李樹清,　李　凡,　何　亮，　何　波

(昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室, 云南 昆明 650050)

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缺血后適應(yīng)促進樹鼩血栓性腦缺血時緊密連接occludin/ZO-1蛋白表達(dá)及抑制腦水腫的機制*

李樹清△,李凡,何亮，何波

(昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室, 云南 昆明 650050)

[摘要]目的： 研究腦缺血及缺血后適應(yīng)(postconditioning,PC)條件下，樹鼩腦缺血時局部腦血流(regional cerebral blood flow，rCBF)、腦水腫及緊密連接(tight junction，TJ)的occludin和zonula occludins(ZO)-1蛋白表達(dá)的改變；探討TJ表達(dá)對腦水腫及腦梗死的影響及其可能機制。方法: 將72只健康成年樹鼩隨機分為對照組、腦缺血組和腦缺血+PC組，其余3只動物用于磁共振成像(MRI)觀察。通過光化學(xué)反應(yīng)誘導(dǎo)樹鼩局部血栓形成；缺血PC組于缺血后4 h夾閉患側(cè)頸總動脈3次(每次5 min)實施PC處理。用電鏡觀察神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)，用TUNEL法檢測海馬神經(jīng)元的凋亡數(shù)量，用激光多普勒血流監(jiān)測儀檢測缺血區(qū)的rCBF，用免疫組化及Western blot法觀察缺血海馬occludin/ZO-1蛋白的表達(dá)，MRI技術(shù)監(jiān)測腦梗死體積，組織干濕法檢測腦含水量的改變。結(jié)果: 樹鼩腦缺血后海馬CA1區(qū)的正常神經(jīng)元明顯減少以及神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)明顯異常。腦缺血組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加(P<0.01)，rCBF明顯降低，occludin/ZO-1表達(dá)減弱(P<0.01)，腦含水量和腦梗死體積明顯增加(P<0.01)。經(jīng)PC處理的動物，缺血區(qū)rCBF增加，TJ表達(dá)增強，腦含水量降低，且TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)和腦梗死體積明顯減小(P<0.01)。結(jié)論: 缺血PC可增加樹鼩缺血區(qū)rCBF但不增加局部含水量；提示缺血PC縮小腦梗死體積可能與occludin/ZO-1表達(dá)增強而抑制腦水腫有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]光化學(xué)反應(yīng)； 腦缺血； 腦水腫； 后適應(yīng)； 緊密連接蛋白； 磁共振成像； 樹鼩

缺血性腦損傷是危害人類健康的主要疾病，也是國際腦保護研究所關(guān)注的重點領(lǐng)域。迄今腦保護研究多集中于采用各種神經(jīng)保護劑的神經(jīng)元保護上，而實際效果并不十分明顯。近年的研究提示，非藥物干預(yù)是一種可以快速而簡便地使大腦免受缺血損傷的新舉措，即缺血后適應(yīng)(postconditioning，PC)。臨床實踐證明，缺血PC 技術(shù)簡便，可通過止血帶或膨脹的血壓計袖帶快速實施，還可使國內(nèi)外倡導(dǎo)腦缺血治療的6 h時間窗延至24 h。而“神經(jīng)元-血管單元”概念的提出則為進一步闡明缺血PC在腦缺血非藥物干預(yù)的病理生理機制提供了可供探索的廣闊空間，這一全新的治療策略將使長期以來以治標(biāo)為主的神經(jīng)元保護向標(biāo)本兼治的血管保護邁出重要的一步[1-2]。研究表明，腦缺血時由于血管阻塞而導(dǎo)致局部腦血流(regional cerebral blood flow，rCBF)明顯降低，血腦屏障(blood brain barrier，BBB)因此而嚴(yán)重受損；實施PC處理增加缺血區(qū)rCBF的同時是否促進或加劇腦水腫的發(fā)生發(fā)展，尚不明確。鑒于微血管緊密連接(tight junction，TJ)的occludin/zonula occludins (ZO)-1蛋白在維持BBB的正常及“神經(jīng)元-血管單元”中具有重要作用，本文采用生物學(xué)特征與獼猴相近的樹鼩復(fù)制血栓性腦缺血模型，在觀察腦缺血改變的3項關(guān)鍵指標(biāo)(rCBF、腦含水量及腦梗死體積)的基礎(chǔ)上，用磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)技術(shù)監(jiān)測梗死范圍，借以探討缺血PC對occludin/ZO-1表達(dá)的影響及其腦保護的可能機制，為揭示腦缺血時“神經(jīng)元-血管單元”的修復(fù)提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1實驗動物和分組

