徐盛穎，干晶露，張桑桑，聞正順，曲有樂

(浙江海洋學院 食品與醫(yī)藥學院，浙江 舟山 316000)

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水芫花提取物的體外抗氧化活性和抑菌活性研究①

徐盛穎，干晶露，張桑桑，聞正順，曲有樂

(浙江海洋學院 食品與醫(yī)藥學院，浙江 舟山 316000)

摘要：目的：研究紅樹植物水芫花(Pemphis acidula)提取物的體外抗氧化活性和抑菌活性。方法：采用不同溶劑對水芫花進行超聲輔助提取,分別得到石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、丙酮提取物、乙醇提取物、蒸餾水提取物。測定不同提取物對DPPH自由基、羥基自由基(·OH)、超氧陰離子自由基(O2-·)的清除率及還原能力，并用Vc作陽性對照，評價其抗氧化活性；以平板打孔法、光密度法衡量不同提取物對常見致病菌的抑菌活性。結果：丙酮提取物得率最高為11.92%，石油醚提取物得率最低僅為2.11%，各提取物的抗氧化活性順序為：乙醇提取物>丙酮提取物>乙酸乙酯提取物>石油醚提取物>氯仿提取物>蒸餾水提取物，抑菌活性順序為：丙酮提取物、乙醇提取物>蒸餾水提取物、乙酸乙酯提取物>氯仿提取物、石油醚提取物。結論：水芫花提取物有一定抗氧化活性和抑菌活性。

關鍵詞：水芫花提取物；抗氧化活性；抑菌活性；光密度法

水芫花(學名：Pemphis acidula)，為千屈菜科水芫花屬小灌木，分布范圍狹窄偏遠，主要分布于我國臺灣島南部海岸和其他東半球熱帶海岸，目前處于瀕危狀態(tài)。水芫花常被用來制作名貴盆景，目前研究主要集中在其生長環(huán)境與分布，分類學、生殖學和遺傳多樣性等[1]，對于其植物體內成分及藥理活性研究較少[2]，本文對水芫花系統(tǒng)溶劑提取物的抗氧化活性和體外抑菌活性進行了初探，為其后續(xù)研究奠定了基礎。

1實驗材料與儀器

1.1樣品來源及鑒定

水芫花樣品于2010年8月采自海南省西沙永興島，經浙江海洋學院食品與醫(yī)藥學院海洋藥物研究所所長曲有樂教授鑒定為千屈菜科水芫花屬植物水芫花Pemphis acidula 的枝莖，憑證標本存放在浙江海洋學院海洋藥物綜合實驗室(?？茦?08-2室)，標本編號：水芫花20100809。

1.2試劑與儀器

試劑：無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司，分析純，批號：20140121)、石油醚(國藥集團化學試劑有限公司，分析純，批號：20140115)、氯仿(國藥集團化學試劑有限公司，分析純，批號：20120810)、乙酸乙酯(國藥集團化學試劑有限公司，分析純，批號：20130428)、丙酮(國藥集團化學試劑有限公司，分析純，批號：T20060815)、抗壞血酸(國藥集團化學試劑有限公司，分析純，批號：20130801)、鐵氰化鉀(國藥集團化學試劑有限公司，分析純，批號：F20101214)、氯化鈉(國藥集團化學試劑有限公司，分析純，批號：F20080310)、Tris·HCL (國藥集團化學試劑有限公司, 批號：20131212)、營養(yǎng)瓊脂(國藥集團化學試劑有限公司,生化試劑,批號：20111228)、蛋白胨(國藥集團化學試劑有限公司,生化試劑,批號：F20101012)、牛肉浸膏(國藥集團化學試劑有限公司,生化試劑,批號：20131212)、紅霉素軟膏(安徽新和成皖南藥業(yè)有限公司，批號：130709)。

