狄貫騰，　王莎莉

(重慶醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究中心，重慶　400016)

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不同光照對雌性抑郁大鼠生殖系統(tǒng)的影響

狄貫騰，王莎莉△

(重慶醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究中心，重慶400016)

[摘要]目的： 研究不同光照對雌性抑郁大鼠生殖系統(tǒng)的影響。方法: 將35只已成功建立抑郁模型的成年SPF級SD雌性大鼠隨機分為抑郁模型組、微波硫燈組、熱輻射燈組、日光燈組和LED燈組，并設(shè)立健康成年SPF級SD雌性大鼠為對照組，每組7只。在連續(xù)光照45 d后，陰道涂片法檢測生殖周期，計算子宮和卵巢臟器系數(shù)比，ELISA方法檢測血清中雌二醇(E2)、催乳素(PRL)、孕酮(PROG)及雄激素睪酮(T)含量，HE染色觀察卵巢的組織病理學(xué)。結(jié)果: 與對照組相比，抑郁模型組大鼠生殖周期嚴重紊亂，子宮和卵巢臟器系數(shù)比明顯下降(P<0.05)，E2、PRL、PROG及T的含量降低(P<0.05)，卵巢充血嚴重。微波硫燈照射可以改善雌性抑郁大鼠的生殖周期，上調(diào)E2、PRL、PROG及T水平，減輕卵巢充血組織病理學(xué)改變，熱輻射燈、日光燈和LED燈照射對雌性抑郁大鼠的生殖周期、性激素水平及卵巢組織病理學(xué)變化沒有明顯作用。結(jié)論: 微波硫燈照射可以改善雌性抑郁大鼠的生殖功能。

[關(guān)鍵詞]光照； 雌性抑郁大鼠； 生殖； 硫燈； 性激素

抑郁癥是多種因素引起的、以顯著持久的心境低落為主要特征的精神障礙，具有患病率高，復(fù)發(fā)率高，自殺率高的特點。據(jù)WHO統(tǒng)計，抑郁癥已經(jīng)成為世界第四大疾患[1]，且每年發(fā)病都有逐步增高的趨勢，到2020年可能成為僅次于心臟病的第二大疾病。對其發(fā)病機制和有效防治方法的研究，已成為社會科學(xué)和生命科學(xué)共同關(guān)注的重大課題，具有特殊的重要性和迫切性。從性別角度來講，女性抑郁癥的患病率遠高于男性，這可能是由于女性多愁善感、抗壓能力弱、在社會中處于從屬地位等原因造成的[2]。抑郁癥發(fā)病與遺傳、競爭壓力、環(huán)境等多種因素相關(guān)，光照就是其中不容忽視的環(huán)境因素，例如低日照地區(qū)抑郁癥的發(fā)病率就明顯高于高日照地區(qū)[3]。因此光療也就成為目前臨床上治療抑郁癥常用的輔助手段，但是臨床上光照種類多，強度從100 lx到10 000 lx，光波長從470 nm到660 nm不等，光照后的效果有差異[4-6]，也未見利用不同光照來觀察對抑郁大鼠生殖系統(tǒng)影響的研究。因此我們選用了生活中最常用的4種光源，即熱光源的微波硫燈(sulfur lamp；全光譜，模擬人工太陽浴)和熱輻射燈(heat radiation lamp;俗稱浴霸)以及冷光源的日光燈(fluorescent lamp)和發(fā)光二極管(light-emitting diode，LED)燈，觀察它們對雌性抑郁大鼠的生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能的影響。

材料和方法

1實驗動物

健康成年雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠共60只，體重180～200 g，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物許可證號為SCKK(渝)2005-0001，飼養(yǎng)于SPF系統(tǒng)內(nèi)。環(huán)境溫度22～25 ℃，相對濕度50%～70%。

2主要儀器和試劑

實驗用燈(重慶大學(xué)城建與規(guī)劃學(xué)院提供)參數(shù)：微波硫燈(光亮度3 100 cd/m2，色溫6 900 K，均勻度0.82)，熱輻射燈(光亮度1 160 cd/m2，色溫2 466 K，均勻度0.74)，日光燈(光亮度3 120 cd/m2，色溫 6 500 K，均勻度0.84)，LED燈(光亮度3 100 cd/m2，色溫6 500 K，均勻度0.79)；ELISA試劑盒(上海基免生物科技有限公司)；真空促凝采血管(上?？迫A檢驗醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)；HE染色試劑盒(北京藍博斯特生物技術(shù)有限公司)。

