邵威平，吳卓穎，張永玲，楊富民,田常慶

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州　730070；2.臨夏州人民醫(yī)院，甘肅 臨夏　731100；

3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,甘肅 蘭州　730070)

?

產(chǎn)青霉素G?；腹こ叹臉?gòu)建

邵威平1，吳卓穎1，張永玲2，楊富民1,田常慶3

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州730070；2.臨夏州人民醫(yī)院，甘肅 臨夏731100；

3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,甘肅 蘭州730070)

摘要：【目的】 構(gòu)建表達(dá)巨大芽孢桿菌青霉素G酰化酶(PGA)的枯草芽孢桿菌工程菌.【方法】 首先采用PCR從巨大芽孢桿菌基因組DNA中擴(kuò)增出長度為2 409 bp的PGA編碼基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測及DNA測序驗證后，再將其與枯草芽孢桿菌穿梭表達(dá)載體PMA5(7.5 kb)連接后導(dǎo)入到枯草芽孢桿菌10397中表達(dá)，并通過聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠電泳(SDS-PAGE)檢驗其能否表達(dá).【結(jié)果】 構(gòu)建了9.9 kb大小的PMA5-PGA重組質(zhì)粒，經(jīng)SDS-PAGE驗證，青霉素酶基因在枯草芽孢桿菌10 397中作出表達(dá).基因工程菌在37 ℃、220 r/min培養(yǎng)36 h發(fā)酵條件下，所產(chǎn)PGA的酶活可達(dá)到12.426 U/mL，比巨大芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)PGA酶提高了5.26倍.【結(jié)論】 所構(gòu)建的枯草芽孢桿菌是青霉素G?；傅母弋a(chǎn)工程菌.

關(guān)鍵詞：青霉素G?；?；PCR；重組表達(dá)；基因工程菌

青霉素G?；?penicillin G acylase，EC 3.5.1.11，簡稱PGA)是用于生物合成青霉素和頭孢菌素的關(guān)鍵前體物質(zhì)6-氨基青霉烷酸(6-APA)的酶.作為生物催化劑，PGA在許多有潛在價值的反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[1].

工業(yè)上主要采用細(xì)菌作為PGA的生產(chǎn)菌種.細(xì)菌產(chǎn)PGA可分為兩大類：革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌.前者產(chǎn)酶為胞內(nèi)酶，后者則為胞外酶.巨大芽孢桿菌作為革蘭氏陽性菌能夠向細(xì)胞外分泌PGA，這對于工業(yè)上提取PGA十分有利，但巨大芽孢桿菌PGA在大腸桿菌中的表達(dá)量太低，沒有實用價值[2-3]，但是若利用基因工程的方法構(gòu)建高產(chǎn)和分泌型的產(chǎn)酶菌，將會在工業(yè)上得到廣泛利用.枯草芽孢桿菌作為革蘭氏陽性菌不僅能夠?qū)⑺a(chǎn)PGA分泌至細(xì)胞外，而且對PGA的降解很少，從而可以使PGA在發(fā)酵液中逐步積累以便于取得高表達(dá)[4].國內(nèi)外關(guān)于PGA的基因工程研究多基于將PGA基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入大腸桿菌中表達(dá)[5-8]，而對于枯草芽孢桿菌中的表達(dá)研究的較少,且得到的酶活水平較低..

本研究從巨大芽孢桿菌中提取了基因組DNA，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增了PGA編碼基因，并與T載體連接轉(zhuǎn)化后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測及DNA測序驗證；將測序結(jié)果正確的擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建枯草芽孢桿菌表達(dá)載體pMA5重組體，并將其導(dǎo)入到枯草芽孢桿菌中使其表達(dá)，以期獲得能夠高產(chǎn)PGA的枯草芽孢桿菌基因工程菌株，為工業(yè)化生產(chǎn)PGA提供技術(shù)支持.

1材料與方法

1.1材料

巨大芽孢桿菌22680，枯草芽孢桿菌表達(dá)載體pMA5，由本實驗室提供；枯草芽孢桿菌10397，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，T克隆載體，DNA maker DSTM2000、DSSM1135000、DSTM20000購自生化公司；蛋白胨、MnSO4·H2O、MgCl2·6H2O、葡萄糖等試劑均為國產(chǎn)分析純；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、T4DNA連接酶、內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、NdeⅠ均購自天根生物化學(xué)有限責(zé)任公司.

