張捷，李發(fā)弟，李愛軍，鄭楠，李松勵，王加啟

(1．甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，甘肅 蘭州　730070；2．唐山市畜牧水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測中心，河北 唐山　063000；

3．中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室(北京)，北京　100193；

4．中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京　100193)

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赭曲霉毒素A誘導Caco-2細胞的細胞毒性及DNA損傷

張捷1,3,4，李發(fā)弟1，李愛軍2，鄭楠3,4，李松勵3,4，王加啟1,3,4

(1．甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，甘肅 蘭州730070；2．唐山市畜牧水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測中心，河北 唐山063000；

3．中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室(北京)，北京100193；

4．中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京100193)

摘要：【目的】 研究不同濃度和時間處理下，赭曲霉毒素A(OTA)對人結(jié)腸癌細胞(Caco-2)的細胞生長抑制、氧化損傷以及DNA損傷的影響.【方法】 采用0.32、1.6、8、40、200 μmol/L OTA處理Caco-2細胞24、48、72 h后，利用甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測細胞存活率，利用活性氧(ROS)試劑盒檢測細胞內(nèi)的自由基水平，利用彗星試驗檢測細胞的DNA損傷.【結(jié)果】 在各個處理時間段內(nèi)，OTA濃度大于0.32 μmol/L時，OTA對細胞存活率都有顯著的抑制作用(P<0.05)；細胞內(nèi)ROS以及DNA損傷都隨OTA濃度的增加而顯著升高(P<0.05)，尤其在0～8 μmol/L低濃度范圍內(nèi)，OTA顯示了強烈的毒性.【結(jié)論】 OTA可導致Caco-2細胞存活率降低，引起細胞氧化應激以及DNA損傷，其中ROS水平升高可能是OTA導致Caco-2細胞DNA損傷的原因.

關(guān)鍵詞：赭曲霉毒素A；MTT；ROS；彗星試驗；DNA損傷

赭曲霉毒素A (OTA)主要是由純綠青霉，赭曲霉和炭黑曲霉產(chǎn)生的真菌毒素，廣泛存在于自然界，能污染多種植物產(chǎn)品和食品，如玉米、大豆、可可、中草藥等，對人類的健康造成了重大威脅，引起了人們的廣泛關(guān)注.OTA的危害性被認為是僅次于黃曲霉毒素，被國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)列為2B類致癌物[1].

目前研究發(fā)現(xiàn)OTA具有腎毒性、肝毒性、致畸性、致突變、致癌性、神經(jīng)毒性、免疫毒性等生物學效應.有研究表明OTA可以抑制豬腎小管上皮細胞的生長[2]，誘導肝細胞膜增厚、溶解[3]，可通過懷孕小鼠的胎盤到達致命器官并能與DNA形成加和物[4]，損傷海馬神經(jīng)元細胞[5]，誘導細胞基因突變[6]和誘導腎小管細胞腺瘤的產(chǎn)生從而導致腎小管細胞腺癌[7]，抑制體外培養(yǎng)的T和B淋巴細胞增殖，并可以減少IL-2和IL-2受體的產(chǎn)生[8].腸道作為身體接觸外來物質(zhì)的第一道屏障，但是關(guān)于OTA在腸道及腸道細胞的研究卻鮮有報道.本試驗用一定濃度的OTA處理人結(jié)腸癌細胞(Caco-2)，用MTT法，活性氧檢測法和彗星試驗法研究OTA對Caco-2細胞的細胞毒性及DNA損傷，旨在豐富OTA對人腸道細胞DNA損傷作用的數(shù)據(jù)并為食品質(zhì)量安全分析評估提供參考.

1材料與方法

1.1材料和試劑

Caco-2(human colon adenocarcinoma)細胞株：美國ATCC公司；DMEM(dulbecco′s modified eagle medium)培養(yǎng)基，胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)：美國Gibco公司；四甲基偶氮唑藍[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]，二甲基亞砜(DMSO)，碘化丙啶(PI)：美國Sigma公司；ROS測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；PBS磷酸鹽緩沖溶液，胰蛋白酶液，青霉素鏈霉素混合液：碧云天生物技術(shù)研究所；OTA標準品：美國Fermentek公司；非必需氨基酸(nonessential amino acid，NEAA)，漢克平衡鹽溶液(hank′s balanced salt solution，HBSS)：邁晨科技(北京)科技有限公司；低熔點瓊脂糖，瓊脂糖：美國Amresco公司.其余試劑：國產(chǎn)分析純.毒素母液配制：將5 mg OTA，溶解于1 mL甲醇中，配成濃度為5 mg/mL的母液，-20 ℃冷凍儲存.