儀器：中藥粉碎機(DFY-400,溫嶺市林大機械有限公司)、超聲波清洗機(WF-180E，寧波海曙五方超聲波設備有限公司)、旋轉蒸發(fā)儀(N-1100，上海愛朗儀器有限公司)、電子天平(BSA323S,賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)、冷凍干燥機(FD-1E,北京德天佑科技發(fā)展有限公司)、低速離心機(TD5K，長沙東旺實驗儀器有限公司)、紫外分光光度計(UV-1100，上海美譜達儀器有限公司)、超凈臺(JB-CJ-1FXS，蘇州佳寶凈化工程設備有限公司)、恒溫培養(yǎng)箱(LHS-250HC，上海慧泰儀器制造有限公司)、全溫培養(yǎng)搖床(HZQ-B，金壇市華城開元實驗儀器廠)、酶標儀(SM800，上海永創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司)。實驗菌種：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、副溶血孤菌，實驗菌種均為浙江海洋學院食品與醫(yī)藥學院水產加工工程實驗室提供。

1.3實驗方法

1.3.1材料預處理

水芫花→粗粉→烘干→粉粹→過篩→保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2系統(tǒng)溶劑提取物的制備

取粉碎的水芫花粉末20g至500mL錐形瓶中，依次加入各提取溶劑400mL，在50 ℃，80W功率條件下超聲45min，重復提取3次，離心取上清液混合，用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮，各濃縮液取液經減壓濃縮得石油醚浸膏、氯仿浸膏、乙酸乙酯浸膏和水提浸膏，將上述浸膏水浴揮干溶劑，稱量重量，計算浸膏得率，放干燥器保存?zhèn)溆肹3]。

1.3.3不同溶劑提取物的體外抗氧化活性研究1.3.3.1供試品和陽性對照品溶液的配制

準確稱量0.25g各溶劑提取浸膏和Vc，分別用無水乙醇溶解于50mL的容量瓶中，經半量稀釋法分別制備成6個濃度梯度的各樣品溶液和Vc陽性對照品溶液，濃度梯度分別為：5.000mg·mL-1、2.500mg·mL-1、1.250mg·mL-1、0.625mg·mL-1、0.313mg·mL-1、0.156mg·mL-1。

1.3.3.2對DPPH自由基清除率的測定[4]

用移液槍移取不同濃度的各供試品溶液1mL加入10mL離心管中，再加1mL的320μmol·L-1的DPPH-乙醇溶液，用無水乙醇稀釋至4mL充分混勻，常溫下避光反應30min后，在517nm處測吸光度A1，以無水乙醇代替供試品溶液測量A0，計算公式如下：

式中：A0-未加入抗氧化物質時測得的溶液平均吸光度值；

A0-加入抗氧化物質后測得的溶液平均吸光度值。

1.3.3.3對羥基自由基(·OH)清除率的測定

取10mL離心管分別加入6mmol·L-1FeSO4溶液、6 mmol·L-1水楊酸溶液和供試品溶液各1mL，混勻，最后加入1mL 6 mmol·L-1H2O2啟動反應，常溫下避光靜置30min后于510nm處測定吸光度A1,以蒸餾水和無水乙醇混合物代替供試品溶液測定A0[5,6]。羥基自由基清除率計算公式同上。

1.3.3.4對超氧陰離子自由基(O2-·)清除率的測定

操作順序如下：取4.5mL Tris-HCl 緩沖溶液(pH=8.2)→25℃靜置30min→加入1mL供試品溶液→加入0.4mL鄰苯三酚溶液→混勻→30℃水浴5min→加入1mL 8mol/L Hcl→終止反應→299 nm測定吸光度A1、以0.1mol·L-1HAc代替供試品溶液測定A0[7]。按2.3.2項下公式計算清除率。

1.3.3.5還原能力的測定

用移液槍移取1mL各供試品溶液于10mL離心管中，分別加入2.5mL的磷酸緩沖溶液(pH=6.6)和2.5mL 1%鐵氰化鉀溶液，混勻，于50℃水浴反應20min，再加入2.5mL的10%三氯乙酸溶液，混勻，低速離心10min，移取上清液、蒸餾水、0.1%FeCl3(按上清液：蒸餾水：0.1%FeCl3=5:5:1)于玻璃試管中常溫反應5min，于700nm處測定吸光度，以吸光度大小來衡量各供試品的還原能力[8]。

