孫維佳，吳慶峰，張曉梅

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯154003;2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

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馬齒莧對(duì)戊四氮致癲癇大鼠海馬細(xì)胞凋亡和Caspase-3基因表達(dá)的影響①

孫維佳1,2，吳慶峰1，張曉梅1

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯154003;2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

摘要：目的：探索馬齒莧對(duì)戊四氮(PTZ)致癇大鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用。方法：應(yīng)用戊四氮隔日腹腔注射制造癲癇慢點(diǎn)燃大鼠模型。將48只Wistar雄性大鼠分成4組：正常對(duì)照組、戊四氮組、低劑量馬齒莧組、高劑量馬齒莧組、，每組6只。采用WESTBLOT法檢測(cè)Caspase-3檢測(cè)大鼠海馬組織內(nèi)Caspers-3蛋白變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡數(shù)量變化。結(jié)果：PTZ組的神經(jīng)元凋亡細(xì)胞和Caspase-3的表達(dá)明顯增多，應(yīng)用馬齒筧的兩組癲癇大鼠的神經(jīng)細(xì)胞的凋亡受到了抑制，減少了Caspase-3的表達(dá)。結(jié)論：馬齒莧有保護(hù)癲癇大鼠腦組織的作用，且長(zhǎng)期大劑量的效果顯著，為了給臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)通過實(shí)驗(yàn)觀察馬齒莧對(duì)戊四氮致癇大鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用，探索馬齒筧在改善癲癇方面的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：馬齒莧；戊四氮；癲癇；細(xì)胞凋亡；Caspers-3

癲癇是慢性反復(fù)發(fā)作性短暫腦功能失調(diào)綜合征，反復(fù)癇性發(fā)作表現(xiàn)為腦神經(jīng)元異常放電，引起發(fā)作性意識(shí)喪失。癲癇持續(xù)狀態(tài)可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)急癥及持久性損害，尤其對(duì)海馬神經(jīng)元損傷較大，根據(jù)流行病學(xué)檢測(cè)，我國(guó)癲癇患者，一般人群的癲癇年發(fā)病率為50~70/10萬，患病率約為5‰[1，2]。其中難治性癲癇的患者約占25%。傳統(tǒng)治療多為西藥，副作用較大，而中藥馬齒莧為馬齒莧科植物馬齒莧的干燥地上部分。性寒，味酸，具有清熱解毒、涼血止血的功效，現(xiàn)代對(duì)馬齒莧的藥理作用研究多集中在其抗炎、抗病毒作用方面。近年來隨著研究的深入，對(duì)馬齒莧的研究擴(kuò)展到抗腫瘤、降血脂、增強(qiáng)免疫力、抗氧化等發(fā)面，并已經(jīng)取得了一定的成果[3，4]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用PTZ致癇大鼠模型，給予中藥馬齒莧干預(yù)，研究馬齒莧對(duì)PTZ致癲癇大鼠海馬細(xì)胞凋亡和Caspers-3蛋白表達(dá)的影響，探求馬齒莧對(duì)癲癇大鼠的神經(jīng)元保護(hù)作用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備：健康Wistar雄性大鼠60只，8~10周齡，體重200~250g，購(gòu)買與齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

②實(shí)驗(yàn)藥物：馬齒莧(購(gòu)買于齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科并經(jīng)鑒定，由安國(guó)市藥興藥材有限公司飲片加工廠)使用下述方法制備成濃度分別為g/mL的水煎醇提液：(1)用10倍體積的蒸餾水中浸泡生藥2h，(2)加熱至沸騰后，再用小火煎1h，過濾后收集；(3)再加入10倍體積的蒸餾水，沸騰后小火煎1h，過濾后收集濾液。(4)重復(fù)步驟(3)；(5)混合(2)、(3)過濾液，再濃縮至濃度100%的中藥液，過濾后收集；(6)使用磁力攪拌器邊攪邊加入3倍量無水乙醇，持續(xù)攪拌，放置24h；(7)過濾，用離心機(jī)2000rpm/min離心30min，吸取上清液；(8)上清液將無水乙醇全部揮發(fā)，從而制成濃度為g/mL的溶液；(9)高溫高壓滅菌，分裝后放置4℃保溫箱保存。計(jì)算實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥劑量，按體重計(jì)算，成人馬齒莧1日劑量為80g(人的標(biāo)準(zhǔn)體重按60kg算)，鼠的一日等效劑量約為6.25×人的1日劑量，低、高劑量分別是等效劑量的0.5、2倍，如上述方法計(jì)算出大鼠的馬齒莧給藥低、高劑量分別3.50g/kg·d、13.93g/kg·d，而制成水煎劑濃度分別為 40%、160%，無菌分裝4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