3主要方法

3.1抑郁大鼠CUMS模型的建立及分組60只實驗大鼠在進行行為學(xué)測試[曠場實驗(計算總運動得分,即水平運動得分+垂直運動得分)、強迫游泳實驗(記錄不動時間)和糖水偏好實驗(計算24 h糖水偏愛百分比即糖水消耗量/消耗總量)]后，從中隨機選取7只為對照組(不給予任何刺激，自由攝食和飲水)，其余53只大鼠進行抑郁模型的建立。將建模成功的大鼠隨機分為抑郁模型組(建模后不進行處理)、微波硫燈光照組、熱輻射燈光照組、日光燈光照組和LED燈光照組，每組7只。接受35 d的慢性、輕度、不可預(yù)見性的應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)。應(yīng)激形式有夾尾1 min、電刺激1 h(1～2 mA，1～10 s，1 Hz)、禁水24 h、禁食24 h、5 ℃冰水游泳5 min、晝夜顛倒24 h、水平震蕩5 min、40 ℃環(huán)境暴曬5 min、鼠籠45°角傾斜24 h和濕墊料24 h。10種刺激隨機分布到35 d中，每種出現(xiàn)3～4次，同種刺激3 d內(nèi)不連續(xù)出現(xiàn)，建模期間同時進行一般行為學(xué)的觀察(體重、攝食、精神狀態(tài)和理毛情況)，建模35 d后，再次進行曠場實驗、強迫游泳實驗和糖水偏好實驗測試，各組大鼠此3項測試數(shù)據(jù)結(jié)果在建模前后的差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)可判斷為建模成功[7-9]。從中選取7只作為抑郁模型組大鼠，建模后不進行光照處理。

3.2光照處理從建模成功的大鼠中選取28只大鼠隨機分為4組，置于溫度24～26 ℃，相對濕度65%～66%的環(huán)境中，每日12:00～14：00點分別進行微波硫燈、熱輻射燈、日光燈和LED燈照射，連續(xù)照射45 d。光照期間每天對實驗動物進行一般行為學(xué)觀察。

3.3生殖周期的檢測(陰道涂片)用沾有生理鹽水的細棉簽在大鼠的陰道內(nèi)輕旋2圈，然后均勻涂在干凈的載玻片上，在200倍光鏡下觀察陰道脫落細胞的形態(tài)，照像。

3.4血清中性激素含量的檢測光照結(jié)束后第20天開始，每天根據(jù)陰道涂片檢測結(jié)果，選出處于動情期的大鼠，稱重后，水合氯醛麻醉，心臟采血，分離血清，置于-20 ℃冰箱冷凍保存。ELISA方法檢測血清中雌二醇(estradiol，E2)、催乳素(prolactin，PRL)、孕酮(progesterone, PROG)及雄激素睪酮 (testosterone，T)的濃度(檢測由上海基免生物科技有限公司進行)。

3.5生殖系統(tǒng)標本的采集采血后迅速摘取其子宮和卵巢，剝?nèi)テ渲車闹竞徒Y(jié)締組織后稱重，然后立即置于4%多聚甲醛中固定，計算子宮和卵巢的臟器系數(shù)(子宮重/體重×100%；卵巢重/體重×100%)。

3.6卵巢的形態(tài)學(xué)觀測常規(guī)石蠟包埋卵巢，切片，蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosinstaining，HE) 染色，光鏡下觀察,于每組7個動物標本中隨機選取5個進行切片制作，每個標本制作6～8個切片，于100倍光鏡下觀察4個視野,照相,從中選取最為典型的視野進行分析。

4統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。用均數(shù)±標準差(mean±SD)的形式來表示數(shù)據(jù)，各組數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗服從正態(tài)分布且組間方差齊同后，采用單因素方差(one-way ANOVA)分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1一般情況

抑郁模型組與對照組相比，攝食量減少，體重增長緩慢，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，理毛次數(shù)明顯減少，4種光照后，這些情況得到一定程度改善，見表1。

2抑郁模型組及光照組大鼠建模前后行為學(xué)測試

各組大鼠建模后曠場實驗、強迫游泳實驗和糖水偏好實驗測試評分結(jié)果與建模前相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，見表2。

表1各組大鼠建模前后及光照后的體重

Table 1.The weight of the rats in each group after modeling and lighting (g. Mean±SD.n=7)

Group5dbeforestressing35dafterstressing45dafterlightingControl189±23235±23262±52*Depressivemodel219±37226±15243±17Sulfur190±41201±28232±18*#Heatradiation192±61205±33240±24*Fluorescent181±48208±26242±49*#LED218±41222±25246±18*

*P<0.05vs5 d before stressing;#P<0.05vs35 d after stressing.

