水浴鍋（上海梅香儀器有限公司）；KQ-500B型超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥品山苦荬Ixerischinensis（Thunb.）Nakai樣品于2016年5～6月采自河北省陽原縣境內(nèi)，經(jīng)貴州師范學院錢長江副教授鑒定為山苦荬Ixerischinensis（Thunb.）Nakai；蘆丁對照品（購于貴州迪大生物科技，批號GZDD-0001）；1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH），購于上海晶純生化科技股份有限公司；維生素C（購于天津市科密歐化學試劑有限公司）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 標準曲線的繪制參考文獻[13]方法，精確稱取2.8mg蘆丁標準品，用60 %乙醇溶解并定容至25mL，即得0.112mg·mL-1的標準品溶液。參考文獻[6]方法，準確吸取蘆丁標準品溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL于10mL比色管中，用60 %乙醇補至5.0mL，加入5%NaNO2溶液0.3mL，搖勻，靜置6min；加入10%Al（NO3）3溶液0.3mL，搖勻，靜置6min；再加入4%NaOH溶液2mL，用60wt.%乙醇定容至刻度，搖勻，以試劑為空白參比液于506nm處測定吸光度（A），平行測定3次，以吸光度（A）為縱坐標，濃度（c）為橫坐標繪制標準曲線，進行回歸分析，得回歸方程：A=0.001c+0.0091，R2=0.9996，結果表明，蘆丁濃度在0.112～0.560mg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

2.2 單因素試驗

2.2.1 液料比對山苦荬總黃酮提取率的影響

圖1 液料比對山苦荬總黃酮提取率的影響

以60wt.%的乙醇為溶劑，于30 ℃，超聲功率300W下，超聲提取兩次，每次20min，考察不同的液料比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1mL/g）對山苦荬總黃酮提取率的影響，結果如圖1所示。由圖可知，山苦荬總黃酮提取率隨液料比的加大，先增大后降低，于25∶1時達到最大值。

2.2.2 乙醇濃度對山苦荬總黃酮提取率的影響

圖2 乙醇濃度對山苦荬總黃酮提取率的影響

在液料比25∶1，超聲功率300W，20 ℃，超聲提取兩次，每次20min，考察不同的乙醇濃度（30wt.%、40wt.%、50wt.%、60wt.%、70wt.%、80wt.%）對山苦荬總黃酮提取率的影響，結果如圖2所示。由圖可知，山苦荬總黃酮提取率在乙醇濃度為60%時達到最大值。當乙醇濃度進一步增大時，提取率反而減小，這主要是因為山苦荬黃酮類化合物多為黃酮苷類，乙醇濃度增大其溶解性反而減小。

2.2.3 提取時間對山苦荬總黃酮提取率的影響

以60wt.%乙醇為溶劑，液料比為25∶1，超聲功率300W，20 ℃，超聲提取兩次，考察不同的超聲時間（5、10、15、20、25、30min）對山苦荬總黃酮提取率的影響。結果如圖3所示。由圖可知，提取時間對山苦荬總黃酮提取率的影響較小。

圖3 提取時間對山苦荬總黃酮提取率的影響

2.2.4 提取溫度對山苦荬總黃酮提取率的影響

以60wt.%乙醇為溶劑，液料比為 25∶1，超聲功率300W，超聲提取兩次，每次20min，考察不同的提取溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）對山苦荬總黃酮提取率的影響。結果如圖4所示。由圖可知，山苦荬總黃酮提取率先降低后升高，之后再次降低，且在60 ℃時達最大值。

圖4 提取溫度對山苦荬總黃酮提取率的影響

2.3 響應面優(yōu)化[12]

在單因素試驗的基礎上，以60wt.%體積分數(shù)的乙醇為溶劑，選擇液料比（A）、乙醇濃度（B）、提取溫度（C）為因素，利用Design-Expert8.0.6軟件中的Box-Behnken優(yōu)化山苦荬總黃酮的提取工藝。試驗安排及結果見表1。

表1 響應面試驗設計方案及結果

對表1中的數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，得到總黃酮含量（Y）對因素料液比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）的二次多項回歸方程Y=115.95 + 3.84A- 1.61B+ 0.05C- 3.07AB+ 0.34AC- 3.07BC- 5.34A2- 8.48B2- 4.77C2，對該回歸模型進行方差分析，結果見表2。

表2 回歸模型參數(shù)檢驗

注：***差異極顯著（P<0.001）；**差異高度顯著（P<0.01）；*差異顯著（P<0.05）

由表2可知，模型P<0.01，表明響應回歸模型達到了高度顯著水平，說明模型可靠。回歸方程相關系數(shù)R2=0.9269，說明該模型擬合程度較好，表明該方程較好地反映了液料比、乙醇濃度和提取溫度與山苦荬黃酮提取含量的關系，因此可用此模型對山苦荬黃酮的提取進行分析和預測。由回歸模型的方差分析結果可知，方程一次項A和二次項B2對黃酮提取的影響高度顯著，A2、C2對黃酮提取的影響顯著。由F值可以判斷，在所選實驗范圍內(nèi)，三個因素對黃酮提取的影響順序為液料比>乙醇濃度>提取溫度。各因子交互作用對黃酮提取率影響的分析見圖5-圖7。由圖可知，液料比（A）、乙醇濃度（B）、提取溫度（C）對總黃酮提取的影響均表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，同時在各因子交互作用圖中交互因子對黃酮提取率影響均能夠達到響應值的極大值，其中因素A影響最顯著，表現(xiàn)為曲面最陡峭，響應值變化較大。