1.2儀器

PCR擴(kuò)增儀；電泳儀；凝膠成像系統(tǒng)儀；高速低溫離心機(jī)；高壓蒸汽滅菌鍋；超凈工作臺；電子天平；恒溫培養(yǎng)箱.

1.3引物設(shè)計與合成

以巨大芽孢桿菌22680染色體DNA為模板，根據(jù)Genbank上公布的巨大芽孢桿菌PGA基因序列設(shè)計P1、P2引物，由上海生工生物工程有限公司合成.

P1：5′-CG GAATTC(EcoRⅠ)ATGAAGATGAAGTGGCTAATATCAGTC-3′；

P2：5′-CG GGATCC(BamHⅠ)CTACTTACTCATATTTAATGCGCTTAC-3′

1.4巨大芽孢桿菌基因組DNA的提取

將斜面保存的巨大芽孢桿菌首先進(jìn)行劃線分離，培養(yǎng)24 h后分離出單菌落，再將單菌落挑出制備成巨大芽孢桿菌菌懸液，然后按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明操作，提取巨大芽孢桿菌基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?

1.5目的基因的擴(kuò)增與純化

以巨大芽孢桿菌基因組為模板，擴(kuò)增PGA目的片段.反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下：

表1　PCR反應(yīng)體系

反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 4 min，40循環(huán)；72 ℃ 5 min.

將擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物經(jīng)2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并切下特異性目的條帶進(jìn)行純化.

1.6克隆載體pGM-T-PGA的構(gòu)建

將純化的PGA與pGM-T克隆載體16 ℃下連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于加有100 μg/mL Amp的LB培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)后挑斑提取質(zhì)粒.將陽性克隆菌液送上海生物工程公司進(jìn)行測序，并采用DNAMAN進(jìn)行序列比對.

1.7表達(dá)載體 pMA5-PGA的構(gòu)建

將陽性克隆pGM-T-PGA質(zhì)粒用EcoRⅠ單酶切，加入Klenow酶消化后，再加入BamHⅠ酶切[9-10]，并用NdeⅠ酶切后使用Klenow酶補(bǔ)平，再用BamHⅠ酶切枯草芽孢桿菌表達(dá)載體pMA5，用Klenow酶補(bǔ)平，經(jīng)平末端連接方法用T4DNA連接酶進(jìn)行連接(方法同1.6)，得到克隆載體pMA5-PGA.然后將pMA5-PGA基因轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌10397感受態(tài)細(xì)胞中，得到含有pMA5-PGA的基因工程菌.

1.8陽性克隆的高效表達(dá)

將基因工程菌進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選所涂平板上的菌斑較大、光滑的白色菌斑放入3～4 mL加有100 μg/mL Amp的LB培養(yǎng)基中，在37 ℃、220 r/min過夜培養(yǎng).并將基因工程菌和空白菌發(fā)酵上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，以驗證青霉素酶基因是否在枯草芽孢桿菌10397中表達(dá)，測得發(fā)酵液中的PGA的活力.

1.9PMA5-PGA質(zhì)粒的穩(wěn)定性檢測

從上述平板上挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中，于37 ℃，220 r/min培養(yǎng)48 h，菌液離心取上清測定酶活力，并同時取10 μL菌液作為種子菌轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)基中.同樣條件進(jìn)行傳代實驗及酶活力測定.

1.10青霉素G酰化酶的產(chǎn)量及活力測定

酶活力測定：參考Balasingham K方法[11]，6-氨基青霉烷酸顯色標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及酶活力測定具體方法如下：準(zhǔn)確稱取6-氨基青霉烷酸50.0 mg，置于50 mL容量瓶中，用0.05 mol/L、pH7.5的磷酸鹽緩沖液溶解并定容至刻度；用0.05 mol/L、pH 7.5的磷酸鹽緩沖液配置20 mg/mL的青霉素G鉀鹽溶液，37 ℃預(yù)熱10 min.按表2將各成分加入到1.5 mL離心管中；37 ℃水浴中反應(yīng)30 min；反應(yīng)液于13 000 r/min離心1m in，吸取上清液1 mL加入各試管中，試管中預(yù)先加入3 mL終止液(20%乙酸與0.05 mol/LNaOH溶液2∶1體積混合)，加入0.5 mL顯色液(0.5%對二甲氨基苯甲醛的甲醇溶液)；調(diào)波長415 nm，用0號管調(diào)零點(diǎn)，測出1～6號管的光密度值.以光密度值為縱坐標(biāo)，6-APA濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線.

