王慧遠(yuǎn)，賈維薇，陳慶河

(1.南京市金陵中學(xué)　210005； 2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所)

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轉(zhuǎn)基因植物檢測技術(shù)研究進(jìn)展

王慧遠(yuǎn)1，賈維薇1，陳慶河2

(1.南京市金陵中學(xué)210005； 2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所)

摘要：對國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因植物及產(chǎn)品的檢測技術(shù)進(jìn)行綜述，重點介紹目前使用較廣泛的PCR技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)、基因芯片技術(shù)及其他轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)的原理和特點，并展望今后轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)的發(fā)展趨勢和研究方向。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因植物；檢測技術(shù)；核酸；蛋白質(zhì)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指通過體外重組DNA技術(shù)將外源基因轉(zhuǎn)入到生物體的細(xì)胞或組織中，由于導(dǎo)入基因的表達(dá)引起生物體的性狀可遺傳性修飾，從而使再生生物體獲得新的遺傳特性。這一技術(shù)打破了生物的種間隔離，大大擴(kuò)大了物種之間的基因交流范圍[1]。

自1983年首次報道植物的遺傳轉(zhuǎn)化以來，大批轉(zhuǎn)基因植物新品種不斷涌現(xiàn)，獲得了極大的經(jīng)濟(jì)和社會效益。據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織(ISAAA)統(tǒng)計，2014年全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積為1.815億hm2[2]，這與1996年的1700萬hm2相比，增幅超過10倍。然而，隨著轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的大規(guī)模商業(yè)化，其安全性及對人類健康和生態(tài)環(huán)境的潛在威脅受到國際社會和廣大民眾的廣泛關(guān)注。轉(zhuǎn)基因生物需要進(jìn)行安全評價, 而轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)是其研究和安全管理的基礎(chǔ)和技術(shù)保障。因此,研究轉(zhuǎn)基因動植物產(chǎn)品檢測技術(shù),建立轉(zhuǎn)基因生物安全檢測技術(shù)體系, 成為目前亟待解決的關(guān)鍵問題。

目前轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)主要是基于核酸的檢測方法和基于外源蛋白靶標(biāo)的檢測方法，如PCR法、酶聯(lián)免疫吸附法、生物傳感器、基因芯片等。這些方法在不同轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測應(yīng)用中各有優(yōu)缺點。本文重點綜述轉(zhuǎn)基因植物及產(chǎn)品檢測技術(shù)的研究進(jìn)展，并展望今后轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)的發(fā)展趨勢和研究方向。

1基于核酸的檢測技術(shù)

1.1定性PCR檢測技術(shù)

聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)是20世紀(jì)80年代中期由Mullis發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，廣泛用于外源基因檢測、目的基因標(biāo)記、功能基因分離和克隆等。該技術(shù)以極少量目標(biāo)DNA為模板，加入目標(biāo)基因特異性引物，在DNA聚合酶作用下，由高溫變性、低溫退火及適當(dāng)溫度延伸等幾步反應(yīng)組成一個周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的 DNA片段得以迅速擴(kuò)增。該技術(shù)可根據(jù)目的基因、標(biāo)記基因序列設(shè)計PCR引物，從轉(zhuǎn)基因植株中擴(kuò)增外源基因片段，而非轉(zhuǎn)基因植物基因組則不能擴(kuò)增出相應(yīng)的目標(biāo)片段。目前，PCR技術(shù)被用于轉(zhuǎn)基因大豆[3]、轉(zhuǎn)基因小麥[4-6]、轉(zhuǎn)基因玉米[7]和轉(zhuǎn)基因油菜[8]等植物的檢測。

