張楷正，黃　海（.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000；.四川省釀酒研究所，四川廣漢68000）

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濃香型白酒釀造中的酯化酶研究及應(yīng)用進(jìn)展

張楷正1，黃海2
（1.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000；2.四川省釀酒研究所，四川廣漢618000）

摘要：酯化酶是濃香型白酒生產(chǎn)上的重要酶類。概述了濃香型白酒生產(chǎn)中酯化酶的研究現(xiàn)狀，討論了酯化酶的反應(yīng)特性、酯化酶技術(shù)在釀酒行業(yè)中的應(yīng)用情況；同時(shí)，對(duì)當(dāng)前酯化酶研究中存在的問(wèn)題及其發(fā)展前景進(jìn)行了討論與展望。

關(guān)鍵詞：濃香型白酒；酯化酶；研究進(jìn)展

眾所周知，白酒中約2％的呈香呈味物質(zhì)是決定酒體質(zhì)量的重要物質(zhì)。在香味物質(zhì)中，酯類成分是其中的重要組成部分。許多白酒香型的劃分就是以主體酯類物質(zhì)來(lái)區(qū)別的，如濃香型白酒以己酸乙酯為主體香、清香型白酒以乙酸乙酯為主體香。而酯類物質(zhì)的合成——酯化，就是酸和醇反應(yīng)，脫水而生成酯。在微生物體內(nèi)溫和的環(huán)境中，此反應(yīng)需有酯化酶的參與方能順利完成。

酯化酶不是酶學(xué)上的術(shù)語(yǔ)。酯化酶亦稱羧基酯酶,它是催化合成低級(jí)脂肪酸酯的酶類的總稱，白酒生產(chǎn)中是指脂肪酶、酯合成酶、磷酸酯酶的統(tǒng)稱[1]。該酶既能催化酯的合成，也能催化酯的分解。因此，白酒行業(yè)習(xí)慣分別稱為酯化酶和酯分解酶。酵母、霉菌、細(xì)菌中均含有酯酶。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn),紅曲霉、根霉中許多菌株有較強(qiáng)的己酸乙酯合成能力。酯化酶不同于酶學(xué)上的脂肪酶，脂肪酶的正式名稱是甘油酯水解酶。它既能將脂肪水解為脂肪酸和甘油,又能催化脂肪的合成，即脂肪酶是指水解一類特殊的酯類——三羧酸甘油酯的酶,而酯化酶則是可以水解羧酯鍵的酶。

酯化酶的理論基礎(chǔ)為酶在有機(jī)溶劑中作用，直接將酸與醇催化合成酯類，包括己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯等酯類物質(zhì)，在白酒生產(chǎn)中已應(yīng)用的多為乙酸乙酯合成酶及己酸乙酯合成酶，酯化酶對(duì)成品酒的風(fēng)味同樣具有重要的影響。

1　酯化酶的酯化反應(yīng)特性

酯化酶的反應(yīng)特性與酯化微生物有關(guān)。一般認(rèn)為，在釀酒微生物中酵母菌合成乙酸乙酯的能力較強(qiáng)；但在對(duì)己酸的酯化能力上，不同研究者有不同的看法：栗山一秀認(rèn)為，酵母的酯化力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于曲霉的酯化能力，當(dāng)酵母與曲霉共同作用時(shí)，則己酸乙酯產(chǎn)量大增[2]?！氨倍吩囼?yàn)組”[3]認(rèn)為，大曲對(duì)己酸的酯化能力優(yōu)于麩曲，酵母的酯化能力并未表現(xiàn)出優(yōu)越性，反而不及麩曲，這一點(diǎn)與吳衍庸的研究結(jié)果類似[4]。