酶活力(U/L)= 106×C6-APA×V反/M6-APA×t×V菌

式中:M6-APA:6-APA分子量，為216；t:反應(yīng)時間，通常為30 min；V菌:參與反應(yīng)的菌液體積，mL；V反:反應(yīng)體系體積，mL；C6-APA:6-氨基青霉烷酸的質(zhì)量濃度，g/L.

表2　標(biāo)準(zhǔn)曲線制作試劑添加量

2結(jié)果與分析

2.16-APA標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

由圖1可見，線性回歸方程為y=0.582 9x+0.006 2，R2=0.998 9，表明線性關(guān)系好.在測定酶活力時將測定的吸光值代入上述回歸方程可求出6-APA濃度，再依據(jù)酶活力計算公式則能求出酶活力大小.

2.2巨大芽孢桿菌PGA工程菌的構(gòu)建

2.2.1巨大芽孢桿菌基因組DNA的提取本試驗成功提取了巨大芽孢桿菌的基因組DNA.該基因組DNA經(jīng)紫外分光光度法檢測，得到OD260/OD280值為1.86，證明巨大芽孢桿菌基因組DNA純度比較高，可用于下一步實驗.

圖1　6-APA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　6-APAstandard curve

2.2.2PGA基因擴(kuò)增PCR電泳由圖2可見，利用設(shè)計的特異性引物擴(kuò)增出PGA基因，得到約2 400 bp的目的片段.瓊脂糖凝膠電泳檢測后，在約2 000 bp處左右出現(xiàn)1條特異性條帶，可以看出該片段大小與Genbank上報道的巨大芽孢桿菌PGA基因的片段大小2 409 bp相符.陽性克隆經(jīng)過測序，再經(jīng)BLAST比較后證明PGA序列正確，與相應(yīng)基因的同源性可達(dá)到99%.但在100 bp左右處出現(xiàn)的條帶可能是非特異性擴(kuò)增.故理論上本試驗所提取的目的蛋白應(yīng)具有青霉素酶活性.

M：DSTM2000；1：PCR產(chǎn)物圖2　巨大芽孢桿菌PGA基因PCR電泳圖Fig.2　The electrophoresis pattern of Bacillus megaterium PGA gene

2.2.3pGM-T-PGA及PMA5雙酶切圖3為pGM-T-PGA經(jīng)EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳圖.

圖3所示，用EcoRⅠ、BamHⅠ酶切克隆產(chǎn)物pGM-T-PGA后，得到了一個與目的基因PGA基因(2409 bp)大小相同的小片段和一個與T克隆載體pGM(3015 bp)大小相同的大片段.目的基因PGA經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收，以便用于與pMA5穿梭載體連接構(gòu)建重組體.

M：DSSM1135000；1：重組質(zhì)粒EcoRⅠ/BamHⅠ酶切產(chǎn)物圖3　pGM-T-PGA雙酶切產(chǎn)物電泳圖Fig.3　The products of recombinant plasmid pGM-T-PGA by enzyme digestion

由圖4可見，因為本試驗所選取的枯草芽孢桿菌表達(dá)載體pMA5的環(huán)狀鏈上無EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，所以試驗用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、BamHⅠ雙酶切枯草芽孢桿菌表達(dá)載體pMA5，獲得了線性載體pMA5片段大約為7.5 kb.利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收載體pMA5片段，以便于下一步重組試驗的進(jìn)行.

M：DSTM20000；1：質(zhì)粒PMA5 NdeⅠ/BamHⅠ雙酶切產(chǎn)物圖4　PMA5雙酶切產(chǎn)物電泳圖Fig.4　The products of plasmid PMA5 by enzyme digestion

2.2.4PMA5-PGA重組體雙酶切鑒定將陽性轉(zhuǎn)化子雙酶切后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，以DNAmakerDSTM20000作為對照，在大約9 900 bp處有條帶出現(xiàn)，表明試驗獲得了9 900 bp的PGA重組質(zhì)粒pMA5-PGA目的片段，如圖5所示.