由于PCR檢測所需的DNA量少、純度要求不高、操作簡單、成本低、實驗安全，是目前轉(zhuǎn)基因檢測不可或缺的方法。但是，PCR檢測易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。引物設(shè)計不合理，外源DNA插入后的重排或變異，靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染等因素都會造成檢測的誤差。而且對于量少和受到嚴(yán)重破壞的核酸樣本，其DNA遭受比較嚴(yán)重的破壞，再加上轉(zhuǎn)基因DNA成分受到大幅度的稀釋，采用普通PCR技術(shù)往往難以檢測，因此提高PCR檢測靈敏度對準(zhǔn)確標(biāo)定食品是否含有轉(zhuǎn)基因成分尤為關(guān)鍵。在普通PCR基礎(chǔ)上發(fā)展而來的巢式和半巢式PCR(nested and semi-nested PCR)檢測技術(shù)，針對同一模板，利用2對引物，進(jìn)行2次特異擴(kuò)增，可顯著提高檢測的特異性和靈敏度，在轉(zhuǎn)基因檢測中得到了應(yīng)用[9]。此外，由于商品化轉(zhuǎn)基因生物的種類不斷增加，所涉及的基因不斷增多，普通PCR檢測技術(shù)1次反應(yīng)只能針對1個目標(biāo)序列，難以滿足轉(zhuǎn)基因成分快速檢測的需求。多重PCR (multiplex PCR) 檢測技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)在同一個反應(yīng)管里進(jìn)行2對或2對以上的引物針對不同的DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，與普通PCR相比，具有提高檢測通量、節(jié)約模板和試劑、縮短檢測時間等優(yōu)點，目前也已經(jīng)被應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因檢測中[10-11]。

1.2定量PCR檢測技術(shù)

目前許多國家實行轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識制度，規(guī)定轉(zhuǎn)基因成分的最低含量閾值，如日本、俄羅斯等國是5%，歐盟是0.9%[12]。因此，必需對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行定量檢測。目前已發(fā)展出以植物內(nèi)源基因作參照的實時熒光定量PCR技術(shù)(RT-PCR)和數(shù)量競爭性PCR(QC-PCR)技術(shù)。

RT-PCR技術(shù)能實現(xiàn)核酸含量的定量檢測，基本原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對待測模板進(jìn)行定量檢測。根據(jù)所采用的熒光基團(tuán)發(fā)光原理的不同，主要分為SYBR Green I熒光染料法和TaqMan探針法。RT-PCR 技術(shù)已成功應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因大豆、玉米和甜菜等作物轉(zhuǎn)基因成分的檢測，其檢測靈敏度可達(dá)0.01%以下[13]。白衛(wèi)濱等[14]用RT-PCR技術(shù)成功檢測出美國、阿根廷、巴西和中國轉(zhuǎn)基因豆粉的轉(zhuǎn)基因成分，其靈敏度為0.001%。王小花等[15]利用RT-PCR方法監(jiān)測大豆轉(zhuǎn)基因成分，檢測限為0.01%。RT-PCR具有重復(fù)性好、靈敏度高、核酸交叉污染少、易于自動化等優(yōu)點，有效解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，但定量標(biāo)準(zhǔn)物研究還相對滯后，且對儀器設(shè)備要求較高，檢測費用昂貴。因此其普及應(yīng)用在一定程度上受到制約。

QC-PCR是一種定量PCR，通過向PCR反應(yīng)體系中加入人工構(gòu)建的帶有突變的競爭模板，以控制競爭模板的濃度來確定目的模板的濃度，對目的模板做定量研究。目前已建立對NOS終止子、CaMV35S啟動子、Roundup Ready大豆等轉(zhuǎn)基因作物的競爭性PCR檢測方法[16-17]。QC-PCR對實驗儀器要求不高，但需要用基因重組技術(shù)構(gòu)建內(nèi)標(biāo)競爭DNA，而且要求做多個標(biāo)準(zhǔn)樣品的對照，對普通實驗室來說難度很大。