健康成年樹鼩72只，雌雄不拘，體重(120±20)g；隨機分為假手術(shù)對照組(只手術(shù)而不做光化學(xué)反應(yīng))；腦缺血組及缺血PC組。另取3只動物做MRI觀察。

2主要實驗儀器和試劑

SQ-Ⅲ型腦血栓形成裝置(本室研制)[3]由光源(含濾波電路及觸發(fā)器)、萬能支架、數(shù)控光源、散熱裝置以及光學(xué)系統(tǒng)(包括干涉濾鏡及聚光透鏡)組成。光源中心波長(λ)560 nm, 帶寬(Δλ)60 nm，光強度(1.0 W/cm2)，用時間繼電器控制照射時間。Nikon-MiVnt顯微圖像分析系統(tǒng)(Nikon)； PeriFlux System 5000型雙通道激光多普勒(laser Doppler,LD)血流測定儀、PF5010模塊和接觸式探頭(Perimed)；額定電壓220～240 V，50～60 Hz，70 μA。探頭最大輸出功率 1 mW，波長780 nm；Leica RM2135石蠟切片機； HPIA-2000高清晰度病理圖文分析系統(tǒng)(同濟大學(xué))；YT-6B組織貼片機和YT-6B組織包埋機(湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)研究所)；JEM-1011型電子顯微鏡(HITACHI)。

孟加拉紅(Rose Bengal)為Fluka產(chǎn)品，以0.85%生理鹽水溶解，濃度為1.5 g/L，避光4 ℃保存。鼠抗人occludin 抗體(Santa Cruz)； ZO-1多克隆抗體(Invitrogen)。即用型免疫組化ElivisionTMPlus 廣譜試劑盒、II抗即用型快速免疫組化MaxVisionTM試劑盒、過氧化物酶阻斷劑、多聚賴氨酸、DAB顯色液及PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；Tris-HCl抗原修復(fù)液購自云科生物工程公司，以蒸餾水溶解，濃度10 mmol/L，臨用前0.5 mol/L HCl調(diào)整pH至10.0。

3方法

3.1樹鼩腦缺血及缺血PC模型的建立參考本室方法[3]將樹鼩用2.5% 硫噴妥鈉麻醉(40 mg/kg)，臥位固定動物并消毒皮膚，矢狀切開右頂部皮膚約1 cm，暴露右側(cè)顱骨，細(xì)心分離軟組織以免損傷顱骨表面影響其透光性。于切口處嵌入一外徑為1 cm×2.5 cm的消毒銅片，其中心含一直徑為0.5 cm的窗孔，以便光束通過該窗孔直接照射于顱骨表面，銅片以外的組織用避光紙遮蓋。至此，于實驗組舌下靜脈一次注入濃度為15 g/L的孟加拉紅1.33 mL/kg體重，循環(huán)10 min；對照組注射等量NS。將樹鼩置于SQ-Ⅲ型腦血栓形成實驗裝置下，立體定位，在光強度為1.0 W/cm2，顱骨表面溫度(36±1)℃條件下照射10 min，照畢，縫合皮膚、保溫待動物清醒后放回飼養(yǎng)籠觀察。在上述局部腦缺血模型基礎(chǔ)上建立腦缺血PC模型[3-4]，于既定時點(4 h)前40 min再次麻醉動物、仰臥固定，分離缺血側(cè)頸總動脈(保護迷走神經(jīng))，以無創(chuàng)動脈夾在甲狀軟骨上緣平面夾閉頸總動脈5 min/再灌5 min，重復(fù)3次以復(fù)制缺血PC模型，同時檢測rCBF的變化；24 h再次麻醉動物并檢測有關(guān)指標(biāo)。