M：DSTM20000；1：重組質(zhì)粒PMA5-PGA圖5　重組質(zhì)粒PMA5-PGA雙酶切產(chǎn)物電泳圖Fig.5　The products of recombinant plasmid PMA5-PGA by enzyme digestion

2.2.5PMA5-PGA重組體PCR鑒定由圖6可見，在經(jīng)2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測上述擴(kuò)增產(chǎn)物后，發(fā)現(xiàn)約在2 000 bp處擴(kuò)增出了特異性條帶，且該片段大小約為2 409 bp，這與目的PGA基因的片段大小相符.

M：DSTM2000；1：PMA5-PGA重組體PCR產(chǎn)物圖6　PMA5-PGA重組體PCR電泳圖Fig.6　The electrophoresis pattern of recombinant plasmid PMA5-PGA

2.2.6PMA5-PGA重組體序列測定重組體pMA5-PGA經(jīng)測序檢測證明載體pMA5(7.5 kb)與PGA基因(2 409 bp)正確連接.以上結(jié)果證明PGA基因成功地插入到了pMA5，將重組表達(dá)質(zhì)粒命名為枯草芽孢桿菌10 397(pMA5-PGA).即本試驗成功構(gòu)建出巨大芽孢桿菌青霉素G?；?枯草芽孢桿菌的工程菌.

2.3重組菌的表達(dá)及PGA酶活力檢測

如圖7所示，將基因工程菌和空白菌發(fā)酵上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，工程菌上清在約28 ku處出現(xiàn)一條特異性條帶，與預(yù)期青霉素成熟肽分子量大小相符，而空白菌在28 ku處無條帶.說明青霉素酶基因在枯草芽孢桿菌10397(pMA5-PGA)中得到了表達(dá)，另外基因工程菌上清中有少許雜蛋白，但并不影響青霉素酶的分離純化.

M：protein marker；1：空白菌10397發(fā)酵上清；2：枯草芽孢桿菌10397(PMA5-PGA)發(fā)酵上清液.圖7　表達(dá)蛋白的SDS-PAGE分析Fig.7　SDS-PAGE analysis of protein expression

將上述枯草芽孢桿菌工程菌在37 ℃、220 r/min、36 h發(fā)酵產(chǎn)PGA酶的酶活可達(dá)12.426 U/mL.

2.4pMA5-PGA質(zhì)粒穩(wěn)定性檢測結(jié)果

枯草芽孢桿菌中構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒應(yīng)首先考慮的因素就是質(zhì)粒的穩(wěn)定性.一般來說，pUB110衍生質(zhì)粒最穩(wěn)定.本試驗中所用的穿梭表達(dá)質(zhì)粒pMA5就是在枯草桿菌質(zhì)粒pUB110的基礎(chǔ)上構(gòu)建的.由上圖8可看出，經(jīng)過連續(xù)8 d的傳代試驗，本試驗所構(gòu)建的工程菌的產(chǎn)酶量無明顯下降，由此表明重組菌的穩(wěn)定性很高.

圖8　傳代次數(shù)與酶活力關(guān)系Fig.8　The realationship between enzyme activity and the number of generations

3討論

本研究綜合了巨大芽孢桿菌能夠向細(xì)胞外分泌青霉素G?；概c枯草芽孢桿菌高表達(dá)率的優(yōu)點(diǎn).以巨大芽孢桿菌PGA基因為基礎(chǔ)，將其擴(kuò)增后轉(zhuǎn)導(dǎo)入作為宿主的枯草芽孢桿菌中，獲得了能夠產(chǎn)PGA的枯草芽孢桿菌工程菌.研究所選用的表達(dá)載體pMA5為巨大芽孢桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體，這對于試驗成功構(gòu)建巨大芽孢桿菌-PGA-枯草芽孢桿菌的基因工程菌起到了很大的作用.且表達(dá)載體pMA5在枯草桿菌質(zhì)粒pUB110的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，所以質(zhì)粒的穩(wěn)定性很高，在通過對工程菌連續(xù)8 d的傳代試驗后，發(fā)現(xiàn)其酶活力保持平穩(wěn)狀態(tài).

獲得的枯草芽孢桿菌工程菌在37 ℃、220 r/min、36 h發(fā)酵產(chǎn)PGA酶的酶活可達(dá)12.426 U/mL，比2013年顏麗等[12]通過巨大芽孢桿菌產(chǎn)PGA的酶活提高了5.26倍；比2001年黃鶴等[13]構(gòu)建的能夠分泌表達(dá)巨大芽孢桿菌PGA基因的重組枯草芽孢桿菌菌株產(chǎn)PGA的酶活6 U/mL，提高了2.1倍.證明本研究所構(gòu)建的枯草芽孢桿菌工程菌能夠高產(chǎn)青霉素G?；?