1.3環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是Notomi等[18]在2000年開發(fā)的一種新穎恒溫核酸擴(kuò)增方法，其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4種特異引物，利用Bst DNA polymerase聚合酶在等溫條件(65℃)下保溫1 h，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。近年LAMP技術(shù)已廣泛應(yīng)用于包括DNA病毒、RNA病毒、細(xì)菌和寄生蟲等傳染性疾病的定性和定量檢測[19-20]。田芳等[21]應(yīng)用LAMP技術(shù)成功檢測出大豆、豆粕及含有大豆成分的飼料樣品中的CP4-EPSPS基因，靈敏度為PCR方法的100～1000倍。LAMP不需要熱循環(huán), 為等溫擴(kuò)增，擴(kuò)增效率可達(dá)到109～1010數(shù)量級,具有操作簡單、特異性強(qiáng)、等溫靈敏、產(chǎn)物易檢測等優(yōu)點[18]。缺點是引物設(shè)計較為復(fù)雜，對擴(kuò)增產(chǎn)物處理不當(dāng)容易造成DNA污染，影響后續(xù)的實驗結(jié)果。

1.4基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是近年來快速發(fā)展起來的分子生物學(xué)高新技術(shù)。在轉(zhuǎn)基因檢測中，將目前使用的報告基因、啟動子、終止子的特異性片斷制成檢測芯片，與待測產(chǎn)品的DNA進(jìn)行雜交，掃描信號后經(jīng)計算機(jī)軟件分析，實現(xiàn)對生物樣品快速、高效的檢測。Leimanis等[22]建立了針對轉(zhuǎn)基因大豆的CaMV35S、NOS標(biāo)記基因元件的高靈敏度基因芯片檢測技術(shù)?；蛐酒夹g(shù)具有高通量、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點，且可平行檢測1個轉(zhuǎn)基因作物中多個基因或同時檢測多種轉(zhuǎn)基因作物[23]。其缺點是制作基因芯片技術(shù)復(fù)雜，成本高昂，需要專門的儀器設(shè)備，要求操作人員具有較高的專業(yè)素質(zhì)，這些因素限制了該技術(shù)在檢測中的廣泛應(yīng)用。

2基于蛋白的檢測技術(shù)

2.1蛋白免疫印跡雜交技術(shù)

蛋白免疫印跡雜交技術(shù)(Western Blot)是檢測轉(zhuǎn)基因作物外源蛋白表達(dá)的經(jīng)典方法，是一種蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移電泳技術(shù)，其原理是把經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離的目的蛋白原位固定于固相膜上，再用高濃度的蛋白質(zhì)溶液孵育固相膜，然后用含有放射性標(biāo)記或酶標(biāo)記的特定抗體進(jìn)行雜交，使抗原—抗體特異性結(jié)合，最后通過放射自顯影或者顯色觀察外源基因的表達(dá)，根據(jù)檢出結(jié)果可得知目的蛋白是否表達(dá)、濃度大小及分子量大小。Qiu等[24]采用Western blot檢測轉(zhuǎn)基因水稻中稻瘟菌蛋白激發(fā)子的表達(dá)，證明該蛋白的過表達(dá)增強(qiáng)了水稻抗病性。Western blot技術(shù)普遍用于分離、檢測特異的目的蛋白質(zhì)，具有很高的靈敏性。但是其操作過程繁瑣，費用昂貴，適合應(yīng)用于研究，不適用于常規(guī)實驗和大量樣品的檢測。

2.2酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)

酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)(ELISA)是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶的高效催化反應(yīng)有機(jī)結(jié)合起來的一種高靈敏度的檢測技術(shù)。其原理是特殊的抗體被結(jié)合固定在固體表面，如微孔板上，加入樣品，洗去未被結(jié)合的成分。然后加入酶的抗體進(jìn)行抗原檢測，再次洗去未被結(jié)合的成分，樣品中抗原的含量與酶和底物反應(yīng)的顏色成正比。ELISA有直接法、間接法和雙抗夾心法之分，目前使用最多的是雙抗夾心法，其靈敏度最高。該方法已在大豆、辣椒、煙草、水稻等多種轉(zhuǎn)化植株的檢測中應(yīng)用[25-27]。ELISA方法具有簡便、快速、成本低等優(yōu)點，但其準(zhǔn)確性易受復(fù)雜基質(zhì)干擾，檢測范圍受限制。