1.2試驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)Caco-2細胞在含有10%胎牛血清、10%NEAA、100 U/L青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度環(huán)境下常規(guī)培養(yǎng).當細胞生長至80%～90%融合時，用胰蛋白酶溶液消化細胞.

1.2.2細胞活力的測定活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能與MTT反應形成不溶于水的紫色結(jié)晶物甲瓚，用MTT法通過測定甲瓚的吸光度來來測定細胞活力[9].取96孔培養(yǎng)板，每孔加入100 μL細胞懸液，Caco-2細胞濃度為6×103個/孔，37 ℃培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，處理組加入含有不同濃度(0.32、1.6、8、40、200 μmol)OTA的無血清處理液，對照組加入100 μL只含有相應甲醇濃度的DMEM無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后除去培養(yǎng)液，加入0.5 mg/mL MTT-DMEM孵育4 h，吸除培養(yǎng)基后，加入100 μL DMSO搖晃5 min，以完全溶解出MTT紫色結(jié)晶產(chǎn)物.用酶標儀(Thermo，美國)在570 nm處(以630 nm為參考波長)測定吸光度值.試驗重復3次，每組有5個重復.

1.2.3細胞內(nèi)ROS含量的測定細胞內(nèi)ROS水平由熒光探針(2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽)DCFH-DA 來測定.DCFH-DA 穿過細胞膜，酶促后水解形成非熒光的二氯熒光黃.后者在ROS存在下，被迅速的氧化形成高熒光性的二氯熒光黃(DCF)[10].DCF的熒光強度顯示出ROS的含量.取96孔黑板，每孔加入100 μL細胞懸液，Caco-2 細胞濃度為1×104個/孔.24 h后，分別加入0.32、1.6、8、40、200 μmol/L的OTA以及100 mmol/L H2O2陽性對照.37 ℃培養(yǎng)24 h，去除培養(yǎng)基后，加入含100 mmol/L DCFH-DA的HBSS于37 ℃孵育40 min，每個濃度6個平行.用酶標儀，在激發(fā)波長485 nm以及發(fā)射波長530 nm時測定ROS.試驗重復3次，每組有5個重復.ROS水平(%)用處理組細胞和對照組細胞吸光值的比值來確定.

1.2.4彗星試驗堿性彗星試驗法學參考Corcuera等[11]的方法.DNA損傷的程度由以下3個參數(shù)來定量：尾部DNA百分含量：彗星尾部DNA的總熒光強度；尾長：彗星頭部的中心到尾部末端的水平距離；尾距：彗星頭部中心到尾部中心的距離與尾部DNA百分含量的乘積.用不同濃度(0.32、1.6、8、40、200 μmol/L)的OTA處理細胞24 h，100 μmol/L H2O2作為陽性對照.處理結(jié)束后，細胞用冷PBS清洗后用胰酶消化，然后細胞重懸于完全培養(yǎng)基.70 μL細胞懸液(3×105個/mL)與0.75%低熔點瓊脂糖混合后，立刻涂到含有1%常熔點瓊脂糖的玻璃片上.玻璃片放到4 ℃環(huán)境5 min.將玻璃片放到4 ℃細胞裂解液(2.5 mol/L NaCl,10 mmol/L Tris,100 mmol/L EDTA,1% Triton X-100 and 10% DMSO,pH 10.0)中1.5 h來消除細胞蛋白.細胞裂解后，將玻璃片平放到4 ℃電泳液(300 mmol/L NaOH和1 mmol/L EDTA,pH>13)中，20 min后直到DNA解旋并且露出堿不穩(wěn)定點，之后在25 V,300 mA電泳20 min.用中和液(0.4 mol/L Tris,pH 7.5)中和.最后用碘化丙啶(10 μg/mL)染色并且用熒光顯微鏡拍照.每張玻璃片上隨機選擇50個細胞照相，照片用casp軟件(http://casp.sourceforge.net)分析.試驗重復3次.