參考文獻(xiàn)

[1]Chou C P,Yu C C,Tseng J H.Genetie pulsation to identify limiting steps and develop-strategies for high-level expression of penicillin acylase inEscherichiacoli[J].Biotechnology,1999,63(3):263

[2]黃琳,劉逸寒,王春霞，等.產(chǎn)青霉素酶枯草芽孢桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].生物技術(shù),2011,21(6):77-80

[3]黃艷紅,張籟,儲瑞蕾，等.巨大芽孢桿菌青霉素G?；富虻目寺〖霸诖竽c桿菌中的表達(dá)[J].生物化學(xué)和生物物理學(xué)報,1999,30(2):107-113

[4]崔鵬,萬敏.青霉素?；傅纳a(chǎn)與應(yīng)用新進(jìn)展[J].化學(xué)工業(yè)與技術(shù),2005,26(6):42-45

[5]張?zhí)m芳,張偉忠,張其玖.巨大芽孢桿菌青霉素G?；富虻目寺『捅磉_(dá)[J].生物工程學(xué)報,2000,7(1):47-53

[6]Martin L,Prieto M A,Cortes E,et al.Cloning and sequencing of the PGA gene encoding the penicillin G acylase ofBacillusmegateriumATCC 14945[J].FEMS Microbiology Letters,1998,125(7):28-32

[7]Kang J H,Hwang Y,Yoo O J.Expression of penicillin G acylase gene fromBacillusmegateriumATCC14945 inEscherichiacoliandB.subtilis[J].Journal of Biotechnology,2002,17(2):99-108

[8]Kang J H,Kim S J,Park Y C,et al.Nucleotide sequence of the penicillin G acylase gene fromBacillusmegateriumand characteristics of the enzyme[J].Misainmurhag Hoiji,2006,32:215-221

[9]Huang Y H,Zhang Y,Chu R A,et al.Cloning and expression of the PGA gene of Bacillus megaterium inE.coli[J].Biochemical and Biophysical Science,2000,30(2):107-113

[10]黃艷紅,袁中一,王應(yīng)睞.巨大芽孢桿菌青霉素?；冈诳莶菅挎邨U菌中的表達(dá)及其分離純化[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報,1999,15(1):169-171

[11]Balasingham K,Wathurton D,Dunnili P,et al.The isolation and kinetics of penicillin amidase fromEscherichiacoli[J].Biochemical and Biophysical Science,2011,276:250-256

[12]顏麗,張永玲,楊富民，等.巨大芽孢桿菌產(chǎn)青霉素G?；傅臈l件優(yōu)化[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2013,12(6):140-148

[13]黃鶴,楊晨,李仁寶,等.重組青霉素G?；冈诳莶菅勘U菌中的表達(dá)條件優(yōu)化[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報,2001,17(2):173-177

(責(zé)任編輯胡文忠)

Construction of penicillin G acylase-producing engineering strain

SHAO Wei-ping1,WU Zhuo-ying1,ZHANG Yong-ling2,YANG Fu-min1,TIAN Chang-qing3

(1.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Linxia People′s Hospital,Linxia 731100,China;3.College of Life Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Abstract：【Objective】 This study was to construct the penicillin G acylase-producing engineerng strain from Bacillus subtilis.【Method】 Firstly,the PGA gene of B.megaterium was amplified by PCR and tested by agarose gel electrophoresis.Then the target gene was linked with expression vector PMA5 and transfected into expression host B.subtilis 10 397.【Result】 Finally the PMA5-PGA (about 9.9 kb) was constructed and transfected into B.subtilis 10 397.The SDS-PAGE showed that the target gene was expressed successfully.As a result,when the engineering strain was cultured at 37 ℃,220 r/min for 36 h,the activity of penicillin G acylase reached 12.426 U/mL,which was 5.26 times more than B.megaterium was cultured.【Conclusion】 The B.subtilis engineering strain can obtain high penicillin G acylase.

Key words：penicillin G acylase;PCR;recombinant expression;gene engineering bacteria

基金項目：甘肅省科技重大專項(1102NKDN058).

收稿日期：2015-03-06；修回日期：2015-04-20

中圖分類號：Q 815

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1003-4315(2016)01-0132-06

第一作者：邵威平(1969-)，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事發(fā)酵工程研究.E-mail：shaowp99@163.com