2.3免疫試紙條檢測技術(shù)

免疫試紙條法是將特異的抗體交聯(lián)到試紙條和有顏色的物質(zhì)上，當(dāng)紙上抗體和特異抗原結(jié)合后，再與帶有顏色的特異抗體進(jìn)行反應(yīng)，形成三明治狀的色帶，如果沒有抗原，則無顏色反應(yīng)。已經(jīng)有商品化的針對大豆、油菜、棉花和甜菜等轉(zhuǎn)基因作物中的抗除草劑基因CP4-EPSPS的檢測試紙條。丁耀魁等[28]采用快速檢測試紙條測定大豆轉(zhuǎn)基因含量，測定時間僅需10 min，結(jié)果準(zhǔn)確，其檢出限可以達(dá)到0.1%。試紙條法優(yōu)點是成本低廉，操作簡單、迅速，不需要特殊的儀器設(shè)備，適用于現(xiàn)場檢驗或初篩。但是該方法的缺點是檢測范圍較小，加工后的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)抗原性容易被破壞，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.4蛋白質(zhì)芯片技術(shù)

蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是繼基因芯片技術(shù)后發(fā)展起來的生物檢測技術(shù)，是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中除了酵母雙雜交、雙向電泳技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)等之外的一種重要的工具。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是將已知序列的蛋白、多肽分子、抗原、抗體、酶以預(yù)先設(shè)計的方式固定在硝酸纖維素膜、玻璃、硅片等載體上排列，待熒光標(biāo)記的靶分子和探針分子結(jié)合后，利用激光掃描系統(tǒng)對熒光信號進(jìn)行強(qiáng)度檢測分析。該技術(shù)目前主要用于藥物學(xué)、臨床、細(xì)胞周期調(diào)控等領(lǐng)域，同時為轉(zhuǎn)基因植物蛋白的檢測提供了有效手段[29]。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)具有快速、平行、自動化等優(yōu)點，且檢測到的平行數(shù)據(jù)誤差更小、更準(zhǔn)確，這對于高通量研究具有非常重要的意義。

3展望

轉(zhuǎn)基因技術(shù)被稱為“人類歷史上應(yīng)用最為迅速的重大技術(shù)之一”。同時，轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的核心，在緩解資源約束、保障食物安全、保護(hù)生態(tài)環(huán)境、拓展農(nóng)業(yè)功能等方面已顯現(xiàn)出巨大潛力。轉(zhuǎn)基因技術(shù)既給人類帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)效益，同時也引發(fā)了社會關(guān)于轉(zhuǎn)基因植物安全性問題的爭議。轉(zhuǎn)基因成分檢測技術(shù)是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全性管理和標(biāo)識的技術(shù)保障，也是消除公眾對轉(zhuǎn)基因植物安全質(zhì)疑的重要環(huán)節(jié)。近年來，雖然不斷有新的檢測技術(shù)出現(xiàn)，但大多數(shù)方法處于發(fā)展階段，還不能有效地運用到實際工作中。所以，亟待建立快速、有效、準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)體系，使轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)向高通量、高靈敏度、自動化的方向發(fā)展。

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(責(zé)任編輯：林蕓青)

收稿日期：2015-12-15

作者簡介：王慧遠(yuǎn)，女，1997年生。

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2016.01.026

Research progress on the detecting technique of transgenic plants

WANG Hui-yuan1, JIA Wei-wei1, CHEN Qing-he2

(1.JinglingHighSchool,JiangsuProvince210005; 2.InstituteofPlantProtection,FujianAcademyofAgriculturalSciences,FujianProvince350003)

Abstract:Detecting technique for transgenic plants and products home and abroad were summarized, emphatically introduced the principal and character of widely applied technologies, including Polymerase chain reaction (PCR) technique, Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique, Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technique, gene chip technique and other detecting technique, and the developing trends and research directions were proposed in this paper.

Key words:Transgene plant; detecting technique; nucleic acid; protein