楊 瑞 吳曉君 賈 微 岑妍慧（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001）

神經(jīng)干細(xì)胞的研究進(jìn)展

楊 瑞 吳曉君 賈 微 岑妍慧
（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001）

神經(jīng)干細(xì)胞是指能自我更新并具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，并足以提供大量神經(jīng)組織細(xì)胞的一類(lèi)細(xì)胞。自從90年代以來(lái)，人們相繼從各種動(dòng)物和人的中樞系統(tǒng)分離和培養(yǎng)出神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cell,NSC）[1,2]。近年來(lái)，神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)和研究日益深入，為神經(jīng)系統(tǒng)損傷和退行性變的治療帶來(lái)希望[3]。文章對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)源、分離培養(yǎng)及鑒定方法和筆者的一些實(shí)際工作體會(huì)做一綜述。

神經(jīng)干細(xì)胞；分離；培養(yǎng)

1 神經(jīng)干細(xì)胞的來(lái)源及其特征

分離培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)有幾十年的歷史，目前已有新生大鼠和新生小鼠作為神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)源的原代培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，胚胎發(fā)育過(guò)程中，神經(jīng)干細(xì)胞分布于神經(jīng)管的管壁[4]，有研究在海馬和紋狀體也終生存在神經(jīng)干細(xì)胞[5]。近來(lái)有研究表明，皮層中亦有NSCs分布。[6]神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells,NSCs)屬于多能干細(xì)胞，是具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的潛能和自我更新并足以提供大量神經(jīng)組織細(xì)胞的潛能的細(xì)胞[7,8]。他們受某些特定因素的調(diào)節(jié)：如神經(jīng)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)功能活動(dòng)、應(yīng)激反應(yīng)等，特別是許多神經(jīng)生長(zhǎng)因子的調(diào)節(jié)作用對(duì)干細(xì)胞的增殖和擴(kuò)增尤為重要，包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子以及胰島素樣生長(zhǎng)因子-I等均可有效地促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的分裂和增殖，另外白血病抑制因子及其受體（leukemia inhibitory factor receptor，LIFR）介導(dǎo)的信號(hào)傳遞通路在神經(jīng)干細(xì)胞的增殖過(guò)程中也起了重要的作用[9]。

2 神經(jīng)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)方法的比較

制備體外原代神經(jīng)干細(xì)胞常用方法有：?jiǎn)渭儥C(jī)械吹打法、胰蛋白酶消化法。

2.1 非酶分離細(xì)胞法

2.1.1 單純機(jī)械吹打法

大鼠乙醚麻醉后，首先用消毒酒精消毒其皮膚，然后迅速取出腦組織并分離兩側(cè)海馬。D-Hanks液漂洗，反復(fù)切割組織，放入離心管中，吸管反復(fù)吹打至無(wú)可見(jiàn)組織切塊，再用200目細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾，然后制成單細(xì)胞懸液。經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后，分裝入50ml培養(yǎng)皿中，細(xì)胞數(shù)約為5*105/ml[10]。該方法操作簡(jiǎn)單，無(wú)需復(fù)雜以及和胰蛋白酶，經(jīng)機(jī)械分離得到的單細(xì)胞活性要比酶分離得到的單細(xì)胞活性大。

2.1.2 無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)法

最常用的是原代細(xì)胞體外培養(yǎng)法，神經(jīng)干細(xì)胞具有持續(xù)增殖的能力，血清中含有許多誘導(dǎo)NSCs 分化的物質(zhì)，所以目前采用無(wú)血清培養(yǎng)[11]。一般用堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和表皮生長(zhǎng)因子刺激細(xì)胞生長(zhǎng)，有研究表明，生長(zhǎng)因子的密度會(huì)影響到神經(jīng)干細(xì)胞的生長(zhǎng)，密度過(guò)高對(duì)其生長(zhǎng)起到抑制作用，密度過(guò)低不利于神經(jīng)干細(xì)胞增殖，嚴(yán)重則導(dǎo)致懸浮的細(xì)胞貼壁分化最后衰老死亡[12]。

2.2 酶分離細(xì)胞法

2.2.1 胰蛋白酶消化法

出生24 h 內(nèi)的新生SD 大鼠，用消毒頭部后，斷頭處死，無(wú)菌條件下D-Hank’s液中打開(kāi)顱腔，分離出海馬，去除腦膜和血管，稍靜置待組織沉入離心管底部，棄去上清，加入0.25 %胰蛋白酶1mL，37℃消化10 min 后加入4mL添加10%血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，用尖端拋光的玻璃管輕輕吹打至無(wú)可見(jiàn)的組織塊，離心、重懸即可獲得神經(jīng)干細(xì)胞[13]。此法用胰蛋白酶分化，操作簡(jiǎn)單，分離效果較好，價(jià)格便宜。但在實(shí)際操作中很難客觀準(zhǔn)確地把握酶作用的最佳時(shí)間，嚴(yán)重影響細(xì)胞活性，酶消化細(xì)胞間質(zhì)的同時(shí)也消化了細(xì)胞本身。實(shí)驗(yàn)采用機(jī)械分離和消化分離相結(jié)合的方法，分離培養(yǎng)了大鼠腦神經(jīng)干細(xì)胞，結(jié)果證實(shí)采取這一方案種植的細(xì)胞生長(zhǎng)良好[11]。

