由昭陽(yáng)，楊　沙，田　樺，卓　越

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

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大鼠急性胰腺炎的免疫變化與Treg及IL-35表達(dá)的相關(guān)性①

由昭陽(yáng)，楊沙，田樺，卓越

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的：探討Treg及IL-35在大鼠急性胰腺炎模型中的變化及意義。方法：36只S-D大鼠分為正常組(6只)和AP組(30只)，后者結(jié)扎膽總管造模成功后分別在2、6、12、24、48h處死，每次6只大鼠。流式細(xì)胞儀測(cè)定外周血中CD4+CD25+T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的百分比，ELISA法測(cè)定血IL-35水平。胰腺損傷程度根據(jù)參照吳建新[6]等的方法進(jìn)行病理評(píng)分。結(jié)果：與對(duì)照組[(2.70±0.13)%]相比，AP各組Treg的比例在2、6，12、24、48h時(shí)明顯下降(P<0.05)。IL-35水平在2、6、12、24、48h明顯下降，與對(duì)照組(1.04±0.12pg/mL)相比,各組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相關(guān)性分析提示Treg百分比與IL-35水平呈明顯正相關(guān)。結(jié)論：大鼠急性胰腺炎模型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與IL-35水平均呈下降趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞：急性胰腺炎;免疫變化;Treg;IL-35

研究顯示AP病程中往往呈現(xiàn)免疫應(yīng)激與免疫抑制先后并存、交替失衡的病理生理改變。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)AP時(shí)外周血CD3+、CD4+T細(xì)胞數(shù)目及CD4+/CD8+比值下降，同時(shí)產(chǎn)生多種炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子引起機(jī)體免疫系統(tǒng)失衡，進(jìn)而感染增加，多器官臟器衰竭[1]。而免疫系統(tǒng)自身又具有一定的自我調(diào)節(jié)功能，Treg就是具有負(fù)向免疫調(diào)控作用的淋巴細(xì)胞亞群[2,3]。IL-35也可以直接或間接地發(fā)揮免疫抑制作用[4]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠急性胰腺炎模型，行胰腺病理學(xué)評(píng)分，檢測(cè)外周血Treg百分比及IL-35水平，初步探討急性胰腺炎早期大鼠Treg及IL-35的變化及可能作用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

S-D大鼠(n=36), 成年雄性，平均體重200g，佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2實(shí)驗(yàn)主要試劑及儀器

LX-200掌式離心機(jī)(海門(mén)市麒麟儀器廠),流式細(xì)胞分析儀 FACScalibur(美國(guó)BD公司)，CD4抗體、CD25抗體(金山橋公司)，大鼠白細(xì)胞介素35ELISA試劑盒(上海諾源公司),-80℃度超低溫冰箱(日本Sanyo 公司),YBL-2 生物組織包埋機(jī),HM-315 組織切片機(jī)。

1.3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽渑c標(biāo)本采集

1.3.1模型制備

本實(shí)驗(yàn)采用膽總管末端結(jié)扎法制備急性胰腺炎模型[5]，大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(6只)及AP組(30只),其中AP組在造模后2、6、12、24、48h處死，每次處死6只大鼠。方法：兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在同等條件下給予正常飼料和高溫滅菌自來(lái)水喂養(yǎng)，4周后，平均體重200g，實(shí)驗(yàn)前禁食12h(正常飲水),將水合氯醛等比稀釋后，向大鼠腹腔注射麻醉。將麻醉后的大鼠固定于手術(shù)臺(tái)上。皮膚消毒，沿腹正中線(xiàn)切開(kāi)直至腹部肌層，進(jìn)入腹腔，將皮膚及肌層牽向兩側(cè)。尋找大鼠的胃，沿胃下端十二指腸端尋找十二指腸大乳頭及膽總管末端，游離膽總管末端，用細(xì)線(xiàn)在膽總管末端結(jié)扎，關(guān)腹。正常組，正常飲食及飲水。根據(jù)胰腺水腫，白細(xì)胞浸潤(rùn)、出血和壞死程度病理評(píng)分，參照吳建新[6]等的方法評(píng)定造模是否成功。

1.3.2標(biāo)本收集

造模成功后的2h、6h、12h、24h、48h時(shí)大鼠下腔靜脈采血5mL存于真空抗凝管中3000r/min離心15min。取上清液置于-80℃凍存。取胰腺組織，在福爾馬林溶液中固定48h后常規(guī)石蠟包埋。對(duì)照組采用同樣方式處理。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1胰腺組織病理形態(tài)學(xué)觀察及評(píng)分

取胰腺組織置于福爾馬林中固定，經(jīng)過(guò)脫水、石蠟包埋透明和封片后，用蘇木素-伊紅染色，觀察胰腺病理改變。由佳木斯大學(xué)病理教研室病理醫(yī)師觀察切片。胰腺組織病理評(píng)分參照吳建新[6]等的方法。

1.4.2Treg百分比及IL-35水平測(cè)定

全血標(biāo)本在肝素抗凝下經(jīng)稀釋、破紅、洗滌及淋巴細(xì)胞分離后分別加CD4抗體和CD25抗體(中山金橋公司)，在試管中混勻，避光孵育20min后，將試管放入流式細(xì)胞儀，上機(jī)測(cè)定，CD4+CD25+的細(xì)胞為T(mén)reg，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

IL-35測(cè)定采用標(biāo)準(zhǔn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，抗體由上海諾源公司提供。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。