1.3.4水芫花提取物抑菌活性研究

1.3.4.1菌懸液的制備

用接種環(huán)取少量細菌于裝有50mL液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，37 ℃下?lián)u床培養(yǎng)24h，涂布平板，檢測備用[9]。

1.3.4.2提取物抑菌活性測定

分別取不同溶劑萃取物，用二甲亞砜溶解并稀釋至質量濃度為100 mg·mL-1的樣品溶液，在每個直徑為9cm培養(yǎng)皿中接種各菌液150μL，將已滅菌的不燙手的營養(yǎng)瓊脂倒平板，與菌液混合均勻。待培養(yǎng)基完全凝固后，用0.8cm打孔器在培養(yǎng)皿上等距離打三個孔，除去孔內培養(yǎng)基。用移液槍往各孔內注入120μL的樣品溶液，空白對照組各孔內注入等量的二甲亞砜溶液，各組均置37℃，70%濕度條件下培養(yǎng)24 h，十字交叉法測定抑菌圈直徑[10，11]。

1.3.4.3光密度法測定不同提取物的最小抑菌濃度(MIC)

根據2.4.2實驗結果，選擇丙酮提取物、無水乙醇提取物和蒸餾水提取物3種極性較大的提取物，進行抑菌率實驗，取一定量的質量濃度為100mg·mL-1的各提取物溶液(用0.22μm濾膜除菌)，與高壓滅菌的肉湯液體培養(yǎng)基等體積混合，半量稀釋法制備濃度梯度如下的各樣品：50mg·mL-1、25mg·mL-1、12.5mg·mL-1、6.25 mg·mL-1、3.125mg·mL-1、1.563mg·mL-1取10μL各菌懸液與200μL各樣品溶液于96孔板混合，以相同濃度的紅霉素軟膏溶液為陽性對照，37℃培養(yǎng)24h，以肉湯液體培養(yǎng)基和生理鹽水混合液為空白調零，測定樣品在630nm處的吸光度值(A樣品)，同時測定樣品空白和對照組的吸光度值。樣品空白(A空白)不加菌懸液，其余條件相同；對照組(A對照)用生理鹽水代替各提取物，其余條件相同。每個樣品平行3次，計算各提取物的抑菌率[12~14]。計算公式如下：

2結果

2.1系統(tǒng)溶劑對水芫花的萃取率

見表1。

表1　系統(tǒng)溶劑對水芫花的提取率(%)

由表1 可以看出不同極性的各溶劑對于水芫花提取率差異較大，丙酮和無水乙醇對水芫花的提取率較高，分別達11.92%和11.26%，蒸餾水次之，其次為氯仿和乙酸乙酯，石油醚提取率最低，提取率僅為2.11%。

2.2不同溶劑提取物的體外抗氧化活性2.2.1各提取物對DPPH自由基的清除作用

見圖1。

圖1　各提取物對DPPH自由基的清除作用

由圖1 可以看出，各溶劑提取物對DPPH 自由基的清除能力強弱不同，在實驗濃度范圍內，各提取物隨著濃度的增加，對DPPH自由基的清除能力也不斷增強，表現出較好的量效關系，其中乙醇提取物、丙酮提取物和乙酸乙酯提取物清除DPPH 自由基的能力較強和 VC相近，并且其濃度在達1.250mg·mL-1之前，對于DPPH 自由基的能力隨濃度變化較大，在濃度為1.250mg·mL-1~5.000mg·mL-1范圍內，對于DPPH 自由基的能力隨濃度略有變化但不明顯；石醚和氯仿提取物對于DPPH 自由基的能力較前面三者次之，且對于DPPH 自由基的能力隨濃度變化略微平緩，水提物清除DPPH 自由基的能力最差，隨濃度變化趨勢與石醚和氯仿提取物相近。