1.3 數(shù)據(jù)處理

2結(jié)果與分析

2.1OTA對Caco-2細胞毒性作用

用MTT法評估各種濃度的OTA處理Caco-2細胞24、48、72 h后，Caco-2細胞的存活率.由圖1所示，與對照組相比，OTA濃度為8 μmol/L時，細胞活性下降較明顯(P<0.05)，24、48、72 h處理，細胞活性分別降低了36%、46%、60%.與OTA濃度為8 μmol/L時相比，OTA在200 μmol/L時，降低幅度分別為17%、14%、14%.由此可知， 較低濃度的OTA，已經(jīng)發(fā)揮急性毒性作用.

圖1　由OTA誘導的Caco-2細胞的細胞毒性Fig.1　Cytotoxicity effects of OTA of exposure on Caco-2 cell

2.2OTA對Caco-2細胞ROS的影響

本試驗中，陽性對照H2O2導致ROS水平升高極顯著(P<0.01)，如圖2所示.此外，OTA誘導的Caco-2細胞內(nèi)ROS水平呈濃度依賴性增加.處理24 h后，當OTA濃度為8～40 μmol/L時，處理組ROS水平顯著高于對照組(P<0.05)；當OTA濃度為200 μmol/L時，處理組ROS水平極顯著高于對照組(P<0.01).在48、72 h處理組中，當OTA濃度為1.6 μmol/L時，處理組的ROS水平極顯著高于對照組(P<0.01).處理72 h后，當OTA濃度大于等于40 μmol/L時，ROS水平都高于陽性對照組，當OTA濃度為200 μmol/L時，ROS水平顯著高于陽性對照組，是陽性對照組的1.28倍(P<0.05)，陰性對照組的2.23倍(P<0.05).

圖1　OTA誘導對Caco-2細胞產(chǎn)生ROS的影響Fig.1　Effects of OTA on generationin in Caco-2 cell

2.3彗星試驗結(jié)果

用彗星試驗來評估不同濃度的OTA對Caco-2細胞的DNA損傷程度.每組代表性受損Caco-2細胞的顯微照片如圖3中所示.

由表1所示，各濃度OTA對Caco-2細胞DNA都存在一定的損傷.OTA和過氧化氫誘導的DNA損傷呈時間和劑量依賴性.當OTA濃度大于1.6 μmol/L時，尾部DNA百分含量在各個處理的時間點都顯著高于對照組(P<0.05).DNA尾距在72 h內(nèi)，OTA所有濃度處理組顯著高于對照組(P<0.05).陽性對照過氧化氫(100 μmol/L)在各個時間點都能顯著誘導DNA損傷(P<0.05)，當OTA濃度為200 μmol/L時，對DNA損傷顯著高于陽性對照組(P<0.05)，在48 h和72 h時，OTA對DNA的損傷與陽性對照組相比差異不顯著(P>0.05).

A：對照組;B：0.32 μmol/L OTA；C：1.6 μmol/L OTA；D：8 μmol/L OTA；E：40 μmol/L OTA；F：200 μmol/L OTA；H：100 μmol/L H2O2.圖3　由OTA處理24 h后的Caco-2細胞DNA損傷的彗星圖片(×200)Fig.3　Comet images of OTA induced DNA damage in Caco-2 cells