③制作動(dòng)物模型：將大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只?？瞻捉M：隔日腹腔注射生理鹽水 3.5mL/kg, 共13次。PTZ組：隔日腹腔注射35mg/kg戊四氮，共13次，每日提前30min給予0.9%生理鹽水3.5mL/kg腹腔注射。

低劑量馬齒莧組：除隔日腹腔注射戊四氮外，且每日提前30min給予馬齒莧3.50g/kg·d腹腔注射。

高劑量馬齒莧組：除隔日腹腔注射戊四氮外，每日提前30min給予馬齒莧13.93g/kg·d腹腔注射。

④癲癇級(jí)別評(píng)價(jià)：按Racine分級(jí)方法分為5級(jí)觀察大鼠行為變化：0級(jí)：無驚厥；Ⅰ級(jí)：面肌痙攣，如同濕狗似抖動(dòng)，Ⅱ級(jí)：面、頸部痙攣，表現(xiàn)為點(diǎn)頭扭頭等；Ⅲ級(jí)：一側(cè)前肢陣攣，面部痙攣及節(jié)律性點(diǎn)頭；Ⅳ級(jí)：面部、頸部痙攣、雙側(cè)前肢陣攣伴后肢站立；Ⅴ級(jí)：全身陣攣失去平衡跌倒、面部痙攣、節(jié)律性點(diǎn)頭、前肢陣攣、后肢站立。戊四氮藥物注射后各組大鼠逐漸出現(xiàn)癲癇癥狀，最初呈Ⅱ級(jí)發(fā)作，且時(shí)間短，為癲癇潛伏期。注射結(jié)束后到出現(xiàn)Ⅴ級(jí)發(fā)作時(shí)間的癲癇大發(fā)作持續(xù)時(shí)間為1h，出現(xiàn)Ⅴ級(jí)大發(fā)作，慢點(diǎn)燃模型制備成功，實(shí)驗(yàn)過程中戊四氮組大鼠死亡3只,低劑量馬齒莧組死亡1只。

1.2方法

①標(biāo)本取材：動(dòng)物藥物注射實(shí)驗(yàn)全部結(jié)束24h后，給與10%水合氯醛按體重腹腔注射麻醉，斷頭處死大鼠，取腦組織，在低溫冰塊上分離出雙側(cè)海馬組織，取大鼠右側(cè)海馬組織PBS液沖洗，分離，流式細(xì)胞儀測(cè)定凋亡細(xì)胞。大鼠左側(cè)海馬組織剪碎，按7倍體積加入總蛋白提取液，如樣本40mg配制280μL蛋白提取液。組織使用超聲勻漿粉碎，在4℃下放置1h，使用12000rpm 離心30min，吸取上清液，用BCA試劑盒檢測(cè)標(biāo)本的蛋白濃度，分裝后用-80℃凍存，備用。

② 流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞：大鼠右側(cè)海馬組織細(xì)胞離心沉淀3~5min，加入PBS液，離心沉淀細(xì)胞；稀釋；調(diào)節(jié)其濃度；將細(xì)胞懸液加入PI溶液；混勻后孵育15min，在反應(yīng)管中加入PBS液，流式細(xì)胞儀(FACS)測(cè)定凋亡細(xì)胞。