2.2.2各提取物對羥基自由基(·OH)的清除作用

見圖2。

圖2　各提取物對羥基自由基的清除作用

羥基自由基(·OH)是已知的最活潑的活性氧自由基，也是毒性最大的自由基，由圖2 可以看出，各溶劑提取物對羥基自由基(·OH)均有一定的清除作用，但與陽性對照Vc組相比差距較大，各提取隨濃度變化物對羥基自由基(·OH)清除率不斷增加，但變化趨勢并不是太明顯，尤其是蒸餾水提取物對羥基自由基(·OH)清除率隨濃度變化最為平緩，各提取物乙醇和丙酮提取物對羥基自由基(·OH)的清除作用最大，在實驗濃度范圍內分別達73.61%和69.23%，氯仿提取物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物次之，水提取物清除能力最差，最大僅為28.75%。

2.2.3各提取物對超氧陰離子自由基(O2-·)的清除作用

見圖3。

圖3各提取物對超氧陰離子自由基的清除作用

由圖3 可以看出，各溶劑提取物對超氧陰離子自由基(O2-·)均有一定的清除作用，但與VC相比有一定的差距，各溶劑提取物對超氧陰離子自由基(O2-·)的清除率與濃度存在一定的量效關系，且對超氧陰離子自由基(O2-·)清除率隨濃度變化趨勢及其相近，在濃度達1.250mg·mL-1前，對超氧陰離子自由基(O2-·)清除率隨濃度變化較大，之后變化趨勢較為平緩。

2.2.4各提取物的還原能力

見圖4。

圖4　各提取物的還原能力

由圖4 可以看出，各溶劑提取物隨濃度的不斷增加，還原力也顯著增強，表現出較好的量效關系，且各變化曲線較為分散，基本沒有出現變化曲線交叉或重疊現象，其中乙醇提取物和丙酮提取物還原能力最強，且隨濃度不斷增加，OD值變化較大，在濃度超過2.5mg·mL-1時 與VC的還原能力相差不大；乙酸乙酯提取物還原能力較前兩者次之，但還原能力隨濃度的變化趨勢與其相近，石油醚提取物、氯仿提取物、蒸餾水提取物還原能力隨濃度的變化趨勢交前面三者較為平緩；各溶劑提取物的還原能力大小依次為：乙醇提取物>丙酮提取物>乙酸乙酯提取物>石油醚提取物>氯仿提取物>水提取物。

2.3水芫花提取物抑菌活性

2.3.1提取物抑菌活性

圖5　水芫花系統(tǒng)溶劑萃取物對供試菌的抑菌圈直徑(n=3)

由圖5 可知，各提取物對3種供試菌均有一定的抑制作用，其中乙醇提取物、丙酮提取物對各供試菌的抑菌圈直徑最大；水提取物與乙酸乙酯提取物的抑菌圈次之；乙酸乙酯提取物對副溶血孤菌的抑菌圈直徑明顯強于對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用；石油醚提取物和氯仿提取物對各供試菌的抑菌圈直徑最小。

2.3.2不同提取物最低抑菌濃度(MIC)測定

見表2。

表2　最低抑菌濃度(MIC)測定結果(n=3，%)

注：- 表示沒有抑菌作用。

由表2 可知，各提取物的抑菌活性明顯小于陽性對照組，各提取物對三種供試菌的抑制作用，隨濃度的降低而降低，呈現良好的量效關系；同時可以看出，丙酮提取物、無水乙醇提取物對于大腸桿菌的最小抑菌濃度在6.250~3.125mg·mL-1，蒸餾水提取物對于大腸桿菌的最小抑菌濃度在6.250~3.125mg·mL-1；丙酮提取物對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度在6.250~3.125mg·mL-1，無水乙醇提取物對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度<1.563mg·mL-1,蒸餾水提取物對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度在3.125~1.563mg·mL-1；同理可以看出，丙酮提取物、無水乙醇提取物、蒸餾水提取物對副溶血孤菌的最小抑菌濃度分別為在3.125~1.563mg·mL-1、<1.563 mg·mL-1,<1.563mg·mL-1。