3.2海馬神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)觀察光化學(xué)反應(yīng)后4 h及24 h，將實驗動物麻醉、斷頭取腦，肉眼直接觀察光化學(xué)反應(yīng)區(qū)腦皮層可見一直徑約0.5 cm的缺血水腫區(qū)，其改變以缺血24 h為著。正常腦組織的TTC染色呈現(xiàn)紅色，而梗死區(qū)則呈蒼白色，界限較清晰；缺血PC組的梗死面積較缺血組的明顯縮小，采用CAD制圖軟件測定梗死面積占半腦面積的百分比。腦缺血后24 h及缺血PC處理后24 h再次麻醉動物，開胸并剪開心包，自心尖部插入一聚乙烯管使其進入升主動脈并結(jié)扎固定；剪開右心耳，在120 mmHg壓力下灌注10%甲醛200 mL行內(nèi)固定2 h。將內(nèi)固定的大腦開顱取出并用新配制的10%甲醛溶液再固定24 h，于視交叉后1.7～4.0 mm(海馬齒狀回互包平面)行冠狀切片，取中間切塊逐級脫水、透明、浸蠟，常規(guī)石蠟包埋制成蠟塊標(biāo)本進行常規(guī)HE染色用于光鏡下觀察；每組動物于規(guī)定時間麻醉，按上述方法用3.5%戊二醛內(nèi)固定，小心開顱骨并取出缺血側(cè)(右側(cè))海馬置于3.5%戊二醛內(nèi)保存，磷酸鹽緩沖液沖洗后，丙酮酸逐級脫水，1%四氧鋨酸固定24 h，LKBS型超薄切片機半薄切片定位，再作檸檬酸鉛醋酸鈾雙染色，在JEM-1011型電子顯微鏡觀察海馬超微結(jié)構(gòu)。

3.3TACS?原位凋亡檢測(TUNEL法)室溫條件下將蠟塊標(biāo)本連續(xù)切片(厚度5 μm)，用多聚賴氨酸原液預(yù)處理的載玻片移至55 ℃恒溫箱內(nèi)4 ～ 6 h；依次置入100%、95%及70%乙醇溶液內(nèi)洗片(每次5 min)；再移入去離子水I、II內(nèi)各2 min水化，分別在PBS及proteinase-K工作液室溫孵育；去離子水洗切片2次；3% H2O2室溫孵育、PBS沖洗后將切片移入1×TdT labeling buffer孵育5 min，加入labeling reaction mix工作液溫育、PBS洗片2次，加入DAB工作液顯色8 min，光鏡下觀察到細(xì)胞核染色滿意時，用去離子水I、II終止顯色，并用1.0%甲基綠溶液溫育4 min進行核復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。自然干燥、避光保存，以備觀察。TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)為細(xì)胞核表達(dá)棕黃色，高倍鏡下(×400)，在每張切片海馬CA1區(qū)隨機各選取3個視野，用0.1尺形目鏡計數(shù)每mm線性長度TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)，以每3個視野的平均值作為TUNEL陽性細(xì)胞的平均值。

3.4rCBF監(jiān)測采用LD血流監(jiān)測儀經(jīng)顱測量rCBF。將麻醉的樹鼩固定于立體定位儀上，以法蘭克福平面(耳眼水平面)作為立體定位坐標(biāo)系統(tǒng)的基礎(chǔ)，于缺血PC后24 h用Perimed提供的Perisoft配套軟件進行曲線輸出記錄，血流儀將采集信號轉(zhuǎn)換成血流灌注單位(perfusion unit，PU)=CMBC(一定體積內(nèi)細(xì)胞的分布率)×V(平均血細(xì)胞的移動速率)，選取穩(wěn)定記錄血流曲線300 S，所有數(shù)據(jù)取平均值為rCBF。經(jīng)儀器對接收光纖接收到的反射激光進行分析處理后并顯示灌注量值即PU，PU是一個表示測量深度內(nèi)大小的相對單位，PU值的變化直接反映了rCBF的改變。

3.5免疫組化和Western blot檢測occludin/ZO-1蛋白表達(dá)采用MaxVision快捷法進行免組化染色。取上述腦組織石蠟切片常規(guī)烘烤、脫蠟及脫水待用。高壓修復(fù)抗原，將水洗后的切片浸泡于0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中，在壓力鍋內(nèi)加熱至沸騰(10 min)；將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫染色架上，放入已沸騰的緩沖液內(nèi)繼續(xù)加熱至工作溫度和工作壓力(噴汽)2 min后，壓力鍋離開熱源數(shù)分鐘，沖淋冷卻蒸餾水沖洗2次。3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗3 min×3次，非免疫小牛血清封閉抗原(10 min)，甩去血清，用PBS(pH 7.4)沖洗除去PBS液，每張切片加50 μL的第 I 抗體(1∶100稀釋)，4 ℃冰箱下孵育過夜。PBS沖洗5 min 3次除去PBS液，每張切片加50 μL酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物( II 抗)，室溫下孵育15 min。PBS沖洗，加50 μL新鮮配制的DAB液顯色，顯微鏡下觀察5 min。自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，用0.1% HCl分化，自來水沖洗返藍(lán)。切片經(jīng)梯度脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。用正常腦組織作對照,以PBS 代替 I 抗作為陰性對照。