③ WESTBLOT法檢測(cè)caspase-3：制備不連續(xù)SDS-PAGE。取各組總蛋白40μg，蛋白樣品中加入SDS-PAGE，煮沸7min，使蛋白變性，冷卻后，跑膠。準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜，漂洗蛋白膜2min，4℃封閉過夜，4℃孵育過夜，用TPBS液洗膜5次，每次5min，同時(shí)加入羊抗免 IgG 熒光抗體和羊抗鼠 IgG 熒光抗體( 1：3000，封閉液稀釋)，37℃孵育1h，TPBS 洗膜4次，每次 5min，PBS液洗膜5min。Odyssey遠(yuǎn)紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描，后測(cè)定目標(biāo)帶單位密度，Caspers-3的相對(duì)密度用β-actin做為參照。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0進(jìn)行處理，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1凋亡細(xì)胞率

空白組腦組織海馬區(qū)的細(xì)胞凋亡率最低，僅可見到的少量凋亡細(xì)胞，0.093±0.007，PTZ組凋亡細(xì)胞率最高為0.435±0.033，PTZ組+低馬齒莧組凋亡細(xì)胞率為0.227±0.02。PTZ+高馬齒莧組凋亡細(xì)胞率為0.165±0.014，各組間區(qū)域比較經(jīng)過t檢驗(yàn)(P<0.05)。見表1。

表1　凋亡陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)凋亡率 ±s)

各組間區(qū)域比較經(jīng)過t檢驗(yàn)，為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2Caspase-3蛋白表達(dá)

Caspase-3蛋白：空白組0.28±0.02；PTZ=0.54±0.03；低馬齒莧組0.35±0.03; 高馬齒莧組0.30±0.01。PTZ癲癇組大鼠與正?？瞻讓?duì)照組相比，Caspase-3蛋白水平明顯升高(P<0.05)；馬齒莧干預(yù)后可顯著降低Caspase-3蛋白水平(P<0.05)；低馬齒莧組及高馬齒莧組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2　Caspse-3定量檢測(cè)比較

各組間區(qū)域比較經(jīng)過t檢驗(yàn)，為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3討論

全世界約有五千萬的癲癇患者，患者數(shù)量眾多，癲癇病是一種以反復(fù)癇性發(fā)作為特征的慢性疾病[5]，癲癇的藥物治療一旦開始服藥，大多數(shù)要長(zhǎng)期用藥，直到癲癇得以控制，如患者及家屬隨意停用藥物或減量，可能導(dǎo)致病情加重，甚至出現(xiàn)持續(xù)癲癇狀態(tài)，然而癲癇藥物的不良反應(yīng)也應(yīng)重視，服用一些治療癲癇的西藥例如卡馬西平、苯巴比妥、托吡酯等藥物會(huì)出現(xiàn)肝腎損傷，行為異常、周圍神經(jīng)損害、情緒等異常，認(rèn)知功能受損；眩暈嗜睡、感覺異常、皮疹等等，中藥馬齒莧副作用小、價(jià)格低廉、采集方便等優(yōu)點(diǎn)，藥理作用研究多在抗病毒、抗炎、抗腫瘤、降血脂、增強(qiáng)免疫力抗氧化等[6，7]，但對(duì)癲癇治療，腦保護(hù)未見研究，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PTZ組的神經(jīng)元凋亡細(xì)胞和Caspase-3的表達(dá)明顯增多，而應(yīng)用馬齒莧干預(yù)后的兩組癲癇大鼠的神經(jīng)細(xì)胞的凋亡受到了抑制，減少了Caspase-3的表達(dá)，并且高劑量的馬齒莧效果更好，從而證明了馬齒莧可以治療癲癇，減少腦組織損傷的機(jī)制與抗神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有關(guān)，其抗凋亡的機(jī)制是通過對(duì)Caspase-3蛋白基因的調(diào)控來表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，但這種調(diào)控的分子機(jī)制及其是否有其它調(diào)控機(jī)制還需要下一步的研究，本實(shí)驗(yàn)為尋求難治性癲癇提供新途徑。

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(收稿日期：2015-01-10)

中圖分類號(hào)：R742.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0104(2016)01-0053-02

作者簡(jiǎn)介：孫維佳(1981～)女，黑龍江五大連池人，在讀碩士研究生，主治醫(yī)師。通訊作者：張曉梅(1969～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師，教授,碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:sjkx2727@163.com。

基金項(xiàng)目：黑龍江省教育廳科研項(xiàng)目，編號(hào)：12521543。