圖5 液料比和乙醇濃度交互作用對總黃酮提取量的 響應面圖

圖6 液料比和提取溫度交互作用對總黃酮提取量的 響應面圖

圖7 乙醇濃度和提取溫度交互作用對總黃酮提取量的 響應面圖

通過響應面設計軟件分析得到山苦荬總黃酮的最佳提取工藝為：液料比27.07：1、乙醇濃度58.08wt.%、提取溫度61.01 ℃，此條件下總黃酮的理論含量為117.32mg·g-1?？紤]實際操作的情況，將提取條件修正為液料比27：1、乙醇濃度58wt.%、提取溫度61 ℃，此條件下得到山苦荬總黃酮的含量為116.55mg·g-1。兩者相比，相對誤差約為0.66wt.%，說明響應面優(yōu)化結果可靠。

2.4 抗氧化活性測定

參照文獻[7]的方法，將樣品溶液及陽性對照品溶液用乙醇配制成一系列濃度，測定不同濃度樣品及陽性對照品對DPPH的清除能力，每份樣品和陽性對照品平行操作3次，取平均值，計算出清除率。通過回歸分析得到山苦荬總黃酮對DPPH自由基清除能力的IC50為73.00±2.52μg/mL，但弱于Vc（IC50=30.20±1.94μg/mL）的清除作用。由此可知，山苦荬總黃酮樣品對DPPH自由基具有較好的消除能力。此外，山苦荬總黃酮對自由基的清除能力與總黃酮含量成正相關性。

3 結論

本實驗在單因素試驗基礎上，采用響應面法優(yōu)化了山苦荬總黃酮的提取工藝并在此條件下提取了總黃酮?？寡趸瘻y定顯示山苦荬總黃酮具有較好的消除DPPH自由基的能力。這為山苦荬的藥理活性物質(zhì)基礎的進一步研究提供了實驗依據(jù)，同時也為山苦荬在保健品等抗衰老制劑領域的開發(fā)利用提供了一定的理論基礎。

[1]國家中醫(yī)藥管理局編．中華本草[M]．貴陽:貴州科技出版社，2005.

[2]ZhangS.J，ZhaoM，BaiL.M,etal.BioactiveguaianolidesfromSiyekucai（Ixerischinensis）[J].JournalofNaturalProducts,2006,69:1425-1428.

[3]楊樹青，朱曉偉，申鍵，等.苦荬菜屬植物化學成分及藥理活性研究進展[J].內(nèi)蒙古醫(yī)科大學學報，2013,35（S1）:111-115.

[4]張垠，童志平，薛鵬禧，等．藏藥山苦荬化學成分研究[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學，2010,38（29）:16222-16225.

[5]張垠.藏藥山苦賣化學成分的研究[D]．成都：西南交通大學，2011.

[6]吳七十三，王青虎，那音臺．蒙藥光葉山苦荬化學成分研究[J].中藥材，2012,35（12）:1945-1949.

[7]ZhengQ.S.,SunX.L.,XuB.,etal.Protectiveeffectsofuteolin-7-O-β-Dglucosideagainstliverinjurycausedbycarbontertrachloride[J].Pharmazie，2004,59（4）:286-289.

[8]ChiangL.C.,ChengH.Y.,ChenC.C.,etal.Invitroanti-leukemicandantiviralactivitiesoftraditionallyusedmedicinalplantsinTaiwan[J].AmericanJournalofChineseMedicine,2004,32（5）:695-704.

[9]邸子真，王光函，姜鴻，等．中華苦荬菜治療糖尿病并發(fā)癥的物質(zhì)基礎研究[J].醫(yī)藥導報，2011,30（11）:1429-1431.

[10]羅偉強，黃潤均，鄧光輝．苦荬菜莖黃酮類化合物提取方法研究[J].廣西民族學院學報（自然科學版），2003,9（1）:31-32.

[11]周向軍，高義霞，張霞．響應面法優(yōu)化黃花菜總黃酮提取工藝[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（16）:29-32.

[12]甘秀海，梁志遠，趙超．冷水花總黃酮的提取工藝優(yōu)選及抗氧化活性考察[J].中國實驗方劑學雜志，2015,21（16）:10-13.

[13]周丹蓉，鄭少泉，蔣際謀．響應面法優(yōu)化枇杷花總黃酮超聲波輔助提取工藝的研究[J].熱帶作物學報，2012，33（7）:1219-1224.

[14]鄭丹丹，王京龍，王占一，等.石榴葉總黃酮的提取工藝及抗氧化活性考察[J].中國實驗方劑學雜志，2016，22（6）：12-16.

[責任編輯：袁向芬]

Flavonoid extraction fromIxerischinensis（Thunb） Nakai and its antioxidant activity with DPPH

TAI Wen-jie, CHEN Sheng-ke, GAN Xiu-hai

（School of Chemistry and Life Science, Guizhou Education University, Guiyang, Guizhou, 550018）

The extraction process of total flavonoids fromIxerischinensis（Thunb.）Nakaiisoptimizedbyresponsesurfacemethodologybasedonsinglefactorexperiments.ThenthetotalflavonoidsareextractedanditsantioxidationareevaluatedagainstDPPHfreeradical.Theresultsshowthattheoptimumconditionisasfollows:li-quid-solidratio27∶1,ethanolconcentration58wt.%andextractiontemperature61°C.Inthiscondition,theextractionrateoftotalflavonoidsis116.55mg·g-1.Besides,thetotalflavonoidsofIxerischinensis（Thunb.）NakaipossessgoodscavengingabilityonDPPH.

Ixerischinensis（Thunb.） Nakai; Total flavonoids; Response surface methodology; Antioxidation

2016-11-29

貴州師范學院學生科研項目“山苦荬總黃酮提取及抗氧化活性測定”（項目編號：DXS2016112）。

太文杰（1994-），男，河北陽原人，貴州師范學院在讀本科生，研究方向：中藥化學。

R284.2

A

1674-7798（2016）12-0059-05