大曲中的紅曲霉、白地霉、根霉和毛霉均具有酯化能力，且相同的酯化酶對(duì)不同的有機(jī)酸催化成酯的能力也不一樣。這完全可以理解，因?yàn)閺纳锘瘜W(xué)方面講，凡是酶，其本質(zhì)都是蛋白質(zhì)（除自催化的核糖核酸酶外），在催化化學(xué)反應(yīng)時(shí)均存在反應(yīng)底物及產(chǎn)物、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)環(huán)境的酸堿度和反應(yīng)介質(zhì)（反應(yīng)溶劑類型）等因素的影響而導(dǎo)致產(chǎn)物或者產(chǎn)物生成量的不同。

1.1酯化酶催化的底物及產(chǎn)物種類

釀酒工業(yè)中酯化酶對(duì)酸底物特異性的研究主要是針對(duì)各香型白酒中的四大酯類的合成效果進(jìn)行研究，主要底物是己酸、乙酸、丁酸和乳酸。

任道群等[5]對(duì)紅曲霉、大曲以及根霉菌對(duì)單一酸（乙酸、己酸、乳酸、丁酸）和混合酸（各酸等比混合）的酯化效果進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：紅曲霉能促進(jìn)己酸、丁酸及混合酸與乙醇的酯化作用，生成的酯類物質(zhì)均為己酸乙酯，而且酯化能力極強(qiáng)；大曲能促進(jìn)己酸、丁酸及混合酸與乙醇的酯化作用，生成的酯類物質(zhì)均為己酸乙酯，且能促進(jìn)乙酸與乙醇的酯化生成乙酸乙酯；根霉能促進(jìn)己酸和混合酸與乙醇的酯化作用，生成少量的己酸乙酯和乳酸乙酯。實(shí)驗(yàn)表明，及時(shí)移出反應(yīng)產(chǎn)物可促進(jìn)酯化反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行。

杜禮泉等[6]對(duì)豐谷酒業(yè)保存的1株煙灰色紅曲霉酯酶的酯化特性的研究中發(fā)現(xiàn)，該紅曲霉酯酶對(duì)乙酸、丁酸、己酸都有較強(qiáng)的酯化作用,生成相應(yīng)的乙酯，且紅曲霉酯酶是一類專一性很低的酶，屬于鍵專一性的生物酶，在濃香型大曲酒生產(chǎn)中能同時(shí)提高四大酯的含量。

唐玉明等[7]在對(duì)紅曲酯化菌21-3的特性研究中發(fā)現(xiàn)，四大酸和乙醇反應(yīng)生成相應(yīng)的乙酯，但是四大酸的混合物生成的物質(zhì)為己酸乙酯。

由于酯化反應(yīng)的底物為酸和醇類，兩者在酯化反應(yīng)中不僅是底物，還都是酯化酶的變性劑。在低底物濃度范圍，己酸乙酯合成轉(zhuǎn)化率是隨著底物濃度的增加而增大的，這是因?yàn)樵黾拥孜餄舛?，可增加酶分子與底物作用的機(jī)會(huì)，加快反應(yīng)速率。在生產(chǎn)實(shí)踐中，發(fā)現(xiàn)一般發(fā)酵正常的窖池，產(chǎn)酒多及酸高的，產(chǎn)酯也多，提高了酯化率；但底物濃度過(guò)大時(shí)，高濃度的酸和醇將影響酶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，抑制反應(yīng)的進(jìn)行，轉(zhuǎn)化率及總酯含量會(huì)下降。

1.2酶促反應(yīng)溫度

溫度是所有化學(xué)反應(yīng)中的重要因素。酶促反應(yīng)中酶能降低底物分子的活化能，在一定范圍內(nèi)提高溫度能增加底物分子運(yùn)動(dòng)動(dòng)能，增加底物分子相互碰撞及與酶接觸的機(jī)會(huì)，從而提高反應(yīng)速度。但是隨著溫度的升高，一方面酶反應(yīng)速度加快，另一方面酶蛋白的熱變性速度亦加快，因此，一個(gè)合適的反應(yīng)溫度對(duì)酶促反應(yīng)的進(jìn)行有重要意義。