3討論

本文應用不同溶劑對水芫花進行系統(tǒng)提取，并對各提取物進行了體外抗氧化和體外抑菌活性研究，由實驗結果可知，各溶劑對水芫花的提取率順序依次為：丙酮提取>乙醇提取>蒸餾水提取>乙酸乙酯提取>氯仿提取>石油醚提??；各提取物的抗氧化能力均小于陽性對照品Vc的抗氧化能力，且綜合比較各提取物對DPPH自由基、羥基自由基(·OH)、超氧陰離子自由基(O2-·)及其還原能力，表明其抗氧化活性順序依次為：乙醇提取物>丙酮提取物>乙酸乙酯提取物>石油醚提取物>氯仿提取物>蒸餾水提取物；在抑菌活性實驗中，各提取物的抑菌活性順序為：丙酮提取物、乙醇提取物>蒸餾水提取物、乙酸乙酯提取物>氯仿提取物、石油醚提取物;丙酮提取物，乙醇提取物抑菌圈最大，其原因可能是其抑菌效果較好且極性較大在培養(yǎng)基中的擴散速度快，而蒸餾水提取物活性次之，其原因可能是盡管極性較大，擴散速度快，但抑菌活性稍弱于前面兩者，石油醚提取物和氯仿提取物對各供試菌的抑菌圈直徑最小，其原因可能是抑菌活性較低或因極性較小在培養(yǎng)基中擴散程度較低所致；在最低抑菌濃度(MIC)實驗中，雖然丙酮提取物、無水乙醇提取物對于大腸桿菌的最小抑菌濃度均在6.250～3.125mg·mL-1，但在6.250mg·mL-1時無水乙醇提取物明顯大于丙酮提取物對大腸桿菌的抑菌率，所以無水乙醇提取物最低抑菌濃度應該小于丙酮提取物的最低抑菌濃度。

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Vitro studies on antioxidant and antimicrobial activities of extracts from pemphis acidula

XUSheng-ying,GANJing-lu,ZHANGSang-sang,WENZheng-shun,QUYou-le

(The School of Food Science and Pharmacy, Zhejiang Ocean University, Zhou Shan 316000, China)

Abstract:Objective:To study the preliminary antioxidant and antimicrobial activities of extracts from Pemphis acidula. Methods: Pemphis acidula were successively extracted by using different solvents to provide petroleum ether extract, chloroform extract, ethyl acetate extract, acetone extract, ethanol extract, water extract. Different extracts on DPPH radical, hydroxyl radical, superoxide anion free radical scavenging ability and reducing power were analyzed, and it was compared with VC to evaluate its antioxidant activity and then antibacterial activity was performed by the methods of disk diffusion and spectrophotometric method. Result: The acetone extract was the highest to 11.92% and the petroleum ether extract had the lowest rate of only 2.11%. The order of antioxidant activity of the extracts: ethanol extract >acetone extract >ethyl acetate extract >petroleum ether extract >chloroform extract >water extract. The order of antibacterial activity: acetone extract, ethanol extract >water extract, ethyl acetate extract > chloroform extract, petroleum ether extract. Conclusion: Pemphis acidula extracts have the antioxidant activity and antibacterial activity.

Key words:pemphis acidula extracts; antioxidant activity; antibacterial activity; spectrophotometric method

(收稿日期：2015-10-20)

中圖分類號：R285.5

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0104(2016)01-0041-04

作者簡介：徐盛穎(1994～)女，浙江余姚人，在校本科生。通訊作者：曲有樂(1960～)男，黑龍江佳木斯人，學士，教授，碩士研究生導師。E-mail:YouLe1960@163.com。

基金項目：浙江省大學生科技創(chuàng)新項目，編號：2014R411015。