表2大鼠建模前后曠場實驗、糖水偏好實驗和強迫游泳實驗測試結(jié)果

Table 2.The results of open field test, sucrose preference test and force swimming test of the rats in each group before and after mo-deling (Mean±SD.n=7)

GroupNumberofcrossingsPercentageofsucroseconsumption(%)Unmobilitytime(s)BeforestressingAfterstressingBeforestressingAfterstressingBeforestressingAfterstressingDepressivemodel169±1888±51*96.6±1.777.9±7.9*18±1736±16*Sulfur175±1994±13*94.5±3.578.4±6.6*7±730±18*Heatradiation170±1389±51*95.1±2.476.9±8.7*21±2043±21*Fluorescent159±1884±41*94.3±3.579.7±5.2*15±1832±16*LED173±2161±18*93.5±3.881.9±6.9*15±1443±29*

*P<0.05vsbefore stressing.

3不同光照對雌性抑郁大鼠動情周期的影響

對照組動情周期規(guī)律一致，約為4～5 d，抑郁模型組動情周期呈現(xiàn)嚴重紊亂，主要體現(xiàn)為動情期紊亂，持續(xù)時間長短不一，長為8 d，短則3 d； 微波硫燈組動情周期較為一致，約為4～6 d；熱輻射燈組、日光燈和LED燈組動情周期明顯延長約6～8 d。各組未見細胞形態(tài)的明顯變化。動情周期各時期陰道脫落細胞典型涂片見圖1。

Figure 1.The vaginal exfoliated cells from the rats during the estrous cycle (vaginal smears， ×200).

圖1大鼠動情周期各時期陰道脫落細胞形態(tài)

4不同光照對雌性抑郁大鼠血清中E2、PRL、PROG和T濃度的影響

抑郁大鼠4種激素在血清中濃度與對照組相比均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)。光照后，微波硫燈組4種激素濃度明顯升高，與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，其它光照沒有明顯作用，見表3。

5不同光照對雌性抑郁大鼠卵巢和子宮臟器系數(shù)的影響

建模后抑郁大鼠的卵巢和子宮臟器系數(shù)與對照組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)。4種光照后，卵巢臟器系數(shù)與對照組比明顯降低(P<0.05)；子宮臟器系數(shù)與對照組間的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見表4。

表3　各組大鼠血清中E2、 PRL、PROG及T的濃度

*P<0.05vscontrol group.

表4光照后各組大鼠卵巢和子宮的臟器系數(shù)

Table 4.The ovary index and uterus index of rats in each group

after lighting (%. Mean±SD.n=7)

GroupOvaryindexUterusindexControl0.188±0.1540.38±0.18Depressivemodel0.055±0.011*0.22±0.03*Sulfur0.059±0.010*0.32±0.07Heatradiation0.056±0.019*0.39±0.11Fluorescent0.067±0.008*0.34±0.15LED0.059±0.021*0.42±0.16

*P<0.05vscontrol group.

6不同光照對抑郁大鼠卵巢組織病理學(xué)的影響

圖2可見，對照組卵巢組織致密，可見各期卵泡、卵丘，黃體發(fā)育正常，細胞形態(tài)完整、排列整齊、層次分明，未見充血水腫；抑郁模型組卵巢組織疏松，黃體體積膨大，組織間隙大量充血以髓質(zhì)最為嚴重，細胞排列分散、胞核固縮且細胞間隙大量充血，未見細菌感染所致的炎癥反應(yīng)；微波硫燈組卵巢組織致密，可見不同時期卵泡及發(fā)育正常的黃體，細胞形態(tài)完整、排列整齊，未見明顯充血水腫及炎癥反應(yīng)；熱輻射組、日光燈組和LED組的卵巢組織疏松，黃體退化，組織不同程度的充血水腫，以熱輻射組改變最明顯。各組均未見細菌感染所致的炎癥反應(yīng)。

Figure 2.HE staining of ovarian tissues from the rats in each group (×100).