沱牌曲酒廠采取27℃、29℃、31℃、33℃和35℃共5個(gè)溫度值液態(tài)法發(fā)酵28 d（酸度4，酒精度9％vol），發(fā)現(xiàn)己酸乙酯的合成溫度以29℃為宜[8]。一般認(rèn)為，酯化過(guò)程是在發(fā)酵后期進(jìn)行的，即“前緩、中挺、后緩落”的“后緩落”階段。29℃比較符合濃香型白酒的發(fā)酵產(chǎn)酯生香情況。

1.3反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)介質(zhì)

一般酯化酶催化的反應(yīng)，時(shí)間長(zhǎng)，所得酯類物質(zhì)相對(duì)較高，比如“雙輪底”發(fā)酵的白酒所含呈香呈味物質(zhì)就多于普通發(fā)酵白酒。2008年，成都邛崍某曲酒廠進(jìn)行的“雙輪底”發(fā)酵生產(chǎn)濃香型酒，總酯含量由原來(lái)的0.73 g/100 mL提高到1.2 g/100 mL，總酸含量也有相應(yīng)升高。

反應(yīng)介質(zhì)對(duì)酯化反應(yīng)的速率也有較大影響。如在水相中需要100 h的酯化反應(yīng)，在有機(jī)相（正庚烷）中只需24 h就能完成。與水相催化相比,有機(jī)介質(zhì)可以增加酯化酶的熱穩(wěn)定性,增加非極性底物的溶解度,減少反應(yīng)副產(chǎn)物,還可能影響酶的底物特異性及酶反應(yīng)的平衡方向和反應(yīng)速度。有機(jī)溶劑相中酯化反應(yīng)平衡點(diǎn)與反應(yīng)速率同溶劑中水含量密切相關(guān),有機(jī)溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)時(shí),在一個(gè)狹窄的初始含水量范圍內(nèi),酶有較高的催化酯化活力[9]。但在食品工業(yè)中，有機(jī)相溶劑的存在不利于簡(jiǎn)化下游操作步驟，并存在有機(jī)溶劑污染食品問(wèn)題。水相酯化反應(yīng)雖然進(jìn)行緩慢，但可以和實(shí)際生產(chǎn)相結(jié)合，可將酯化產(chǎn)品直接應(yīng)用到生產(chǎn)中，簡(jiǎn)單方便。所以應(yīng)該根據(jù)不同目的，選用不同反應(yīng)介質(zhì)來(lái)進(jìn)行酯化反應(yīng)。

1.4反應(yīng)環(huán)境的酸堿度

酯化反應(yīng)的酸堿度或者反應(yīng)的pH值對(duì)產(chǎn)酯效果影響較為顯著，一般應(yīng)在較高酸度即較低的pH值下進(jìn)行，大多數(shù)窖內(nèi)或缸內(nèi)發(fā)酵環(huán)境基本可滿足條件。以己酸乙酯合成為例，沱牌酒廠選取了2.5、3.0、3.5、4.0、4.5共5個(gè)不同酸度，在酒精度5％vol、溫度25℃時(shí)液態(tài)法發(fā)酵28 d，結(jié)果表明，己酸菌生長(zhǎng)適宜酸度為3.0以下，而適宜的酯化酸度為4.0。

2　濃香型白酒釀造中應(yīng)用的酯化酶技術(shù)

酯化酶技術(shù)的應(yīng)用是中國(guó)白酒工業(yè)的一項(xiàng)重大創(chuàng)新成果，在白酒生產(chǎn)中應(yīng)用的酯化酶制劑是生物酶和活菌體的生態(tài)混合體，在發(fā)酵過(guò)程既有傳統(tǒng)大曲的糖化功能，也有生香功能，從而可縮短發(fā)酵周期，提高出酒率和優(yōu)品率[10]。