濃度/(μmol·L-1)尾部DNA含量/%24h48h72h尾長/(μmol·L-1)24h48h72h尾距24h48h72hODA處理00.10±0.02a0.14±0.03a0.20±0.04a3.16±0.50a3.59±0.62a4.29±0.85a0.24±0.04a0.31±0.03a0.42±0.03a0.320.15±0.02a0.17±0.01a0.24±0.04a3.12±0.49a3.53±0.51a4.82±0.73b0.36±0.03b0.44±0.03b0.52±0.07b1.61.4±0.29b1.59±0.16b1.90±0.38b4.65±0.79b5.06±0.75b5.24±0.83b0.40±0.05c0.50±0.06c0.62±0.08c82.33±0.28c2.53±0.24c2.96±0.30c6.18±0.81c6.76±0.44c7.06±0.83c0.74±0.09d0.91±0.06d1.10±0.08d402.56±0.50c2.69±0.31d3.40±0.45d7.00±0.87d7.59±0.63d8.12±0.60d0.81±0.07e1.05±0.16e1.22±0.06e2003.45±0.68d3.58±0.28e4.23±0.32e8.12±0.78e8.82±0.64e10.12±0.86e0.96±0.03f1.19±0.15f1.31±0.05fH2O21003.12±0.34e3.20±0.42f3.80±0.35f7.94±0.94e8.53±0.62e8.94±0.66f0.90±0.07g1.12±0.11f1.29±0.07f

同列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).

3討論

OTA是由真菌產(chǎn)生的次級毒性代謝產(chǎn)物，廣泛存在于各種食品和飼料中，對人畜具有很強的毒性.有研究表明OTA對肝、腎、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等都具有潛在的毒性[8]，Heussner等[2]，牛鐘相等[12]和Arbillaga等[13]研究發(fā)現(xiàn)OTA可以對雞和豬的腸細胞，腎細胞等造成DNA損傷[2,12-13].然而，OTA對于人腸道作用的生物學數(shù)據(jù)較少，尤其是OTA對于人腸道細胞DNA的損傷作用，更是鮮有報道.本試驗分別從細胞毒性和DNA損傷兩個方面研究了OTA對人腸道細胞的危害.

3.1OTA對人Caco-2細胞的細胞毒性

動物機體受到外源性毒素攻擊時，體內(nèi)的自由基會增多，致使細胞受損或細胞死亡.本試驗中，OTA能夠顯著降低(P<0.05)Caco-2細胞活力，并且對Caco-2細胞的活力影響呈時間和劑量依賴性，Saadatmandi等[14]研究發(fā)現(xiàn)OTA對豬腎細胞(LLC-PK1)活力影響呈劑量依賴性，Ali等[15]研究發(fā)現(xiàn)OTA對倉鼠卵巢細胞(CHO)和人類淋巴母細胞(TK-6)活力影響均呈劑量依賴性，與本試驗研究結(jié)果相一致.細胞試驗中，OTA在24、48、72 h的IC50值分別在>40 μmol/L，30 μmol/L和5 μmol/L左右，Arbillaga等[13]在人腎小管小皮細胞(HK-2)研究發(fā)現(xiàn)，OTA處理HK-2細胞6 h，IC50值大于600 μmol/L和韓薇等[16]對敘利亞倉鼠腎細胞(BHK)研究發(fā)現(xiàn)，OTA處理BHK細胞24 h，IC50值為5 μg/mL左右，與本試驗結(jié)果稍有差別，可能是由于細胞以及處理時間的不同導致了結(jié)果的差異.

陳平等[17]研究發(fā)現(xiàn)OTA破壞了豬空腸上皮細胞(IPEC- J2)結(jié)構(gòu)功能完整性，最終導致細胞的增殖或存活率降低，氧化應激可能是毒性效應發(fā)生的重要機制.Rahimtula等[18]的研究發(fā)現(xiàn)OTA能通過增加脂質(zhì)過氧化，引起動物體內(nèi)的毒性作用.Saadatmandi等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，OTA可以降低豬腎小管細胞(LLC-PK1)超氧化物歧化酶的活性，導致谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶(GST)活動的障礙并增強細胞內(nèi)ROS的水平，而后可能通過AP-1和Nrf2相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導通路影響OTA引起的腎毒性.