取正常及缺血的海馬組織行Western blot檢測。用PBS沖洗組織，加入SDS(50 mmol/L Tris·HCl，pH 6.8,100 mmol/L二硫蘇糖醇,2% SDS,0.1%溴酚藍(lán),10%甘油)，沸水煮熱10 min；室溫下離心10 000 r/min 10 min，取上清夜，用醋酸纖維膜作為固相支持物進行蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移；用0.5%去脂奶粉作為封閉液，去除無關(guān)蛋白質(zhì)的潛在結(jié)合位點的封閉；加入occludin(1∶10 000)或ZO-1Ⅰ抗進行反應(yīng)，其后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗；最后顯色。用圖像分析儀進行occludin及ZO-1蛋白表達(dá)的半定量分析，觀察缺血后24 h上述指標(biāo)的變化。

3.6腦含水量的測定腦缺血及缺血PC處理后24 h組再次麻醉動物，快速斷頭取腦，放在濾紙上，用濾紙吸干大腦表面少量的腦脊液，肉眼可見缺血區(qū)呈圓形或類圓形(假手術(shù)對照組除外)，用本室自制的圓柱形鐵制容器(直徑為0.7 cm、體積固定)，取出直徑約0.7 cm，厚度約2～3 mm缺血區(qū)及對照組相應(yīng)部位的腦皮質(zhì)，立即放入有蓋玻璃小器皿，置精密電子天平準(zhǔn)確稱取濕重，于100 ℃恒溫箱烘烤24 h至恒重，并按Elliott干濕重法計算腦組織含水量，以百分率表示。腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

3.7MRI檢測腦梗死體積采用Philips Achieva 3.0T超導(dǎo)型MRI系統(tǒng)，掃描線圈為Sense-Flex-M小關(guān)節(jié)柔軟線圈。掃描時點根據(jù)研究時刻而定，本研究中掃描時間為缺血24 h；后適應(yīng)24 h。MR掃描完成后，所獲圖像在Philips MR Systems Achieva Release 2.5 Level 3主機上進行處理，先對梗死體積(數(shù)據(jù)來自T2WI序列的測量結(jié)果)進行鑒定與評估，在計算機輔助下手工繪制各組圖像每一層面上異常信號區(qū)代表缺血面積(A1、A2、A3、…An)，將每一層面上缺血面積相加(A1+A2+A3…An)再乘以層厚(S)得到腦缺血梗死區(qū)域的總體積[(A1+A2+A3…An)×S][5-6]。

4統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件包，方差齊后行單因素方差分析(one-way ANOVA)、樣本均數(shù)間的兩兩比較經(jīng)Bornifar校正，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1缺血PC對樹鼩海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變的影響

電鏡下對照組海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)正常；腦缺血24 h可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池形成，線粒體腫脹，部分嵴溶解；缺血PC組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張明顯減輕，見圖1。

Figure 1.Ultrastructure of hippocampal neurons under electron microscope. A: control group: the normal neuron in hippocampus (×12 000); B: ischemia group: the endoplasmic reticulum cisterna, mitochondria swelling and cristae partly collapse at 24 h after thrombotic cerebral ischemia (×20 000)； C: ischemic PC group: endoplasmic reticulum expansion reduced obviously after ischemic PC (×10 000).

圖1缺血PC對海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變的影響

2缺血PC對樹鼩海馬神經(jīng)元壞死及凋亡的影響

光鏡下對照組樹鼩海馬神經(jīng)元形態(tài)正常，免疫組化顯示對照組海馬神經(jīng)元TUNEL染色陰性。腦缺血24 h海馬CA1區(qū)神經(jīng)元壞死，神經(jīng)元缺失明顯，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，與HE染色的細(xì)胞密度呈互補現(xiàn)象。缺血PC處理組海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元較多，且TUNEL 染色陽性神經(jīng)元較缺血組明顯減少(P<0.01)，見圖2。