圖2各組大鼠卵巢組織HE染色結(jié)果

討論

臨床研究表明，抑郁患者性激素分泌紊亂[10-11]，這在動物實驗中也得到了一些證實。如抑郁大鼠的性激素水平全面降低[12]，同時抑郁是導(dǎo)致雌性大鼠動情周期紊亂的一個關(guān)鍵性因素[13-14]。我們得到了與這些學(xué)者相似的結(jié)果，在實驗中觀察到雌性抑郁大鼠動情周期紊亂；子宮和卵巢的臟器系數(shù)比降低，卵巢下降的程度更為明顯，提示卵巢與子宮有萎縮現(xiàn)象，在此基礎(chǔ)上部分卵巢伴隨充血性病理學(xué)變化；血清中E2、T、PRL和PROG的濃度明顯降低。這些結(jié)果都提示抑郁癥大鼠伴隨卵巢與子宮的結(jié)構(gòu)與功能的病理性改變。

光照可以改善動物的生殖功能，如王秋菊等[15]發(fā)現(xiàn)增加自然光光照時間能提高母鵝血清卵泡刺激素、黃體生成素和PRL水平，并接近對照組鵝繁殖期的性激素水平，Mason等[16]發(fā)現(xiàn)短日照會抑制倉鼠的繁殖。光照可以調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸，從而調(diào)節(jié)生殖功能[17]，但是光照對抑郁大鼠的生殖功能的影響知之甚少。我們通過陰道涂片觀察到光照后對陰道脫落細胞的形態(tài)沒有明顯的影響，但可調(diào)整動情周期。微波硫燈照射后抑郁大鼠的動情周期調(diào)整為4～6 d，基本接近對照組；熱輻射燈組、日光燈和LED燈組盡管有一定的改善，但周期仍明顯延長，約6～8 d。

卵巢是個復(fù)雜的內(nèi)分泌器官，卵泡的發(fā)育、成熟、排卵、黃體的形成和退化不僅受下丘腦-腺垂體-卵巢軸的調(diào)節(jié)，也分泌不同的性激素來調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜和陰道上皮細胞的周期性變化。大鼠的動情期包括，動情前期(相當于人類月經(jīng)周期的卵泡期，卵泡快速生長)、動情期(相當于排卵期，卵泡發(fā)育成熟并排卵)、動情后期(相當于黃體期，黃體生成并逐漸成熟)和動情間期(相當于月經(jīng)期，黃體退化并向卵泡期轉(zhuǎn)換)，所以動情周期陰道上皮細胞的變化規(guī)律可以直接反映卵巢的功能和生殖功能。抑郁癥大鼠動情期時間的紊亂、延長，提示其卵巢的功能可能較低，性激素的水平可能下調(diào)，而微波硫燈照射后抑郁大鼠動情周期的明顯改善可能與改善大鼠的卵巢功能相關(guān)。因此，我們進一步檢測了血清中雄激素和雌激素水平及卵巢的組織學(xué)改變，實驗得到了與動情周期一致的變化結(jié)果，微波硫燈照射提高了抑郁大鼠的E2、PRL、PROG和T水平,明顯降低卵巢的充血性病理改變；而暖光燈、日光燈和LED燈對雌性抑郁大鼠的生殖周期和性激素水平，以及卵巢組織病理學(xué)變化沒有明顯作用。

微波硫燈照射改善抑郁大鼠的生殖功能的機制可能與微波硫燈的特性及褪黑素有關(guān)。微波硫燈是模擬的人工小太陽，能夠發(fā)射出類似太陽光的連續(xù)光譜，它包括了暖光燈、日光燈和LED燈等光譜能源范圍，是人最適應(yīng)也是最能夠接受的光源，能夠滿足抑郁癥患者對陽光的需要[18-19]。研究發(fā)現(xiàn)褪黑素是松果體等所分泌的光敏感激素，光照可以上調(diào)褪黑素的含量[20]，如外源性褪黑素可以逆轉(zhuǎn)大鼠卵巢多囊樣改變[21]。Lee等[22]應(yīng)用RT-PCR及原位PCR技術(shù)檢測到，MT受體MelR基因在出生后即刻就在卵巢顆粒細胞上表達，原始卵泡和閉鎖卵泡上弱表達，系膜細胞上不表達。卵巢上有褪黑素高親和力的受體[23]。這些研究都提示褪黑素在卵巢的發(fā)育與功能發(fā)揮上起著至關(guān)重要的作用。我們前期的實驗也證明了微波硫燈照射后可以明顯上調(diào)褪黑素，而暖光燈、日光燈和LED燈上調(diào)褪黑素作用不明顯。所以我們認為微波硫燈照射后可能通過上調(diào)褪黑素，后者作用于卵巢上的褪黑素受體，改善卵巢功能，最終改善了抑郁大鼠的生殖功能。但是這些還需要后期的實驗進一步證明。