1．5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析將得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果表明其轉(zhuǎn)換值服從正態(tài)分布，利用方差分析進(jìn)行組間比較；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

血Treg及IL-35變化及其與病理評(píng)分相關(guān)性血Treg變化：各組Treg百分比平均水平在對(duì)照組為2.706%，而在AP各組均小于2%，在誘導(dǎo)AP后2 h時(shí)平均為1.735%，隨著時(shí)間推移，Treg水平有下降趨勢(shì)，到48 h達(dá)最低即0.744%。而統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示AP各組Treg水平均較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表1。Il-35變化：對(duì)照組為(1.04±0.12)pg/mL實(shí)驗(yàn)組2h(0.74±0.17)pg/mL，之后為下降趨勢(shì)，直至48h最低值(0.31±0.11)pg/mL且P<0.05,見(jiàn)表1。

病理評(píng)分：通過(guò)肉眼觀及光鏡下觀察，2h時(shí)最小值為3.23,至48h最大值為15.06，總體呈上升趨勢(shì)。外周血Treg與IL-35呈正相關(guān)(Pearson相關(guān)性=0.398, P<0.05),兩者與胰腺病理評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)(Pearson相關(guān)性=-0.869及-0.407, P均<0.05)。

表1　外周血Treg、IL-35水平及胰腺病理

注：與對(duì)照組相比，#P<0.05,*P<0.05,^P<0.05。

3討論

AP的發(fā)病是由多種機(jī)制共同作用的結(jié)果，其中免疫平衡失調(diào)占有重要地位。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組中Treg呈逐漸降低(P<0.05),相關(guān)性分析提示Treg對(duì)急性胰腺炎有顯著影響。既往研究表明，CD4+CD25+Treg細(xì)胞是具有免疫抑制作用的負(fù)向調(diào)控細(xì)胞，其免疫抑制作用有多種方式，其中最重要的方式是IL-2奪獲[7]。IL-2作用于T淋巴細(xì)胞，使其增殖，而Treg上的CD25為IL-2受體α鏈，能與效應(yīng)細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IL-2，Treg細(xì)胞消耗IL-2,導(dǎo)致IL-2這種細(xì)胞因子增殖緩慢，抑制了T細(xì)胞的迅速增長(zhǎng)，由于在急性胰腺炎的初始階段應(yīng)為促炎反應(yīng)占主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)，隨著疾病的發(fā)展，由促炎轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡祝M(jìn)而抑制免疫反應(yīng)，抑制IL-2的力度是逐漸降低的，相對(duì)應(yīng)的，T淋巴細(xì)胞的激活程度是逐漸升高的。這正與本實(shí)驗(yàn)Treg在實(shí)驗(yàn)組2h中所占淋巴細(xì)胞百分比最多，而隨著時(shí)間的推移，Treg所占百分比是下降的趨勢(shì)這一結(jié)果相符合。由此推測(cè)Treg所占百分比降低可能是急性胰腺炎早期免疫過(guò)度激活的機(jī)制之一。這與丁震[8]等研究結(jié)果類(lèi)似。但丁震等研究中Treg在6小時(shí)后出現(xiàn)顯著降低，這較遲于本實(shí)驗(yàn)的下降時(shí)間，考慮系本實(shí)驗(yàn)選取結(jié)扎膽總管的造模方式有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)隨著大鼠急性胰腺炎的進(jìn)展IL-35的含量是呈下降趨勢(shì)的(P<0.05),同時(shí)胰腺病理評(píng)分逐漸增高，相關(guān)性分析提示IL-35對(duì)急性胰腺炎有影響(P<0.05)。這也符合我們現(xiàn)階段對(duì)IL-35的認(rèn)識(shí)，有研究表明IL-35可通過(guò)抑制淋巴細(xì)胞增殖作用降低炎性細(xì)胞因子的表達(dá)[9，10]，表明其在炎癥過(guò)程中可能具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用,另外，另一種由外周CD4+CD25+Treg細(xì)胞激活形成的iTreg細(xì)胞可分泌IL-35，而IL-35反過(guò)來(lái)對(duì)iTreg有正反饋?zhàn)饔肹2]。在急性胰腺炎前期機(jī)體對(duì)于炎癥的保護(hù)性反饋?zhàn)饔?；至后期，機(jī)體釋放出大量的致炎性細(xì)胞因子，抑炎性細(xì)胞因子的表達(dá)受到抑制，故IL-35的表達(dá)水平出現(xiàn)明顯降低。

綜上所述，血清IL-35 和外周血Treg百分比在大鼠急性胰腺炎模型不同階段存在差異，可能在急性胰腺炎發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。大鼠急性胰腺炎IL-35 和Treg 細(xì)胞亞群的檢測(cè)，更能使我們正確、充分、全面地了解急性胰腺炎的發(fā)病機(jī)制和免疫變化，從而更有效地指導(dǎo)臨床治療。

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(收稿日期：2015-11-21)

中圖分類(lèi)號(hào)：R576

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0104(2016)01-0037-02

(作者簡(jiǎn)介：由昭陽(yáng)(1988～)女，黑龍江七臺(tái)河人，在讀碩士研究生。(通訊作者：田樺(1969～)女，黑龍江佳木斯人，雙學(xué)士,副主任藥師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:zhuoyuejsmu@126.com。

基金項(xiàng)目:1.佳木斯大學(xué)研究生創(chuàng)新科技課題，編號(hào):LM2015_025;2.黑龍江省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目，編號(hào)：H2015072。