3.2OTA對人Caco-2細胞的DNA損傷

本試驗中，ROS含量以及DNA損傷隨OTA的濃度增加而顯著增加(P<0.05).當OTA濃度為8 μmol/L 時，ROS水平及DNA損傷水平顯著升高(P<0.05).研究發(fā)現(xiàn)許多外源性物質(zhì)可以誘導細胞內(nèi)的氧化還原反應，產(chǎn)生ROS，OTA也可以引起ROS的產(chǎn)生.ROS以核酸、蛋白、脂肪和一些生物小分子(抗壞血酸、生物胺等)為靶標，通過一系列調(diào)節(jié)機制，干擾基因表達從而引起細胞的氧化損傷.Schaaf等[19]研究表明，活性氧的產(chǎn)生過剩，可以直接或者間接的擾亂細胞大分子如DNA、蛋白質(zhì)或脂肪的生理功能及其完整性，最終導致DNA的斷裂或者細胞膜受損.研究表明，OTA可以氧化鳥嘌呤加和物，導致DNA片段化而引起DNA的損傷[14-15,20].韓薇等[16]研究發(fā)現(xiàn)，OTA能導致敘利亞倉鼠腎細胞細胞活力下降，彗星DNA含量和拖尾現(xiàn)象均與OTA呈劑量依賴關(guān)系，可能是由于OTA處理的細胞中超氧化物歧化酶活力顯著降低引起.Sava等[5]發(fā)現(xiàn)OTA能誘導脂質(zhì)過氧化并抑制DNA的氧化性修復損傷.

腸道是一種與含有毒素的食品接觸非常頻繁的器官.從本試驗可以看出，OTA可能損害腸細胞內(nèi)氧化反應以及DNA的完整性.因此，長期食用含有OTA的食物會對腸道健康產(chǎn)生一定的風險.

4結(jié)論

OTA能夠誘導Caco-2細胞活性顯著下降，以及細胞內(nèi)ROS水平和DNA損傷的顯著上升，并且在低濃度時，就對細胞產(chǎn)生了嚴重的損傷，其中ROS的產(chǎn)生對DNA損傷起了很重要的作用.

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(責任編輯李辛)

The cytotoxic effects and DNA damage induced by ochratoxin A on Caco-2 cells

ZHANG Jie1,3,4，LI Fa-di1，LI Ai-jun2，ZHENG Nan3,4，LI Song-li3,4，WANG Jia-qi1,3,4

(1.College of Animal Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China；2.Tangshan Livestock and Aquatic Products Quality Monitoring Centor,Tangshan 063000,China；3.Ministry of Agriculture Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Dairy Products (Beijing),Institute of Animal Science,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100193,China；4.State Key Laboratory of Animal Nutrition,Institute of Animal Science,CAAS,Beijing 100193,China)

Abstract：【Objective】 The research was to investigate the cytotoxic effect,oxidative damage and DNA damage induced by different concentration of OTA on Caco-2 cells.【Method】 Caco-2 cells were treated with OTA at concentrations of 0.32，1.6，8，40，200 μmol/L for 24 h ,48 h and 72 h to detect cell survival rate using MTT assay,to assess the free radical levels of by reactive oxygen species(ROS) kit and to evaluate DNA damage using comet assay.【Result】 OTA with the concentration over 0.32 μmol/L had obvious inhibitory effect on survival rate of Caco-2 cells (P<0.05) at each treated period.ROS levels and DNA damage were increased significantly with the increase of OTA concentration compared to the control group (P<0.05).Notably,OTA showed very high cytotoxicity at the relatively low concentrations of 0～8 μmol/L.【Conclusion】 OTA possessed cytotoxicity and could induce oxidative stress and DNA damage in Caco-2 cells.Increase of ROS levels might contribute to the DNA damage induced by OTA in Caco-2 cells.

Key words：ochratoxin A;MTT；ROS;Comet assay;DNA damage

通信作者：王加啟，男，研究員，主要從事奶牛營養(yǎng)研究.E-mail:jiaqiwang@vip.163.com

基金項目：公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項項目“生鮮乳質(zhì)量安全評價技術(shù)與生產(chǎn)規(guī)程”(201403071)；生鮮乳質(zhì)量安全風險評估專項(2014-z3)；中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程(ASTIP-IAS12)

收稿日期：2015-03-23；修回日期：2015-04-11

中圖分類號：Q 279

文獻標志碼：A

文章編號：1003-4315(2016)01-0018-06

第一作者：張捷(1987-)，男，碩士研究生，研究方向為生鮮乳質(zhì)量安全.E-mail:kankanhard@126.com