3缺血PC對樹鼩缺血區(qū)rCBF的影響

對照組樹鼩皮層的rCBF為(434.20±28.54)PU。腦缺血24 h 時rCBF明顯降低至(134.27±28.75) PU，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.01)；而缺血PC組的rCBF恢復(fù)性增加(195.25±21.18) PU (P<0.01)，見圖3。

4缺血PC對樹鼩海馬ZO-1/occludin蛋白表達(dá)的影響

免疫組化結(jié)果顯示，樹鼩腦缺血24 h 海馬ZO-1及occludin表達(dá)減弱，微血管密度明顯減少；而缺血PC組ZO-1及occludin表達(dá)增強, 見圖4。

將Western blot結(jié)果使用ImageJ軟件測量各條帶灰度值，各目標(biāo)條帶的灰度值與對應(yīng)的內(nèi)參照(β-actin)的灰度值比值視為目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平，將假手術(shù)對照組的比值標(biāo)準(zhǔn)化為100%，其它值用此值轉(zhuǎn)化為百分比，Western blot檢測結(jié)果可見腦缺血24 h 時ZO-1及occludin 表達(dá)減弱(P<0.01)；而缺血PC組的ZO-1表達(dá)增強(P<0.01)，occludin的改變差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖5。

Figure 2.The effects of ischemia PC on the neuronal apoptosis and necrosis in the hippocampal CA1 area (×400). Mean±SD.n=9.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsischemia.

圖2缺血PC對海馬CA1區(qū)神經(jīng)元壞死及凋亡的影響

Figure 3.The effects of ischemic PC on rCBF in the ischemic zone. Mean±SD.n=8.**P<0.01vscontrol;△P<0.05vsischemia.

圖3缺血PC對腦缺血區(qū)rCBF的影響

5缺血 PC對樹鼩血栓性腦缺血腦水腫的影響

對照組樹鼩的腦含水量為(79.71±0.23)%。腦缺血24 h腦含水量明顯升高至(86.81±1.08)%，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.01)；而缺血PC組的腦含水量明顯降低至(81.04±1.04)%，與缺血組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.01)，見圖6。

6缺血PC對樹鼩腦梗死體積的影響

MRI的結(jié)果顯示，對照組樹鼩的腦梗死面積為0；腦缺血24 h的腦梗死體積為(33.00±3.03)mm3。經(jīng)缺血PC處理組上述時點腦梗死體積明顯縮小至(16.79±1.29) mm3(P<0.01)，見圖7。

討論

資料證實，通過誘導(dǎo)肢體一次致命性缺血而緩解遠(yuǎn)隔區(qū)器官(如大腦)的缺血程度，從而證明缺血PC是一種有前途的治療干預(yù)措施，但其基本的生物學(xué)機制尚不清楚[7-8]。本項目采用樹鼩(Tupaiaglis)作為實驗動物，由于其在解剖、生理特征上是除獼猴以外與人類最接近的動物。該動物的顱骨薄(其厚度僅為大鼠的1/3)，有利于特殊光束透過顱骨進行光化學(xué)反應(yīng)而導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷、血小板黏附/聚集而形成血栓；由于該腦缺血模型不需開顱，無腦脊液外漏，動物感染率低而便于長期觀察；因此更符合臨床腦血管疾病發(fā)病的客觀規(guī)律。鑒于海馬包括易損性和抵抗性2種截然不同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，有利于進行缺血性腦損傷及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的研究，尤其對于探討缺血PC腦保護的信號通道重建具有重要的應(yīng)用價值。我們既往的研究發(fā)現(xiàn)，不同種屬的動物腦缺血時海馬CA1區(qū)均可反復(fù)重現(xiàn)“海馬神經(jīng)元選擇性損傷”的普遍規(guī)律，與“神經(jīng)-血管單元”的概念十分吻合[2]。因此，本研究選擇腦缺血時rCBF、腦含水量及梗死體積3項主要觀測指標(biāo)，并以腦缺血后神經(jīng)元受損最嚴(yán)重的24 h作為非藥物干預(yù)的“時間窗”，探討缺血PC促進occludin/ZO-1蛋白表達(dá)在rCBF增加與腦水腫減輕之間的相互關(guān)系，對闡明缺血PC的非藥物干預(yù)的腦保護機制具有重要意義。

Figure 4.The effects of ischemia PC on the expression of occludin and ZO-1 in the hippocampus.

圖4缺血PC對腦缺血海馬occludin及ZO-1表達(dá)的免疫組化觀察

Figure 5.The effects of ischemic PC on the expression of occludin and ZO-1 in the hippocampus. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsischemia.