2.1酯化液串蒸

酯化液是將25％～30％的優(yōu)質(zhì)新鮮黃水和65％～70％的酒尾（10％vol～20％vol），再加入約2％的大曲粉、3％的酯化酶制劑、適量窖泥或窖泥培養(yǎng)液及底糟，倒入壇內(nèi)，混勻，保溫發(fā)酵40 d，讓其進(jìn)行緩慢酯化反應(yīng)，即成酯化液粗品。

表1　酯化液串蒸酒體主要指標(biāo)變化　(g/100mL)

酯化液粗品可以直接混入底鍋或撒至糧糟上進(jìn)行串蒸，效果較好。李大和[11]試驗(yàn)的酯化液串蒸效果見(jiàn)表1。

2.2酯化液灌窖

具體操作措施：將發(fā)酵成熟的酯化液粗品，在窖池主發(fā)酵結(jié)束后潑入加糧的酒醅中，再密封發(fā)酵60 d，出窖蒸餾。一般總酯含量可提高30％～50％。需要選擇窖泥質(zhì)量好、不滲水的窖池，一般每甑灌入50 kg酯化液即可。同時(shí)注意，溫度較高的夏季不宜灌窖。

2.3高酯調(diào)味酒（液）的應(yīng)用

將酯化液粗品進(jìn)行三級(jí)過(guò)濾，最后精濾得到無(wú)色透明的高酯調(diào)味酒，或者將酯化液粗品注入分餾器，收集酒精含量60％vol以上的餾出液，可得香味濃郁的、己酸乙酯含量高達(dá)4～6 g/L的高酯調(diào)味酒，用于中、低檔成品酒的勾調(diào)，可使普通白酒向優(yōu)質(zhì)酒轉(zhuǎn)化。甘肅瀧西渭水酒業(yè)集團(tuán)2003年引進(jìn)酯化酶技術(shù)生產(chǎn)酯香液，用于中低檔成品酒的勾調(diào)，效果明顯好于外購(gòu)香料[12]；吳衍庸[13]等開發(fā)的多功能復(fù)合香酯酶技術(shù)，在河南仰韶酒上應(yīng)用，使用1 t由香酯酶生產(chǎn)的香酯液，可多出優(yōu)質(zhì)酒10 t。

2.4利用酯化酶制劑提高出酒率及優(yōu)質(zhì)品率

將酯化酶用于雙輪底發(fā)酵和回沙撒糟醅，可以較大地提高濃香型白酒中的總酯含量和優(yōu)質(zhì)品率，同時(shí)可以提高出酒率。王述榮等[14]研制的粗酶制劑YH-AM用于洋河大曲酒的生產(chǎn)，結(jié)果提高出酒率7.21％，提高優(yōu)質(zhì)酒率19.55％。信春暉等[15]在扳倒井大曲酒生產(chǎn)中添加復(fù)合酯化酶，平均出酒率提高6.7％，優(yōu)質(zhì)酒率提高7.3％；賈超英等[16]在泰山特曲生產(chǎn)中添加復(fù)合酯化酶，使優(yōu)質(zhì)酒率提高6.1％；王曉丹等[17]利用酯化紅曲霉FBKL 3.0018制成的酯化酶粗酶制劑，加入到濃香型清酒發(fā)酵中（1.5％），用曲量減少了2％～5％，出酒率提高了約2％；從微量成分含量分析，酒品質(zhì)量明顯提高（表2）。

樊琪[18]在山東3株閣老貢酒生產(chǎn)中添加復(fù)合酯化酶，使出酒率提高5％，優(yōu)質(zhì)酒率為41.2％；束成忠等[19]研究為第1輪發(fā)酵后的優(yōu)質(zhì)酒率提高16.5％，第2輪發(fā)酵后的優(yōu)質(zhì)酒率提高6.2％。武建國(guó)等[20]以香醅為載體，加入紅曲酯化酶等材料，提高優(yōu)質(zhì)酒率7.2％～14％，己酸乙酯增幅在124.8～162.5mg/100 mL。