在研究中我們還發(fā)現(xiàn)，盡管4種光照都可以改善子宮的臟器系數(shù)，但對卵巢的臟器系數(shù)作用不明顯，這可能是與光照后功能的恢復(fù)比結(jié)構(gòu)的恢復(fù)更快有關(guān)。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)

神經(jīng)肽腦活素療法可改善阿爾茨海默病APP轉(zhuǎn)基因模型中神經(jīng)干細胞移植物的存活狀況

神經(jīng)干細胞(NSCs)已被證實在阿爾茨海默病(AD)的治療上具有一定的潛力，但因其移植后的存活能力差而使它的應(yīng)用受到阻礙。對移植的干細胞補給神經(jīng)營養(yǎng)因子可以作為促進干細胞存活的一種方法。Rockenstein等研究了腦活素(Cerebro-lysin, CBL；一種具有神經(jīng)營養(yǎng)作用的肽混合物)在APP轉(zhuǎn)基因(tg)AD模型中輔助干細胞治療的作用。對移植有小鼠NSCs的APP tg AD和非轉(zhuǎn)基因(non-tg)小鼠均用CBL進行了干預(yù)，分別在1、3、6和9個月后取海馬組織進行分析。相比non-tg小鼠，APP tg AD小鼠腦中NSCs存活數(shù)量較少；而CBL處理可以促進這2組小鼠腦中NSCs的存活，且大部分存活的NSCs維持神經(jīng)母細胞的形態(tài)。經(jīng)CBL處理的小鼠的NSCs表現(xiàn)為caspase-3陽性和TUNEL陽性細胞數(shù)目減少，而腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和弗林蛋白酶(furin)的免疫組化陽性增強。這些結(jié)果表明，CBL可能對移植的NSCs具有保護功能， 從而在NSCs移植治療AD的過程中可能起到輔助作用。

Stem Cell Res, 2015, 15(1):54-67(黃翠芹)

Effects of different lighting on reproductive system in depressive female rats DI

Guan-teng, WANG Sha-li

(InstituteofNeuroscience,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:cqykdxwangshali@cqmu.edu.cn)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effects of different lighting on the reproductive system in depressive female rats. METHODS: Healthy adult female rats were randomly chosen as control group, and the depressive adult female rats in SPF grade were randomly divided into 5 groups (7 rats each): depressive model group, sulfur lamp group, heat radiation lamp group, fluorescent lamp group and LED lamp group. After 45 d of continuous illumination, the estrous cycle was observed by the vaginal exfoliated cells, and the organ indexes of ovary and uterus were calculated. The concentrations of estiadrol (E2), prolactin (PRL), progesterone (PROG) and testosterone (T) in the serum were detected by ELISA, and the histopathological lesion of ovary was observed under microscope with HE staining. RESULTS: The estrous cycle exhibited serious disorder, the ovaries exhibited serious congestion, and the organ indexes of ovary and uterus and the concentrations of E2, PRL, PROG and T decreased significantly in the rats in depressive model group compared with control group (P<0.05). The estrous cycle and histopathological damage of ovary were obviously improved, and the concentrations of E2, PRL, PROG and T were significantly increased after the sulfur lamp lighting in the depressive female rats compared with depressive model group. No obvious change and improvement of the reproductive functions in the heat radiation lamp group, fluorescent lamp group and LED lamp group was observed. CONCLUSION: The reproductive functions of depressive female rats are improved by sulfur lamp lighting.

[KEY WORDS]Lighting; Depressive female rats; Reproduction; Sulfur lamp; Sex homone

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.020

[中圖分類號]R363

[文獻標志碼]A

通訊作者△Tel: 023-68892728; E-mail: cqykdxwangshali@cqmu.edu.cn

[收稿日期]2015- 10- 12[修回日期] 2015- 12- 10

[文章編號]1000- 4718(2016)03- 0510- 06

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