圖5缺血PC對腦缺血海馬occludin/ZO-1蛋白表達(dá)的影響

Figure 6.The effects of ischemic PC on the water content of the brain ischemic zone. Mean±SD.n=8.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsischemia.

圖6缺血PC對腦缺血區(qū)含水量的影響

實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樹鼩腦缺血后海馬神經(jīng)元的壞死與凋亡呈現(xiàn)出明顯的選擇性損傷特點，即以CA1區(qū)神經(jīng)元損傷為主，且以缺血24 h為著，符合神經(jīng)元遲發(fā)性死亡(delayed neuronal death，DND)及神經(jīng)元缺失的病理特點[9]。實驗后24 h樹鼩腦缺血區(qū)rCBF明顯降低，機制主要涉及3方面：(1)光化學(xué)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損、血小板黏附和聚集以致微血管阻塞；(2)缺血區(qū)微血栓形成釋放的縮血管物質(zhì)使rCBF減少；(3)血管周圍腦水腫導(dǎo)致的繼發(fā)性血管閉塞。以上因素是導(dǎo)致腦缺血時海馬神經(jīng)元繼發(fā)性損傷和遲發(fā)性壞死的關(guān)鍵所在。我們的觀察發(fā)現(xiàn)，樹鼩腦缺血時海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的壞死與凋亡在時間和空間上可相互重疊，缺血區(qū)rCBF的降低而使腦含水量增加；其機制主要涉及線粒體能量匱乏導(dǎo)致的細(xì)胞毒性水腫和BBB受損引起的血管源性水腫兩方面，是導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和腦梗死的主要原因。本研究采用MRI技術(shù)監(jiān)測樹鼩腦梗死體積的變化，為精準(zhǔn)測量小動物腦缺血時腦梗死體積的改變，進而為評估缺血PC的腦保護作用提供了新的科學(xué)依據(jù)。已知BBB主要由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、基膜和膠質(zhì)細(xì)胞組成，相鄰內(nèi)皮細(xì)胞間的TJ以拉鏈形式相互結(jié)合而封閉細(xì)胞間的縫隙，是構(gòu)成BBB屏障功能的重要物質(zhì)基礎(chǔ)；而TJ的occludin和ZO-1則是控制物質(zhì)穿過內(nèi)皮和上皮細(xì)胞間連接的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，在維持細(xì)胞極性、黏附性以及調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及分化具有重要作用[10]。業(yè)已證明，TJ的occludin經(jīng)序列分析其具有4個跨膜區(qū)，N端對TJ發(fā)揮屏障功能起著關(guān)鍵作用，C端與ZO-1相連而使跨膜蛋白和細(xì)胞骨架貼在一起，有利于識別TJ的位置以及生物信號的傳遞[10-12]，既是TJ形成的裝配平臺，又是occludin與細(xì)胞內(nèi)骨架系統(tǒng)連接的信號機制中的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[11]。我們經(jīng)免疫組化定位檢測顯示，occludin/ZO-1表達(dá)與腦血管分布關(guān)系密切，且與rCBF的增加與減少呈平行改變。為闡明缺血PC增加rCBF的作用是否會促進腦水腫或加劇繼發(fā)性腦損傷，我們觀察了缺血PC對TJ表達(dá)的改變以及對腦水腫的影響。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦缺血組rCBF明顯降低，occludin/ZO-1表達(dá)明顯下調(diào)且腦水腫明顯，后者既是細(xì)胞代謝障礙與血管通透性增加共同作用的結(jié)果，也是導(dǎo)致腦梗死的原因。而缺血PC處理后，隨著rCBF的恢復(fù)和組織缺血狀態(tài)的改善，微血管occludin/ZO-1表達(dá)上調(diào)可能是減輕血管源性腦水腫和抑制神經(jīng)元繼發(fā)性損傷的關(guān)鍵所在。此結(jié)果將為臨床采用PC改善腦缺血的非藥物干預(yù)提供了重要的實驗依據(jù)。缺血PC通過生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而提高組織的缺氧耐受以及機械信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而恢復(fù)組織供血的重要抗損傷反應(yīng)，其使缺血時間窗后延的同時又抑制后續(xù)的炎癥反應(yīng)[3,9]。新近研究證實，增加緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)或修復(fù)緊密連接ZO-1的異常分布可改善BBB通透性異常增高所引起的病理改變，而TJ作為一種多功能生物學(xué)復(fù)合物，能通過調(diào)控細(xì)胞間的黏附、增殖與分化，在多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著重要作用[10-13]。本研究結(jié)果表明，光化學(xué)誘導(dǎo)樹鼩血栓性腦缺血時rCBF、腦含水量及梗死體積3項主要觀測指標(biāo)具有明顯改變，表現(xiàn)為缺血區(qū)rCBF銳減、腦水腫及腦梗死形成；其中神經(jīng)元的凋亡與壞死則是腦梗死主要原因。而缺血PC增加rCBF而不促進腦水腫的機制可能是PC改善局部血流、緩解組織缺氧而上調(diào)微血管occludin/ZO-1表達(dá)的結(jié)果。由于血管機械張力可加快血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶1的活化，提示缺血PC的保護作用可能與蛋白激酶1有關(guān)[14]。最近，我們用氟代檸檬酸鈉抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的代謝后，缺血PC介導(dǎo)的腦保護作用明顯減弱(待發(fā)表資料)，推測星形膠質(zhì)細(xì)胞在血管內(nèi)皮細(xì)胞間信息網(wǎng)絡(luò)的重建可能具有重要作用，其分子機制正在探索。