3　當(dāng)前酯化酶研究中存在的問(wèn)題與展望

酯化酶應(yīng)用技術(shù)在濃香型白酒生產(chǎn)中極大地提高了優(yōu)質(zhì)酒的比例，同時(shí)也使出酒率得到提高；突出了濃香型白酒己酸乙酯的主體香，同時(shí)又使幾大酯的比例協(xié)調(diào)，窖香濃郁，酒體豐滿，醇和爽凈。雖然酯化酶技術(shù)漸趨成熟，但當(dāng)前酯化酶研究中尚存在以下一些問(wèn)題：

表2　添加酯化酶制劑及減曲的效果分析　（g/L）

（1）產(chǎn)酯微生物的選育仍需加強(qiáng)。尚需選育出適應(yīng)性強(qiáng)、不易變異、酯香風(fēng)格特點(diǎn)更為突出的菌株，包括酵母菌、霉菌等真菌。

（2）酯化酶的酶活及純度需要提高。酯化酶制劑大部分還停留在粗酶制劑階段，純度不高。今后應(yīng)從提高酶純度入手，生產(chǎn)出商品酯化酶，形成一定的產(chǎn)業(yè)化規(guī)模，可滿足廣大釀酒企業(yè)的需要，提高優(yōu)質(zhì)酒的占比。

（3）在產(chǎn)酯能力提高的同時(shí)，應(yīng)注意加大對(duì)白酒蒸餾環(huán)節(jié)提香作用的研究，使酒醅中酯香類物質(zhì)得到較為充分的提取。

（4）在過(guò)濾蒸餾出合格的高酯調(diào)味酒后，酯化液中剩余的固形物，有待加強(qiáng)研究利用；同時(shí)應(yīng)進(jìn)一步研究酯化酶在水相中催化分解脂肪成甘油和高級(jí)脂肪酸，再形成高級(jí)脂肪酸酯的過(guò)程，以期達(dá)到對(duì)曲酒風(fēng)味更為詳盡的解析。

4　結(jié)束語(yǔ)

酯化酶是濃香型白酒生產(chǎn)中的重要酶類，酶量的多少和酶活的高低，與白酒的優(yōu)質(zhì)品率密切相關(guān)。生產(chǎn)中采取多種方法并合理利用，可以提高出酒率和產(chǎn)品質(zhì)量。當(dāng)前應(yīng)加大酯化酶催化過(guò)程的研究，選育風(fēng)格特點(diǎn)突出的產(chǎn)酶微生物，提高酶制劑的純度及進(jìn)行蒸餾提香過(guò)程的研究。

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Research Progress in and Application of Esterifying Enzyme in the Production of Nongxiang Baijiu

ZHANG Kaizheng1and HUANG Hai2
(1.College of Bioengineering,Sichuan University of Science and Engineering,Zigong,Sichuan 643000;2.Sichuan Provincial Liquor-making Research Institute,Guanghan,Sichuan 618000,China)

Abstract:Esterifying enzyme plays an important role in the production of Nongxiang Baijiu.In this paper,the present research situations of esterifying enzyme were reviewed,including its reaction properties and its application in the production of Nongxiang Baijiu.Meanwhile,the prospects and the problems of esterifying enzyme in the research and in the application were discussed.

Key words:Nongxiang Baijiu;esterifying enzyme;research progress

作者簡(jiǎn)介：張楷正（1969-），男，四川富順人，博士，副教授，主要從事發(fā)酵工程研究，E-mail：kai7766@126.com。

收稿日期：2015-07-27

基金項(xiàng)目：四川理工學(xué)院人才引進(jìn)項(xiàng)目（2014RC26），瀘州老窖科研獎(jiǎng)學(xué)金項(xiàng)目（13ljzk08），四川理工學(xué)院教改項(xiàng)目（JG-1527），四川理工學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410622026）。

中圖分類號(hào)：TS262.3；TS261.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-9286（2016）02-0093-04

DOI：10.13746/j.njkj.2015322

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2015-10-23；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20151023.1400.004.html。