2.2.2 傳代懸浮培養(yǎng)

在原代培養(yǎng)的第3天能夠清楚地觀察到神經(jīng)干細(xì)胞以漂浮的細(xì)胞團(tuán)的方式生長(zhǎng)，即形成神經(jīng)球[14]。神經(jīng)球在培養(yǎng)基中呈懸浮生長(zhǎng)，予以更換半量培基，在培養(yǎng)條件不變的情況下，1周后用吸管輕柔吹打球形克隆成為小的神經(jīng)球和單細(xì)胞懸液，細(xì)胞球大小基本一致，細(xì)胞的折光性增強(qiáng)。劉立[15]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種初期有突起和生長(zhǎng)錐的細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)環(huán)境下逐漸死亡，貼壁的多會(huì)生長(zhǎng)出短突起，細(xì)胞球迅速貼壁并分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，但隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞全部呈懸浮狀。

與懸浮法對(duì)比，貼壁培養(yǎng)法更利于進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察，獲取大量同質(zhì)化的細(xì)胞，對(duì)體內(nèi)移植、基因操作、進(jìn)行嚴(yán)格的克隆分析和發(fā)育學(xué)研究具有重要意義。

3 本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)離體神經(jīng)干細(xì)胞的經(jīng)驗(yàn)

通過(guò)以上方法反復(fù)大量的實(shí)驗(yàn)對(duì)比，筆者采用了飼養(yǎng)層條件下培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的穩(wěn)定抑制神經(jīng)干細(xì)胞的分化、促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的分裂增殖及保持神經(jīng)干細(xì)胞的多向分化潛能的條件?，F(xiàn)將方法敘述如下：取15～16d左右的雄性小鼠的睪丸，經(jīng)0.25%胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液,培養(yǎng)48h后換液去除懸浮的生精細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞達(dá)到純化睪丸支持細(xì)胞的目的,然后把部分生長(zhǎng)良好的Sertoli細(xì)胞消化下來(lái)，經(jīng)洗滌、固定、脫水、包埋和聚合等步驟后使用LKB-V型超薄切片機(jī)切片，鈾、鉛各復(fù)染10min，在日立H-500型透射電子顯微鏡下觀察，拍照。其余生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Sertoli細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)待其貼滿(mǎn)瓶底表面積80%左右用0.25%胰蛋白酶消化傳代，連續(xù)傳至第三代待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底表面積90%以上時(shí)，使用絲裂霉素C溶液處理以抑制其分裂增殖以作為飼養(yǎng)層。

組織化學(xué)染色進(jìn)行堿性磷酸酶檢測(cè)：神經(jīng)干細(xì)胞堿性磷酸酶呈陽(yáng)性，表明其分化程度低；目前檢測(cè)巢蛋白的表達(dá)是鑒定神經(jīng)干細(xì)胞最重要最常用的指標(biāo)[16]。免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞表面特異性分子標(biāo)志物-巢素蛋（Nestin）：神經(jīng)干細(xì)胞Nestin染色呈陽(yáng)性，胞質(zhì)被染成棕黃色，表明分離出的為神經(jīng)干細(xì)胞[17]，分化后的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的特異性抗原[18]。

4 結(jié)語(yǔ)

目前，神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)與分離技術(shù)迅速發(fā)展，隨著研究的深入，移植治療發(fā)生退行性變的神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)機(jī)制[19]的探討奠定了基礎(chǔ)，以及NSCs 移植將有可能成為治療神經(jīng)變性疾病和腦損傷的有效手段[20]。目前最理想的策略是從需要治療的患者體內(nèi)取出NSCs用于自身治療[21]。

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The research progress of neural stem cells

The neural stem cells are to point to self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes, and enough to provide a lot of nerve tissue cells. Since the nineties, people have been isolated from various animals and human central nervous system and cultivate neural stem cells[1,2].In recent years, the discovery of neural stem cells and in-depth research, for the treatment of nervous system damage and degeneration[3].Cultivation in this paper, the sources of neural stem cells and identifying methods and some actual work experience of the author.

neural stem cells; segregation; incubation

R745

A

1008-1151(2016)11-0052-02

2016-10-11

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81503406）；廣西高校科研課題（ZD2014068）；廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技專(zhuān)項(xiàng)課題（GZPT13-04、GZBZ16-07、GZLC16-23）。

楊瑞（1981－），男，湖北潛江人，廣西中醫(yī)藥大學(xué)講師，碩士。