Figure 7.The effects of ischemic PC on the volume of cerebral infarction. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;△P<0.05vsischemia.

圖7缺血PC對樹鼩腦梗死體積的影響

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Ischemia postconditioning induces tight junction protein expression and inhibits brain edema after thrombotic cerebral ischemia in tree shrews

LI Shu-qing, LI Fan, HE Liang, HE Bo

(DepartmentofPathophysiology,SchoolofBasicMedicalSciences,KunmingMedicalUniversity,Kunming650050,China.E-mail:shuqing28@hotmail.com)

[ABSTRACT]AIM: To assess whether the expression of tight junction (TJ) proteins, occludin/zonula occludins (ZO)-1, and regional cerebral blood flow (rCBF) link to brain edema in tree shrews during thrombotic cerebral ischemia and ischemic postconditioning (PC), and to explore how TJ affects brain edema and cerebral infarction. METHODS: Tree shrews were randomly grouped into control, ischemia and cerebral ischemia+PC (n=23), and the remaining 3 animals were used for magnetic resonance imaging (MRI). The local cerebral thrombosis were induced by photochemical reaction in the tree shrews, and ischemic PC was established at 4 h after induction of cerebral ischemia followed by clipped ipsilateral common carotid artery (5 min×3). The changes of the neural ultrastructure were observed under electron microscope. The neuronal apoptosis was analyzed by the method of TUNEL. Laser Doppler brain flowmetry was used to monitor the rCBF. The protein levels of occludin/ZO-1 were determined by immunochemistry and Western blot. The cerebral infarction volume was detected by MRI. The brain water content was measured by dry-wet weight method. RESULTS: Induction of cerebral ischemia led to a significant reduction of the normal neuron numbers in the hippocampal CA1 area, and conversely, the number of neurons with abnormal ultrastructure was increased. The TUNEL positive cells were increased significantly (P<0.01) in ischemia group. Moreover, the rCBF decreased significantly (P<0.01), and occludin/ZO-1 protein expression decreased (P<0.01). The brain water content and cerebral infarction volume were significantly increased (P<0.01). Ischemic PC increased the rCBF and the occludin/ZO-1 expression, but reduced the brain water content, the TUNEL positive cells, and the infarction volume (P<0.01). CONCLUSION: Ischemic PC increases the rCBF but not the local water content, suggesting that reduced cerebral infarction volume after ischemia PC is associated with the attenuation of cerebral edema by the enhancement of occludin/ZO-1 protein expression.

[KEY WORDS]Photochemistry reaction; Cerebral ischemia; Cerebral edema; Postconditioning; Tight junction protein; Magnetic resonance imaging; Tree shrews

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.015

[中圖分類號]R743.31

[文獻標(biāo)志碼]A

通訊作者△Tel: 0871-65922858; E-mail: shuqing28@hotmail.com

*[基金項目]國家科技支撐計劃(No. 2014BAI0101)；國家自然科學(xué)基金面上項目(No. 30971171)

[收稿日期]2015- 10- 08[修回日期] 2015- 12- 29

[文章編號]1000- 4718(2016)03- 0477- 08

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